蛋白激酶C在疼痛及鎮(zhèn)痛藥物作用中的研究進(jìn)展*

易小清，崔小嬌，陳祝君，尹琪楠，茍夢秋，邊原

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院/電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部·個體化藥物治療四川省重點實驗室，成都 610072)

疼痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，按病理生理學(xué)機(jī)制主要分為傷害感受性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛兩種類型；按發(fā)病持續(xù)時間分為急性疼痛和慢性疼痛。疼痛臨床表現(xiàn)多樣，全球范圍內(nèi)經(jīng)受不同程度疼痛折磨的人數(shù)高達(dá)15億人以上，而疼痛治療效果的影響因素眾多。對于很多頑固性疼痛會反復(fù)發(fā)作，極難治愈，是十分棘手的臨床問題，使用鎮(zhèn)痛藥物后疼痛緩解程度不一。疼痛控制不佳會給患者造成極大的身心痛苦，導(dǎo)致患者身體衰弱和生活質(zhì)量下降。

蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的總稱，由相對分子質(zhì)量為77～83 ku的多肽單鏈構(gòu)成。目前為止已經(jīng)至少鑒定出10種PKC亞型，分為 A、B、C 3 組，A組稱為典型或傳統(tǒng)的PKC(conventional PKC，cPKCs)，包括 α、βI、βⅡ和γ亞類。B 組為新型PKC(novel PKC，nPKCs)，包括 δ、ε、η(L)和θ亞 類，C組為非典型 PKC(atypical PKC，aPKCs)，由ζ和λ亞類組成。其各種亞型參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、有絲分裂、炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞內(nèi)病理生理功能調(diào)控。PKC作為一種胞內(nèi)第二信使，在神經(jīng)元興奮性的調(diào)制、信號傳導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸可塑性等中起到相關(guān)作用，同時有研究發(fā)現(xiàn)，PKC在疼痛傳導(dǎo)中起重要作用。PKC家族在疼痛調(diào)節(jié)中具有同工酶特異性作用[1]。

臨床常用的鎮(zhèn)痛藥物包括非甾體抗炎藥、阿片類藥物、抗驚厥類藥物等。針對不同的疼痛類型及疼痛程度，選擇的鎮(zhèn)痛藥物有所不同。對于神經(jīng)病理性疼痛，鈣離子通道調(diào)節(jié)劑加巴噴丁、普瑞巴林是一線推薦治療藥物。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)三階梯鎮(zhèn)痛治療原則，輕度疼痛可選用非甾體類抗炎藥物；中度疼痛可選用弱阿片類藥物或低劑量的強(qiáng)阿片類藥物，并可聯(lián)合應(yīng)用非甾體類抗炎藥物以及輔助鎮(zhèn)痛藥物；重度疼痛首選強(qiáng)阿片類藥，并可合用非甾體類抗炎藥物以及輔助鎮(zhèn)痛藥物。通過規(guī)范、有效的治療，患者疼痛可以得以緩解，但仍有部分患者的疼痛難以控制，僅通過常規(guī)的藥物治療效果不滿意和(或)出現(xiàn)不能耐受的不良反應(yīng)，成為醫(yī)生、患者共同面臨的棘手問題。有研究表明PKC與鎮(zhèn)痛藥物之間存在相互影響，因此PKC有望成為疼痛治療的分子靶標(biāo)。

