基于Notch信號通路對腦梗死的保護機制研究進展*

馬菡 ，李晶

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸研究所，天津 300193；2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心，天津 300193）

Notch信號通路是脊椎動物和非脊椎動物跨膜、進化保守的細胞間信號通路[1]。Notch通路的多個組成部分在血管系統(tǒng)中表達，缺乏這些組成部分的小鼠表現(xiàn)出胚胎致死性和血管重塑缺陷[2]。有研究表明，Notch通路的激活可能對腦梗死缺血后的神經(jīng)血管單元具有一定調節(jié)和控制作用，在腦梗死的病程中起到多重腦保護作用[3]。本文對Notch信號通路的調節(jié)過程及其在腦梗死中的促進血管新生及調節(jié)神經(jīng)功能的相關研究綜述如下。

1 Notch信號通路概述

1.1 Notch信號通路的構成與傳導 Notch信號通路由Notch受體、Notch配體及細胞內效應器分子3個部分組成。在哺乳動物中，已經(jīng)描述有4種Notch蛋白受體：Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，Notch 配體由 Jagged（JAG1 和 JAG2）和 Delta-like（DLL1、DLL3、DLL4）基因家族編碼，細胞內效應分子是Notch信號在核內活化的轉錄因子[4]。

Notch信號是由細胞間直接相互作用介導的，這種相互作用有助于Notch配體Delta或Jagged與相應細胞上的Notch受體之間的結合，觸發(fā)受體的3次連續(xù)蛋白水解。S1分裂：在弗林蛋白（Furin）轉化酶的作用下產生胞外區(qū)和跨膜片段2個亞基，在細胞膜表面形成非共價連接的Notch異二聚體受體[5]。S2分裂：與配體結合后，由TNF-α-轉化酶（TACE）和解聚素金屬蛋白酶（ADAM17）進行的蛋白水解酶裂解為胞外區(qū)的N端裂解產物和跨膜區(qū)的C端裂解產物[6]。S3分裂：C端裂解產物在γ-分泌酶的作用下第3次被剪切，并將Notch胞內結構域（NICD）釋放到胞漿中[7]。NICD進入細胞核，與轉錄因子相互作用形成轉錄激活復合物，激活下游靶基因轉錄，這種信號機制被認為是典型的Notch通路[8-9]。

1.2 Notch信號通路在大腦生理功能中的作用

1.2.1 維持神經(jīng)干細胞增殖分化 Notch信號通路與調控神經(jīng)干細胞的分化與自我更新密切相關，使神經(jīng)干細胞的增殖與分化維持在相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。早老素1（PS1）是調控Notch信號活性的關鍵因子，在缺乏PS1的胚胎腦中，神經(jīng)干細胞也會衰竭，僅存的神經(jīng)干細胞自我更新能力較弱，而NICD的引入挽救了神經(jīng)干細胞的自我更新能力[10-11]。Hes1是Notch信號中重要的下游效應分子，Hes1缺失的神經(jīng)干細胞會過早分化為神經(jīng)元，導致神經(jīng)干細胞的減少或消耗從而引發(fā)腦發(fā)育障礙[12]。由此可見，對于維持神經(jīng)干細胞的增殖和分化來說，Notch信號通路廣泛參與其中并扮演重要角色。

1.2.2 Notch信號與膠質細胞生成 神經(jīng)膠質細胞廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，Notch信號能促進膠質細胞的產生，如視網(wǎng)膜中的Müller膠質細胞、新皮質中的放射狀膠質細胞和海馬中的星形膠質細胞[13]。Gaiano等[14]在神經(jīng)發(fā)育前的胚胎皮層中將激活的Notch1（NIC）引入小鼠前腦。在胚胎發(fā)育過程中，NIC感染的細胞變?yōu)榉派錉钅z質細胞，這是前腦中第1個明顯的特殊細胞類型。出生后，許多NIC感染的細胞變成腦室周圍的星形膠質細胞，這些細胞以前被證明是成人的神經(jīng)干細胞。這些結果提示Notch1在胚胎發(fā)育過程中促進了橈神經(jīng)膠質細胞的識別。綜上可見，Notch信號參與膠質細胞的活化過程，對膠質細胞的發(fā)育有十分重要的作用。

