桑黃裂蹄針層孔菌的發(fā)酵培養(yǎng)、化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展*

馬傳貴，張志秀，孫思勝，鐘耀強(qiáng)

（1.北京京誠生物科技有限公司，北京 大興 102600；2.許昌學(xué)院食品與藥學(xué)院河南省食品安全生物標(biāo)識快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 許昌 461000；3.馬來西亞國立衛(wèi)生院藥物研究所傳統(tǒng)藥物研究中心，馬來西亞 莎阿南 40170）

1 桑黃裂蹄針層孔菌簡介

裂蹄針層孔菌（Phellinus linteus，PL），寄生于?？瓢锥涓缮?，是最常使用的一種桑黃，主要分布于中國、日本、蒙古、韓國等亞洲國家以及美洲和非洲，還可以寄生于楊樹、柳樹、樺木等植物上[1]。作為一種優(yōu)良、珍貴的藥用真菌，被廣泛應(yīng)用于保健品中。

桑黃在中國、日本、韓國等國家使用歷史悠久。早在2 000年前的中國漢代，桑黃就記錄成為“桑耳”（桑樹的耳朵），《神農(nóng)本草經(jīng)》中記錄了其藥用價值[2]。在日本上個世紀(jì)初期，“meshimakobu”最早被記錄為Fomes yucatanensis或Fomes rimosus的標(biāo)本[3]，直到1943年，該物種才被命名為尤地針層孔菌（Phellinus yucatanensis） 或者裂蹄針層孔菌（Phellinus linteus）[4]。桑黃還被記錄用于止血和一些與女性月經(jīng)有關(guān)疾病的治療[5]。除此之外，《本草綱目》[6]《中醫(yī)字典》[7]等都記載了桑黃是一種利尿止血、改善內(nèi)臟的食用菌。2020年7月13日，國家衛(wèi)健委、國家中醫(yī)藥管理局首次將桑黃列入“中藥”行列，已通過權(quán)威專家及國家認(rèn)可，正式獲得中藥身份。根據(jù)長期的應(yīng)用和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，桑黃具有調(diào)節(jié)血糖、改善血液循環(huán)、保肝、增強(qiáng)免疫功能等多種藥理活性，并被試驗(yàn)證明具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化以及抗高血脂癥和抗糖尿病等活性作用[8-9]。

2 桑黃裂蹄針層孔菌的發(fā)酵培養(yǎng)

桑黃裂蹄針層孔菌是一種優(yōu)良的藥用菌，具有多種生物活性，在東亞地區(qū)得到廣泛應(yīng)用。對于桑黃產(chǎn)品的生產(chǎn)類型，主要有野生子實(shí)體、栽培子實(shí)體、液態(tài)發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵4種[10-12]。依據(jù)中經(jīng)視野咨詢公司對我國桑黃行業(yè)市場的預(yù)測分析報告發(fā)現(xiàn)，我國1995年～2002年野生桑樹桑黃年產(chǎn)量為2 t～3 t，當(dāng)時還有大量日本、韓國商人來華購買；在2003年～2012年產(chǎn)量處于1 t～2 t的低潮期；直到2013年由于新種發(fā)表產(chǎn)量才逐漸提升。預(yù)估今后新產(chǎn)地的發(fā)掘和開發(fā)、人工栽培的實(shí)現(xiàn)也會使其產(chǎn)量增長。

由于桑黃野生資源稀缺，人工栽培不成熟，通過發(fā)酵生產(chǎn)，既可以縮短培養(yǎng)周期，避免季節(jié)和環(huán)境的限制，又可以提升桑黃作為新藥開發(fā)的效率。當(dāng)前大量研究集中在對發(fā)酵條件的優(yōu)化，其中Lee等[13]通過固體培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在乳糖濃度為29.7 g·L-1、溫度26.2℃、pH 5.2的條件下，菌絲的最快生長速率為2.80 mm·d-1。丁興紅等[14]以桑黃多糖產(chǎn)量為參考指標(biāo)，篩選適宜的發(fā)酵條件，得出其發(fā)酵最佳碳源和氮源分別為葡萄糖和大豆蛋白胨，最佳接種量為6%，初始pH為6.0，適宜溫度28℃，轉(zhuǎn)速180 r·min-1。此外還發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵瓶中加入數(shù)粒玻璃珠，可以促進(jìn)菌絲的分散、分裂和增殖。

除上述物理因素外，植物激素和化學(xué)成分有利于菌絲的生長和多糖的生物合成。Lee等[15]通過對培養(yǎng)基的優(yōu)化，提出了桑黃發(fā)酵的最佳配方為果糖40 g·L-1、酵母抽提物 20 g·L-1、FeCl2·6H2O 0.01 g·L-1、K2HPO40.46 g·L-1、KH2PO41.00 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.50 g·L-1、MnCl2·4H2O 0.036 g·L-1、ZnCl20.03 g·L-1和CuSO4·5H2O 0.005 g·L-1。而Wang等[16]的優(yōu)化配方為葡萄糖 51.67 g·L-1、蛋白胨 6.96 g·L-1、酵母提取物 1.0 g·L-1、硫酸胺 5 mg·L-1、K2HPO41.0 g·L-1和MgSO40.5 g·L-1。此外，有研究發(fā)現(xiàn)添加適量的萘乙酸、吲哚-3-乙酸、NaCl會影響桑黃形態(tài)和多糖的積累和生成[17]。雖然這些研究對桑黃的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，但在實(shí)際栽培生產(chǎn)中，必須選擇合適的培養(yǎng)條件以滿足大規(guī)模生產(chǎn)桑黃的需求。