1 PKC在不同疼痛中的研究

1.1鐮狀細(xì)胞病 鐮狀細(xì)胞病(sickle cell disease，SCD)又稱鐮狀細(xì)胞性貧血癥(sickle cell anemia)，這是一種遺傳性疾病，患者的紅細(xì)胞形狀出現(xiàn)異常，呈鐮刀狀或者新月狀，會導(dǎo)致血管內(nèi)血液流動不暢，血氧傳輸受限，引起嚴(yán)重的疼痛和器官損傷。疼痛是SCD的最典型特征，患有SCD的患者在其一生中都經(jīng)歷著無法預(yù)測的反復(fù)發(fā)作的急性疼痛危機(jī)以及慢性持續(xù)疼痛[2]。疼痛可能始于嬰兒期，并在整個生命中嚴(yán)重程度增加，從而導(dǎo)致住院和生活質(zhì)量下降[3]。PKC各亞型PKCε、PKCα、PKCγ、PKCδ在SCD中均有研究報道，其中研究最多的是PKCδ[2]。在TOW小鼠中，通過分析PKCδ質(zhì)-膜易位，在脊髓背角淺層中PKCδ的活化升高。脊髓PKCδ的過度活化僅在γ-氨基丁酸能神經(jīng)元的抑制性神經(jīng)元(GABAergic neuron，VGAT+)中發(fā)生，而在谷氨酸能興奮性神經(jīng)元(glutamatergic，VGLUT2+)中不發(fā)生。由于PKC激活可能會抑制GABA轉(zhuǎn)運活性，因此PKCδ可能會通過抑制GABA的抑制性機(jī)制而促進(jìn)SCD的慢性疼痛[4]。通過造血干細(xì)胞移植方法(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)，建立了受體PKCδ-KO和WT小鼠典型的血液學(xué)缺陷和SCD的系統(tǒng)性體征，在缺乏PKCδ的小鼠中未檢測到自發(fā)性疼痛或誘發(fā)性疼痛，這強(qiáng)烈表明，脊髓PKCδ是SCD中持續(xù)性和誘發(fā)性疼痛的產(chǎn)生和維持的關(guān)鍵機(jī)制[2]。

1.2椎間盤退變 椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)易導(dǎo)致退行性椎間盤突出癥，如腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥和椎間盤下腰痛等。大量的臨床和基礎(chǔ)研究表明，降鈣素可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，刺激Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，防止軟骨退變。在建立大鼠尾椎間盤退變模型中，IL-1通過降低蛋白激酶C-ε磷酸化而增加PKC-δ磷酸化來誘導(dǎo)髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cell，NPC)變化。降鈣素治療可以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)IL-1誘導(dǎo)的與變性相關(guān)的PKC信號傳導(dǎo)的細(xì)胞變化，證實了降鈣素對體內(nèi)IVDD的積極作用?？偠灾@項研究首次闡明了降鈣素在調(diào)節(jié)椎間盤核中基質(zhì)成分中的重要作用，且降鈣素可通過激活PKC-ε途徑和抑制PKC-δ途徑來延緩椎間盤核的變性[5]。

1.3慢性偏頭痛 偏頭痛是常見的慢性神經(jīng)血管疾病，是一種突發(fā)性、多發(fā)性且具備著偏側(cè)性、中重度的頭痛病癥。證據(jù)表明一氧化氮(NO)可能是偏頭痛發(fā)病的一個致病因素，Western blotting實驗顯示，硝酸甘油(nitroglycerin，NTG)和硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)NO供體給藥后，硬腦膜內(nèi)蛋白激酶Cγ和蛋白激酶Cε表達(dá)上調(diào)，磷酸化程度增加。此外，PKC阻滯劑可阻止NTG和SNP誘導(dǎo)的疼痛超敏反應(yīng)。NTG可以增加蛋白激酶 Cα，γ，δ和ε 的磷酸化水平，而丙戊酸(Valproate，VP)抑制了PKC亞型的活性，證明VP是通過抑制NTG小鼠中的PKC信號傳導(dǎo)來防止偏頭痛造成的損害[6]。代謝型谷氨酸受體5(metabotropic glutamate receptor 5，mGluR5)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性中起著至關(guān)重要的作用，mGluR5可通過PKC/NR2B信號調(diào)節(jié)偏頭痛中的突觸可塑性來促進(jìn)中樞敏化[7]。也有研究顯示PKCγ誘導(dǎo)的谷氨酸受體(Glutamate receptor，GluR1)磷酸化可能參與偏頭痛大鼠模型的中樞敏化[8]。