1.2.3 參與神經(jīng)元遷徙 神經(jīng)元遷移是大腦發(fā)育的一個基本組成部分，絡絲蛋白（Reelin）是大腦皮層發(fā)育過程中神經(jīng)定位的關鍵。Hashimoto等[15]發(fā)現(xiàn)Reelin基因缺陷小鼠的NICD裂解形式水平降低，遷移神經(jīng)元中Notch信號的丟失導致遷移神經(jīng)元的板層和形態(tài)異常；NICD的過量表達則減輕了Reelin基因缺陷小鼠由于遷移失敗而導致的皮質神經(jīng)元異常層疊。也有證據(jù)表明，在果蠅的研究中存在一種非果蠅促神經(jīng)發(fā)生基因Su（H）介導的Notch信號通路，利用Abl信號成分促進軸突生長和引導。具體來說，Notch似乎與DAB基因和Abl途徑效應器Trio相互作用，并通過調節(jié)生長錐來指導軸突生長導向和動態(tài)模式形成[16]。這與DAB1和Notch1之間的相互作用是一致的，該相互作用發(fā)生在大腦皮層發(fā)育的新皮質神經(jīng)元遷移期間[15]。

2 Notch信號通路在腦梗死中的保護作用

腦梗死是一種常見的臨床疾病，由腦缺血和缺氧引起的神經(jīng)元變性和壞死往往會導致嚴重的神經(jīng)功能缺損。恢復受影響區(qū)域的血液供應是缺血性腦梗死治療的關鍵，它不僅可以挽救缺血半暗帶中瀕臨死亡的神經(jīng)元，還可以為內源性干細胞和移植干細胞的存活、增殖、分化和功能重塑提供必要的條件，使其恢復神經(jīng)功能。研究表明在右側雙結扎頸總動脈的新生小鼠中，Notch2受體在同側海馬的顆粒層和錐體層表達強烈增加，Notch通路的下游效應基因Hes5在缺血后的海馬中也上調，表明缺血損傷后，Notch信號通路可能被激活[17]。隨后的研究證實，腦梗死后，Notch信號通路在促進血管新生、促進神經(jīng)干細胞增殖及減輕炎癥反應方面起著重要作用。

2.1 促進血管新生 血管新生可以在缺血性腦損傷后迅速發(fā)生，以達到修復組織損傷、改善神經(jīng)功能恢復的目的。血管新生受多種因素調控，Notch信號通路可能在腦梗死后血管生成過程起重要作用。Lou等[18]發(fā)現(xiàn)Notch1信號分子在成年大鼠缺血腦皮質中顯著上調，其中miRNA-210的表達也增加。使用miRNA-210重組慢病毒載體轉染人臍靜脈血管內皮細胞HUVE-12結果顯示，miRNA-210過表達導致Notch1蛋白表達顯著增加，進一步增強了內皮細胞遷移形成毛細血管樣結構。這些研究表明，miRNA-210的上調可激活Notch信號通路，可能是調控缺血皮質誘導血管生成的分子基礎。Alhajzen等[19]通過小鼠缺血模型的研究發(fā)現(xiàn)，Notch配體DLL4在正常灌注的微血管內皮細胞中表達較弱，而缺血后在發(fā)芽的毛細血管最前端表達增強。DLL4-Notch信號通過干預血管分支形態(tài)發(fā)生來調節(jié)側支血管的形成。DLL4還通過干預動脈功能和結構來影響血管灌注，其信號激活在再灌注期間血管分支的重組中非常重要[20]。大腦中動脈閉塞（MCAO）模型大鼠中，缺血皮質Notch1和Hes1的表達增強，缺血性腦組織在腦梗死后可觀察到中度代償性血管生成，骨髓基質細胞（MSCs）移植后梗死區(qū)周圍的內皮細胞明顯增多，缺血皮質Notch1陽性內皮細胞數(shù)量和Notch1蛋白水平顯著增加，并顯著提高了Hes1 mRNA水平，表明MSCs移植通過激活缺血腦組織內皮細胞的Notch信號通路促進血管生成[21]。隨后在人腦梗死樣本中發(fā)現(xiàn)，與正常腦相比，梗死腦缺血區(qū)內皮細胞中Notch1、NICD及配體jagged1的表達明顯增加，Hes1蛋白在內皮細胞核中表達增加。人缺血性腦梗死周圍區(qū)的腦血管長度、體積、面積、血管終末部分、血管節(jié)段和血管分支部分均明顯高于正常腦。進一步建立MCAO模型大鼠發(fā)現(xiàn)，梗死區(qū)腦血管內Notch1、NICD和Hes1的蛋白水平在第3天和第7天顯著增加，血管面積和長度隨著時間推移明顯增多。Notch1基因敲除抑制了內皮細胞的增殖，減少了腦血管的面積和長度，表明Notch信號在腦缺血誘導的血管生成中起關鍵作用[22]。