3 化學(xué)成分

3.1 多糖

在桑黃裂蹄針層孔菌子實(shí)體中，多糖是其主要成分，以雜多糖為主，其中甘露糖、半乳糖、果糖、木糖是子實(shí)體中的主要多糖，這些多糖大多為水溶性[18]。Kim等[19]用DEAE纖維素陰離子色譜法從桑黃中分離出一種酸性蛋白多糖，經(jīng)Sepharose CL-4B凝膠過濾后得到其分子量，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)蛋白多糖由72.2%多糖和22.3%蛋白質(zhì)組成，多糖部分主要包括甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖，蛋白質(zhì)部分含有大量的谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸。另有研究發(fā)現(xiàn)與子實(shí)體相比，桑黃菌絲體中蛋白質(zhì)、飽和脂肪酸、多糖、還原糖、總糖和氨基酸含量較高[20]。桑黃菌絲體和發(fā)酵液中的主要化學(xué)成分也是多糖，但與子實(shí)體中的多糖不同。Hwang等[21]從桑黃kctc6190深層培養(yǎng)液中分離出3種胞外多糖，主要由半乳糖和葡萄糖組成。

3.2 黃酮、吡喃酮和呋喃

當(dāng)前，從桑黃裂蹄針層孔菌中共分離出35種黃酮類、吡喃酮類和呋喃類化合物。其中，4種黃酮類化合物包括黃柏屬A類、B類化合物和米昔馬考酚A、B（1～4），15種吡喃酮類化合物包括黃綠二聚體A、黃芩苷A～J、黃芩苷C、黃芩素B1和B2（5～19），5種呋喃類化合物包括黃褐屬A和B、黃柏黃酮A和B類化合物[22]。莫順燕等[23]首次從桑黃中分離出柚皮素、櫻花苷、芳香苷元、葉綠素、燈盞花苷、燈盞花素等7種黃酮類化合物；并分離出芐基化二氫黃酮類化合物，黃芩素A和黃芩苷B，分別鑒定為5，7，4′-三羥基-6-O-羥基芐基二氫黃酮和5，7，4′-三羥基-8-鄰羥基苯二氫黃酮。除此之外，吡喃酮A以及苯丙氨酸A和苯丙氨酸B等新的呋喃成分也被報道出來[24]。

3.3 其他化學(xué)成分

部分研究還從桑黃裂蹄針層孔菌中分離獲得其他成分。Samchai等[25]研究了桑黃裂蹄針層孔菌的二氯甲烷部分，并根據(jù)NMR光譜分析和質(zhì)譜數(shù)據(jù)闡明了2種吲哚衍生物，包括7-甲氧基吲哚-3-羧酸甲酯和1-甲基吲哚-3-甲醛。此外，還發(fā)現(xiàn)了阿魏酸、丁香酚、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸、微量元素、茶堿、環(huán)二肽、氨基酸等。

4 生物活性

4.1 抗腫瘤活性

抗腫瘤被認(rèn)為是桑黃最重要的生物活性，大量的藥理試驗(yàn)證實(shí)桑黃是一種有效的抗癌藥物。1968年，Ikekaw等[26]首次發(fā)現(xiàn)桑黃裂蹄針層孔菌子實(shí)體提取物對小鼠肉瘤細(xì)胞（S180）有明顯的抑制作用，抑制率為96.7%。大量研究表明，抗肝癌作用是其最重要的抗腫瘤活性之一。Wang等[27]發(fā)現(xiàn)桑黃多糖對人肝癌細(xì)胞HepG2有良好的抑制作用，濃度為0～1.0 mg·mL-1的桑黃多糖可顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，抑制率達(dá)50%，且呈劑量和時間依賴性。桑黃多糖不僅能抑制肝癌細(xì)胞的生長，而且還能感染黑色素瘤細(xì)胞。Zhou等[28]將桑黃（40 g·kg-1d-1、200 g·kg-1d-1、1 000 g·kg-1d-1）提取物分別灌胃C57BL/6小鼠H22（肝細(xì)胞癌） 和B16（黑色素瘤）細(xì)胞，觀察其抗癌作用。最終發(fā)現(xiàn)經(jīng)桑黃處理的H22細(xì)胞和B16細(xì)胞的細(xì)胞因子、IL-12和TNF-α水平均高于未處理組，且CD4+T細(xì)胞和CD4+、CD8+水平與劑量呈正相關(guān)。半個多世紀(jì)以來，中國、日本、韓國等國也開展了一些其他的抗腫瘤研究。根據(jù)研究和公開資料，發(fā)現(xiàn)桑黃多糖除具有上述活性外，還具有多種抗腫瘤活性，包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌[29-31]。