1.4炎癥性疼痛 炎癥時，感受器(C纖維)可逐漸被激活，表現(xiàn)出對機(jī)械性刺激敏感，致使炎癥部位更易產(chǎn)生痛感。通過在大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)構(gòu)建慢性膝關(guān)節(jié)炎癥模型，發(fā)現(xiàn)PKCα的信使核糖核酸和蛋白質(zhì)表達(dá)平行增加，而背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中蛋白激酶C可能是通過上調(diào)了電壓門控鈉通道NaV1.9的表達(dá)，從而導(dǎo)致疼痛超敏[9]。瞬時受體電位香草酸1型(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)是一種處理熱和化學(xué)敏感傷害信息的主要受體，在外周背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中TRPV1-PKCα和PKCε表達(dá)不同，得出的結(jié)論是PKCs通過增強(qiáng)TRPV1的活性引起炎癥疼痛[10]。向大鼠的后爪連續(xù)反復(fù)注射前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)14 d構(gòu)建慢性炎癥性模型，抑制PKCε可減少持續(xù)性炎性傷害性感覺，其機(jī)制可能與抑制NF-κB p65亞基易位有關(guān)[11]。炎癥性面部機(jī)械性痛覺異常的發(fā)展需要激活MDH-PKCγ和5-HT2AR，并與IIi層的形態(tài)和功能變化有關(guān)。在功能上，PKCγ+和PKCγ-中間神經(jīng)元均顯示靜息膜電位(resting membrane potential，RMP)去極化和Rm降低；形態(tài)學(xué)上，只有PKCγ+中間神經(jīng)元的樹突復(fù)雜性降低，脊柱密度增加，依賴于5-HT2AR的激活。直接激活MDH-5-HT2AR可引起與周圍CFA相同的面部機(jī)械性超敏反應(yīng)和PKCγ+中間神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變。這表明，一旦PKCγ+中間神經(jīng)元經(jīng)歷了5-HT2AR依賴的結(jié)構(gòu)動力學(xué)，低閾值機(jī)械輸入可以進(jìn)入淺表MDH/SDH的痛覺傳導(dǎo)通路，觸發(fā)機(jī)械性痛覺超敏[12]。

1.5癌性骨痛 癌性骨痛是所有癌性疼痛中最常見的癥狀，是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌及甲狀腺癌等骨轉(zhuǎn)移引起的骨破壞性骨痛，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量并造成沉重的心理負(fù)擔(dān)。在采用脛骨骨髓腔內(nèi)注射3 μL MRMT-1大鼠乳腺癌細(xì)胞建立骨癌痛模型，與假骨癌痛組比較，骨癌痛組藍(lán)斑核PKCα蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但骨癌痛組大鼠p-PKCα蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)[13]。有研究將Walker 256細(xì)胞接種至脛骨中可誘導(dǎo)出明顯的機(jī)械性疼痛超敏反應(yīng)，從接種后第6天到第15天，脊髓趨化因子CC亞族受體5(Spinal chemokine CC receptor 5，CCR5)和p-PKCγ表達(dá)上調(diào)，推測RANTES-CCR5-PKCγ通路可能通過脊髓內(nèi)神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用參與癌性骨痛(cancer-induced bone pain，CIBP)的維持[14]。PENG等[15]在癌性骨痛模型中，PKC磷酸化增加，首次發(fā)現(xiàn)PKC/ERK信號通路在調(diào)節(jié)癌性骨痛中的功能，通過抑制PKC/ERK信號通路，可增加縮爪閾值，減輕癌性骨痛。研究顯示鞘內(nèi)注射PKC抑制劑后，脊髓神經(jīng)元PKC激活和高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB1)釋放以及癌性骨痛大鼠機(jī)械性痛覺超敏均減弱，最終發(fā)現(xiàn)表明骨癌相關(guān)的痛覺過敏是由PKC誘導(dǎo)的HMGB1磷酸化驅(qū)動的，這導(dǎo)致HMGB1從細(xì)胞核移位，從背角的細(xì)胞質(zhì)中釋放出來，并激活脊髓促炎遞質(zhì)[16]。

1.6神經(jīng)病理性疼痛 神經(jīng)病理性疼痛是感覺神經(jīng)系統(tǒng)病變引起的一種慢性疾病，常在神經(jīng)和脊髓損傷或疾病后出現(xiàn)，臨床常見的有糖尿病神經(jīng)病理性疼痛、帶狀皰疹及帶狀皰疹后神經(jīng)病理性疼痛、癌性神經(jīng)病理性疼痛等。PKC作為胞內(nèi)的第二信使，廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是外周和中樞敏化的主要調(diào)節(jié)因子。瞬時受體電位褪黑素8(transient receptor potential melastatin 8，TRPM8)通道在痛覺傳導(dǎo)的敏化過程中起著重要作用，被認(rèn)為是治療神經(jīng)病理性疼痛的潛在靶點之一，在背根神經(jīng)節(jié)中TRPM8通道參與了神經(jīng)病理性疼痛大鼠冷、熱痛覺過敏(非機(jī)械性痛覺超敏)的發(fā)生，其機(jī)制可能受PKC的調(diào)控[17]。鞘內(nèi)注射PKC或PKA抑制劑可增強(qiáng)TREK-1活化劑在神經(jīng)病變大鼠中觀察到的抗痛覺超敏作用。相反，用PKC或PKA激活劑預(yù)處理可降低TREK-1活化劑誘導(dǎo)的抗痛覺超敏反應(yīng)。數(shù)據(jù)表明，體內(nèi)PKC/PKA可以動態(tài)調(diào)節(jié)TREK-1通道的活性，從而引起痛覺超敏，調(diào)節(jié)其在神經(jīng)病理性疼痛中的抗痛覺超敏作用[18]。神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制還可能與PKC促進(jìn)某些炎癥因子、離子通道、氨基酸受體、P2X受體、sigma-1受體等的表達(dá)或激活有關(guān)。

