新型感染標(biāo)志物在膿毒癥早期診斷中的應(yīng)用及研究進展

張 晨，孫虹佳

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科,蘭州730000)

2020 年中國膿毒癥早期預(yù)防與阻斷急診專家共識指出膿毒癥(sepsis)是感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致危及生命的器官功能損害癥候群，是一種高病死率的臨床綜合征[1]。膿毒癥是目前醫(yī)學(xué)界面臨的重大難題與挑戰(zhàn)，盡管多年來臨床醫(yī)生對膿毒癥采用各種積極救治措施，但其發(fā)病率和死亡率仍居高不下。有研究表明近十年膿毒癥發(fā)生率為437/10 萬，病死率為17%；嚴重膿毒癥發(fā)生率為年270/10 萬，病死率為26%[2]。感染是膿毒癥發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)，大部分患者并發(fā)來自肺部、腹腔、泌尿道或皮膚黏膜的單一或混合菌的感染[3]，其中以血流感染最為嚴重和危急。2017年美國重癥醫(yī)學(xué)會（SCCM）與歐洲重癥醫(yī)學(xué)會（ESICM）頒布的膿毒癥2016年指南推薦在膿毒癥診斷1 h 內(nèi)立即使用抗生素治療以殺滅病原菌控制患者病情，及時使用抗生素對于改善預(yù)后具有重要意義[4]。目前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍是血培養(yǎng)，但是血培養(yǎng)需時長，培養(yǎng)及鑒定通常需要3～5 天的時間，且膿毒癥患者早期癥狀多不明顯，病情進展迅速，極易錯過最佳治療時間。因此，臨床迫切需要能夠快速、準(zhǔn)確診斷早期膿毒癥的實驗室指標(biāo)以指導(dǎo)臨床抗生素治療。

有研究表明，細菌進入血液循環(huán)后能分泌具有明顯促炎活性的代謝產(chǎn)物，引起多種炎性介質(zhì)的分泌、合成及釋放。這些產(chǎn)物的釋放可以進一步加重免疫細胞的耗竭，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)崩潰，導(dǎo)致個別介質(zhì)的升高或降低。除此之外，還會通過中性粒細胞等炎性細胞生成的自由基來激活氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]。因此，膿毒癥病程中部分炎性介質(zhì)和氧化應(yīng)激介質(zhì)會不同程度的增高或降低，即可作為早期膿毒癥的診斷指標(biāo)[6],如血清降鈣素原(PCT)、可溶性髓樣細胞觸發(fā)受體-1（sTREM-1）、肝素結(jié)合蛋白（HBP）、丙二醛（MDA）、高級氧化蛋白產(chǎn)物（AOPPs）、氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等，且隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)直接鑒定病原菌也是目前研究的方向和重點[7]。本文就上述指標(biāo)及方法在急診膿毒癥早期診斷中的研究進展綜述如下。

1 血清降鈣素原(PCT)

PCT 是在細菌內(nèi)毒素刺激下由多種實質(zhì)細胞合成和分泌的降鈣素前體，由116個氨基酸組成，是一種無激素活性的糖蛋白，也是臨床常用的炎性指標(biāo)[8]。20 世紀80年代，有研究者在研究急性肺損傷(acute lung injury，ALI)標(biāo)志物時偶然發(fā)現(xiàn)膿毒癥及感染性休克患者多伴有血清降鈣素原(PCT)明顯升高，人們猜測PCT 與感染之間存在一定聯(lián)系。1993年，法國學(xué)者Asscot 首次發(fā)現(xiàn)PCT 可在嚴重細菌感染時出現(xiàn)顯著升高[9]，機體受到細菌感染2～4 h 后PCT 水平開始升高，8～24 h 達到高峰，可持續(xù)數(shù)天至數(shù)周。已有研究表明，血流感染時血清中PCT 濃度與患者病情嚴重程度可呈正相關(guān)。當(dāng)PCT 為0.1～0.25ng/ml 時，提示細菌感染的可能性較小，PCT 為0.25～0.5ng/ml 時，可能存在需要治療的細菌感染，當(dāng)濃度大于0.5ng/ml 時，患者有發(fā)展成嚴重膿毒癥甚至膿毒性休克的風(fēng)險，而當(dāng)PCT 濃度達1.0ng/ml 時，其診斷膿毒癥的敏感度為80.3%，特異度為72.2%[10]。同時也有研究發(fā)現(xiàn)PCT 水平可用于鑒別診斷膿毒癥與其它全身炎癥反應(yīng)綜合征及評估膿毒癥的嚴重程度[11]。由于PCT能夠快速、靈敏地反映機體炎癥變化情況，近年來已作為一種較為敏感的炎癥標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。