4.2 抗氧化活性

桑黃及其組分表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，可用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病的治療。Jung等[32]從桑黃菌絲體培養(yǎng)液中分離篩選出具有抗氧化活性的多種化學(xué)成分，采用反相高效液相色譜法對成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了幾個具有強(qiáng)大自由基清除活性的峰，根據(jù)光譜分析純化并鑒定了4種主要活性物質(zhì)，分別為 hispidin及其二聚體、3，14′-bihispidinyl、hypholomine B 和 1，1-distyrylpyrylethan，且這些物質(zhì)都以濃度依賴的方式對自由基表現(xiàn)出顯著的清除活性。Wang等[33]從桑黃菌絲體中提取了3種部分純化的多糖（PL-W、PL-A和PL-N），發(fā)現(xiàn)其以濃度依賴的方式表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除自由基能力和抗氧化活性。除此之外，體外試驗(yàn)也表明多糖具有很強(qiáng)的抗氧化活性，包括對超氧陰離子、羥基和DPPH自由基的還原能力和清除能力[34]。

4.3 免疫調(diào)節(jié)活性

桑黃裂蹄針層孔菌是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑。1996年初，Kim等[35]從桑黃菌絲體培養(yǎng)物中純化出一種多糖，并在體外（100 mg·kg-1）和體內(nèi)（0.01 mg·mL-1～0.10 mg·mL-1） 觀察其免疫調(diào)節(jié)作用。發(fā)現(xiàn)桑黃多糖不僅能刺激混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，從而誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和對同種抗原反應(yīng)的細(xì)胞毒性，而且能調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴性和非T細(xì)胞依賴性一級抗體反應(yīng)，對B細(xì)胞起多克隆激活作用，T細(xì)胞可提高自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的非特異性免疫功能。另外，研究還發(fā)現(xiàn)從桑黃中提取的一種新的多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物刺激B細(xì)胞增殖比未刺激時高8倍，但T細(xì)胞不受影響；且提取物和LPS以相似的方式作用于B細(xì)胞，但提取物誘導(dǎo)的細(xì)胞活化不受多粘菌素B（LPS的特異性抑制劑） 的抑制[36]。此外，Kozarski等[37]發(fā)現(xiàn)32.6 pg·mL-1的桑黃子實(shí)體多糖對活化的人外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）和IFN-γ的合成具有免疫抑制作用。

4.4 降血糖活性

早期研究發(fā)現(xiàn)，從桑黃裂蹄針層孔菌菌絲體培養(yǎng)物中純化的多糖可抑制雌性非糖尿病小鼠自身免疫性糖尿病的發(fā)生。8周齡～24周齡雌性非糖尿病小鼠每隔1 d給予30 mg·kg-1多糖進(jìn)行治療，可預(yù)防自身免疫性糖尿病的發(fā)生、發(fā)展和免疫細(xì)胞向胰島的浸潤，并抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[38]。桑黃多糖也被證明通過阻止β細(xì)胞在糖尿病中的活性氧毒性作用而顯示出抗糖尿病的功能，其在抑制過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和增加過氧化氫處理細(xì)胞的胰島素分泌方面表現(xiàn)出相似性[39]。除此之外，大量研究發(fā)現(xiàn)桑黃降低了血糖和血清胰島素水平，并抑制了糖尿病患者的α-葡萄糖苷酶活性[40-41]。在血糖調(diào)節(jié)方面，已有證據(jù)表明，具有一定構(gòu)象的活性多糖可通過提高胰島素敏感性、丙酮酸激酶（PK）和己糖激酶 （HK） 活性以及磷酸化磷酸肌醇 3激酶（PI3K） 的表達(dá)，在一定程度上緩解胰島素信號傳導(dǎo)缺陷[42]。

4.5 其他生物活性

在我國古代中醫(yī)臨床實(shí)踐中桑黃被廣泛應(yīng)用于治療血液病。桑黃裂蹄針層孔菌除了具有上述活性外，還發(fā)現(xiàn)具有抗病毒，抗誘導(dǎo)突變以及改善肝功能等多種功能。

5 總結(jié)與展望

桑黃裂蹄針層孔菌在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖和抗炎等方面具有突出的活性功能。因此，有必要進(jìn)一步發(fā)掘和闡明桑黃傳統(tǒng)用途與現(xiàn)代藥理活性之間的關(guān)系，闡明抗腫瘤作用與其他藥理作用之間的關(guān)系。與此同時，盡管現(xiàn)代桑黃的體內(nèi)外藥理研究作用已經(jīng)非常深入和豐富，但在臨床探索方面的研究還不夠充分。除此之外，需要對桑黃裂蹄針層孔菌加工以及其主要成分的提取方法等進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)定，研發(fā)相關(guān)新藥和新食品，提供多樣的桑黃產(chǎn)品。