2 PKC與藥物的作用

2.1阿片類藥物 嗎啡的鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)，是癌性中、重度疼痛治療的首選藥物之一，同時也可用于其他鎮(zhèn)痛治療無效的急性銳痛。長期使用嗎啡類阿片藥物易形成嗎啡耐受，其表現(xiàn)為嗎啡鎮(zhèn)痛效應(yīng)減弱，需加大用藥劑量才能達(dá)到相同的效果。在阿片耐受產(chǎn)生的過程中PKC主要通過其含量或活性的變化參與信息的傳遞。長期應(yīng)用阿片類藥物致使脊髓背角淺層(Ⅰ或Ⅱ?qū)?PKC的蛋白表達(dá)增加、PKC活性升高。而應(yīng)用PKC抑制劑卻能抑制PKC活性的增強(qiáng)，阻止或翻轉(zhuǎn)嗎啡耐受的形成和發(fā)展。PKC亞型較多，其中PKCα、γ和ε亞型參與了嗎啡耐受。研究提示，MRgC的慢性激活通過PKC信號通路上調(diào)傷害性遞質(zhì)的表達(dá)，從而降低嗎啡的鎮(zhèn)痛效果[19]。長期嗎啡暴露可顯著增加背根節(jié)P2X3R、PKCε磷酸化的表達(dá)，而抑制PKCε信號通路可減輕嗎啡誘導(dǎo)的耐受性[20]。

瑞芬太尼為芬太尼類μ型阿片受體激動劑，起效快，維持時間短，與其他芬太尼類似物明顯不同。靜脈內(nèi)輸注瑞芬太尼可以誘導(dǎo)成年大鼠機(jī)械和熱痛覺過敏，而PKC抑制劑可以抑制這種痛覺過敏，同時也證實了PKC/CaMKII/ERK對瑞芬太尼刺激后體外胚胎DH神經(jīng)元的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)磷酸化和NMDA功能的影響[21]。PKC活性的升高是阿片受體脫敏及耐受形成的重要原因，而PKC抑制劑可明顯消除或減輕阿片耐受的產(chǎn)生。因此選擇性的抑制或阻斷PKC上、下游的傳導(dǎo)通路或PKC本身都是減輕或消除阿片耐受的重要手段，有望成為治療阿片耐受的一個新途徑。

2.2非甾體抗炎藥物 非甾體抗炎藥(non steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是一類具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的藥物，廣泛用于疼痛治療，如癌痛的第一階梯治療及癌性中、重度疼痛的輔助治療，風(fēng)濕類疼痛的治療以及骨科疼痛治療等。對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中前列腺素的合成達(dá)到鎮(zhèn)痛作用，無抗炎作用，臨床主要用于普通感冒或流行性感冒引起的發(fā)熱，以及緩解輕、中度疼痛，但其有肝毒性，可導(dǎo)致致命性或非致命性肝壞死。APAP處理后可導(dǎo)致PKCa移位到線粒體，并使線粒體PKC底物磷酸化，并且敲除PKCa對APAP誘導(dǎo)的肝損傷也有保護(hù)作用。研究顯示可通過增強(qiáng)PKC途徑的核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear erythroid related factor-2，Nrf-2)來預(yù)防APAP引起的肝損傷[22]。