2.2 促進神經(jīng)干細胞增殖 神經(jīng)干細胞在成年嚙齒動物和人腦中主要分布在側腦室下區(qū)（SVZ）和海馬齒狀回的顆粒下區(qū)（SGZ），正常情況下，神經(jīng)干細胞處于靜息狀態(tài)，腦梗死或其他誘因下，神經(jīng)干細胞可被激活并增殖分化，由此產生的新生細胞遷移到缺血受損的腦區(qū)[23]。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)腦缺血后在SVZ細胞中也表達出Notch1的激活形式及其下游轉錄靶點Hes1，Notch1信號的激活增加了SVZ細胞的增殖，從而抑制Notch1信號則導致SVZ細胞增殖減少。局灶性腦缺血后4 h和24 h，SVZ內NICD、Hes1和音猬因子（SHH）水平升高，缺血誘導的SVZ細胞增殖被Notch1信號通路的抑制所阻斷。體外研究表明，用針對Notch的siRNA或γ-分泌酶抑制劑可阻斷Notch信號通路，從而抑制腦缺血增加的神經(jīng)干細胞的自我更新。通過注射Notch配體DLL4激活Notch通路可以減少神經(jīng)干細胞死亡進而促進缺血大腦中的神經(jīng)發(fā)生[25]。進一步用DLL4和NICD對腦切片進行染色發(fā)現(xiàn)，在SVZ內NICD+細胞常常與DLL4+細胞相鄰，神經(jīng)干細胞通過DLL4/Notch信號向臨近細胞發(fā)出信號，DLL4的上調導致相鄰神經(jīng)干細胞中Notch信號的增強，誘導他們增殖和分化為新的神經(jīng)元[26]。這些結果表明Notch信號通路通過增強腦梗死后神經(jīng)干細胞增殖進一步恢復神經(jīng)系統(tǒng)的受損功能。

2.3 減輕炎癥反應 腦缺血后1～2 d內，缺血區(qū)產生的白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子將激活腦血管內皮細胞表達黏附分子，介導內皮細胞與白細胞的相互作用，使白細胞浸潤缺血腦組織。缺血區(qū)白細胞浸潤可激活小膠質細胞，激活的小膠質細胞將促進炎癥因子的表達，進一步加重腦損傷。Notch1表達上調可抑制小膠質細胞活化，降低IL-1β、TNF-α等細胞因子的表達，從而減輕腦缺血后的炎癥反應[27]。在腦損傷的早期階段，梗死區(qū)反應性星形膠質細胞的出現(xiàn)可通過維持修復血腦屏障和減少免疫細胞浸潤來限制細胞退化。Hu等[28]發(fā)現(xiàn)Notch1及其配體Jagged1參與腦缺血后星形膠質細胞活化的調控，Jagged1通過誘導有利于神經(jīng)前體細胞向星形膠質細胞分化的基因表達來激活Notch通路。Shimada等[29]發(fā)現(xiàn)Notch1是卒中后梗死周圍區(qū)域星形膠質細胞反應性增殖所必需的關鍵因子，并且增殖的反應性星形膠質細胞可能通過減少免疫細胞對梗死周圍組織的侵襲而在腦卒中后保護大腦方面發(fā)揮特殊的作用。

3 針刺對Notch信號通路的作用

針刺療法在臨床治療腦梗死方面具有廣泛應用，通過調控Notch信號通路改善腦梗死后神經(jīng)功能損傷也得到了越來越多的研究支持。在腦缺血/再灌注損傷大鼠模型中，電針百會、大椎可以明顯提高缺血側海馬區(qū)Notch1表達，改善模型大鼠神經(jīng)缺損癥狀。Notch1蛋白表達及神經(jīng)干細胞含量在14 d達到峰值，表明電針百會、大椎可以通過維持Notch1表達，使神經(jīng)干細胞維持高水平，為神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化提供充足的細胞來源[30]。惠建榮等[31]對局灶性腦缺血大鼠進行電針外關、陽陵泉，發(fā)現(xiàn)大鼠缺血側海馬區(qū)Jagged1蛋白含量表達明顯增加，電針可促進星形膠質細胞分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過修復神經(jīng)元并促進其再生來促進神經(jīng)功能恢復。電針曲池、足三里穴同樣可以通過調控Notch信號通路對腦缺血損傷大鼠發(fā)揮腦保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，對腦缺血損傷大鼠連續(xù)7 d電針曲池、足三里可活化大鼠缺血周圍區(qū)皮質、缺血側室管膜下區(qū)Notch1信號轉導通路，上調活化NICD蛋白，激活Hes1和Hes5的表達，從而促進缺血損傷后神經(jīng)干細胞增殖，減少神經(jīng)凋亡和抑制炎癥反應[32]，同時促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，實現(xiàn)對腦缺血的治療作用[33]。連續(xù)14 d電針干預可明顯縮小腦梗死面積，改善神經(jīng)元細胞結構及形態(tài)[34]。最新研究表明，microRNA-25可減少腦缺血再灌注損傷誘導的細胞凋亡，促進神經(jīng)干細胞的增殖，miRNA-223靶點人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）的表達會減弱海馬神經(jīng)元的再生能力。電針外關、足三里可促進Notch1介導miRNAs的激活并抑制PTEN的表達，誘導SVZ和海馬組織神經(jīng)干細胞增殖并抑制其凋亡，促進缺血腦組織功能修復[35]。針刺療法對腦梗死的療效確切，通過調控Notch信號通路可促進神經(jīng)元增殖、遷移和分化，減少神經(jīng)凋亡，抑制炎癥反應，改善神經(jīng)缺損癥狀，減少梗死面積，從而促進腦缺血后的神經(jīng)功能恢復。