根據(jù)對COX-l和COX-2抑制強(qiáng)度的不同，NSAIDs可以分為非選擇性NSAIDs和選擇性COX-2抑制劑。塞來昔布是第一個選擇性COX-2抑制劑，其引起胃腸道不良反應(yīng)概率明顯降低。在小鼠皮膚炎癥模型中，局部應(yīng)用塞來昔布可以降低水腫、增生、前列腺素E2水平，其機(jī)制可能是塞來昔布通過抑制PKC同工酶(α，ε，γ)易位達(dá)到的[23]。帕瑞昔布為首個注射用選擇性COX-2抑制劑，對9例穩(wěn)定的肝硬化患者進(jìn)行了肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)篩查，帕瑞昔布在HPS患者血清的刺激下顯著抑制了人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMVECs)的定向集體遷移。此外，HPS患者血清顯著上調(diào)了PKC的磷酸化，并通過COX-2/PGE2信號通路促進(jìn)了Rac的激活，結(jié)果表明，由COX-2誘導(dǎo)的PKC/Rac信號傳導(dǎo)可在HPS患者的病理性肺血管生成過程中調(diào)節(jié)HPMVEC的集體方向性遷移[24]。

2.3抗驚厥藥 加巴噴丁(gabapentin，GBP)、普瑞巴林都是鈣離子通道調(diào)節(jié)劑，作用機(jī)制為調(diào)節(jié)電壓門控鈣通道α2-δ亞基，可減輕疼痛，用于癌性疼痛的輔助治療，是神經(jīng)病理性疼痛的一線推薦用藥。有研究在大鼠結(jié)腸內(nèi)注射福爾馬林以產(chǎn)生結(jié)腸炎疼痛，結(jié)果表明，腹膜內(nèi)注射GBP后，大鼠的內(nèi)臟疼痛程度有所減輕，而通過鞘內(nèi)注射PKC抑制劑也可以減輕疼痛，研究得出結(jié)論的是GBP對內(nèi)臟炎癥性疼痛的鎮(zhèn)痛作用是通過抑制PKC信號通路來介導(dǎo)的[25]。在部分切斷眶下神經(jīng)的小鼠模型(partial transection of the infraorbital nerve，pT-ION)中，引起原發(fā)性(V2皮膚)和繼發(fā)性(V3皮膚)痛覺過敏，Cavα2δ1拮抗劑加巴噴丁可逆轉(zhuǎn)這種痛覺過敏，pT-ION誘導(dǎo)PKC表達(dá)增加，但被靶向Cavα2δ1的干擾RNA逆轉(zhuǎn)，因此認(rèn)為Cavα2δ1通過其下游的PKC-TRPA/GJ信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)了繼發(fā)性痛覺過敏的發(fā)展[26]。普瑞巴林與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中α2-δ有高度親和力，利用雙電極電壓鉗技術(shù)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)了主要的神經(jīng)元谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白3(neuronal glutamate transporter type 3，EAAT3)，普瑞巴林可以增加EAAT3的活性，而PKC抑制劑預(yù)處理卵母細(xì)胞可顯著降低普瑞巴林增強(qiáng)的EAAT3活性[27]。

3 小結(jié)與展望

疼痛是臨床上最常見的癥狀之一，如果疼痛長時間不能有效控制，持續(xù)進(jìn)展會逐漸影響患者的睡眠、情緒及社會活動。不同疾病引起疼痛的作用通路不同，本文闡述了PKC不同亞型參與在各類型疼痛中，通過整合多種受體通道產(chǎn)生效應(yīng)，增強(qiáng)興奮性信號通路并減少抑制性信號通路，從而引起疼痛。同時也闡述了PKC與阿片類藥物、非甾體類抗炎藥物、抗驚厥藥等鎮(zhèn)痛藥物之間的相互作用、相互影響。

隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于遺傳性疾病的研究和病原體的檢測，腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)、診斷和治療等方面的研究也提高到了基因分子水平。引起疼痛的原因多樣，機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明晰其具體機(jī)制，PKC在疼痛中的研究在逐漸增多，需進(jìn)一步的研究和探討，明確PKC在疼痛中的作用機(jī)制，以期成為治療疼痛一個重要靶點。臨床實踐中疼痛治療藥物種類有限，PKC與常用鎮(zhèn)痛藥物之間存在相互作用、相互影響，并且多項研究已經(jīng)證實PKC抑制劑可減輕嗎啡誘導(dǎo)的耐受性，通過進(jìn)一步的研究和探討以期開發(fā)出鎮(zhèn)痛效果好、不良反應(yīng)更小的鎮(zhèn)痛藥物。