4 中醫(yī)藥對Notch信號通路的作用

研究表明，中國腦梗死患病率為7.9%，其中缺血性腦梗死占91.7%[36]。中醫(yī)認為腦梗死屬于中風范疇，多由過度勞累、起居不節(jié)引起的氣機逆亂，瘀血阻滯腦脈而成，病位多與肝、脾、腎相關[37]。中風病機多由風、火、痰、瘀所累，眾多中醫(yī)研究者經(jīng)過大量臨床經(jīng)驗積累，總結其治法以祛痰開竅，活血祛瘀為主?，F(xiàn)代藥理學研究表明，祛風活血類中藥對缺血性腦梗死有顯著的療效。Guan等[38]利用蛇床子提取物蛇床子素干預大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型，證明其可增強Notch1信號轉導活性，降低缺血再灌注誘導的腦梗死，降低海馬神經(jīng)元損傷和細胞凋亡。燈盞花作為祛風活血常用中藥，在臨床中得到廣泛應用。Yuan等[39]發(fā)現(xiàn)燈盞花有效成分燈盞乙素可明顯抑制Notch-1、NICD和Hes1在活化小膠質細胞中的表達，并且降低了單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）的表達，增加小膠質細胞的黏附能力，減少小膠質細胞的遷移。另外，相關研究表明應用中藥單體干預Notch信號通路在治療缺血性腦梗死方面有著不遜于西藥的效果[40]，從分子機制方面證明了中藥的安全性和有效性。補陽還五湯在改善中風后遺癥、降低致殘率等方面發(fā)揮至關重要的作用，其補氣活血通絡的功效可能與Notch通路的激活有關。周勝強等[41]發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯能促進腦缺血小鼠缺血側海馬Notch1、Hes1 mRNA和蛋白的表達及NICD的釋放，激發(fā)Notch通路活性以進一步促進缺血海馬神經(jīng)干細胞增殖來修復受損神經(jīng)功能。王俊杰等[42]對腦缺血再灌注大鼠注射地黃飲子低、中、高3種劑量，連續(xù)給藥28 d后發(fā)現(xiàn)中劑量及高劑量組大鼠Jagged1、Hes1 mRNA水平明顯增加，神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質細胞增生，腦組織可見壞死灶相比模型組明顯減少，提示地黃飲子作為中藥復方通過激活Notch信號通路加速腦缺血后的神經(jīng)再生和修復，參與調控腦缺血再灌注損傷發(fā)生的多個環(huán)節(jié)。中醫(yī)藥通過調控Notch信號通路展現(xiàn)了顯著的療效，為臨床研究治療缺血性腦梗死提供了客觀證據(jù)支持。

5 展望

缺血性腦卒中后，缺血和缺氧會導致大量神經(jīng)元的變性和壞死，立即誘導缺血腦組織血管生成、恢復腦血流灌注及最大限度挽救可逆性神經(jīng)元對缺血性卒中的治療至關重要。近年來對Notch信號通路的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些Notch通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和腦梗死缺血后血管新生及神經(jīng)發(fā)生中的重要作用。在腦梗死臨床治療中，針刺療法及中醫(yī)藥對腦梗死的治療顯示出獨特的優(yōu)勢，通過激活Notch信號通路有助于改善腦梗死患者預后。然而腦梗死是一個極其復雜的病理過程，進一步研究并闡明Notch信號通路促進腦梗死缺血區(qū)血管新生及調控神經(jīng)發(fā)生的具體機制，對于腦卒中后保護神經(jīng)血管單元及改善卒中預后都有重要意義。