細菌性感染中又以革蘭陽性菌和革蘭陰性菌感染最為多見，但兩種類型的病原菌致病能力不同，細菌對宿主感染致病能力取決于其侵襲力、毒素、體內(nèi)誘生抗原和超抗原等毒力的大小[12]不同，兩種類型血流感染的抗菌治療方案選擇也截然不同，因此在早期診斷膿毒癥的同時區(qū)分細菌感染類型也尤為重要。已有研究者發(fā)現(xiàn)革蘭陰性組的血清PCT水平入院后24 h，3天、7天均高于革蘭陽性組[13]，這是由于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌細胞膜的主要成分不同，革蘭陽性菌主要膜成分是肽聚糖（PGN），而革蘭陰性菌的主要膜成分是脂多糖（LPS），在先天免疫應(yīng)答中模式識別受體（PRRs）可以識別LPS 和PGN 作為病原體相關(guān)的分子模式（PAMPs），并啟動不同信號通路誘導(dǎo)促炎細胞因子的釋放[14]。

近年來真菌感染引發(fā)膿毒癥的發(fā)病率及死亡率呈明顯上升趨勢，其中非白色念珠菌屬引起的侵襲性真菌感染有增多的趨勢，已有研究發(fā)現(xiàn)PCT 在真菌血流感染組和局部真菌感染組均高于對照組，并與疾病的嚴重程度呈正相關(guān)，提示PCT 在診斷早期真菌性膿毒癥方面也有一定的參考價值[15]。

2 可溶性髓樣細胞觸發(fā)受體-1(sTREM-1)

sTREM-1 是免疫球蛋白超家族TREM-1 的可溶性形式，也稱為可溶性髓樣細胞觸發(fā)受體，是髓細胞表面表達的免疫球蛋白，能夠激活多種髓樣細胞并啟動炎癥反應(yīng),其在非感染性炎癥疾病中存在極低[16]。在感染發(fā)生時，sTREM-1 大量分泌并釋放入血或其他體液中，可以誘導(dǎo)中性粒細胞脫粒、驅(qū)動巨噬細胞炎癥蛋白-1（MIP-1）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白細胞介素-8（IL-8）等促炎因子的釋放，并可以促進患者體內(nèi)下游IL-6 或者IL-10 等細胞炎癥因子改變并加重單核細胞或巨噬細胞等炎癥細胞對于膿毒癥患者重要內(nèi)臟器官的損傷[17]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，sTREM-1水平在膿毒癥患者的血清中明顯高于對照組，提示sTREM-1在感染性疾病的診斷中具有高度的靈敏度和特異度[18]。也有研究發(fā)現(xiàn)，sTREM-1 對于兒童膿毒癥的早期診斷也有臨床意義，研究中新生兒膿毒癥組sTREM-1平均水平明顯高于對照組，sTREM-1 區(qū)分截點為69.8ng/L,敏感度為96.7%,特異度為86.7%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為83.9%和92.9%[19]。

3 肝素結(jié)合蛋白（HBP）

HBP 主要存在于中性粒細胞的分泌顆粒和嗜天青顆粒中，又稱為天青殺素。HBP 可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的通透性，并對單核/巨噬細胞等產(chǎn)生趨化作用，釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和γ-干擾素（IFN-γ），通過產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)形成“炎性因子風(fēng)暴效應(yīng)”[20]。健康人血液中HBP含量較低，當(dāng)細菌及其毒素侵入血液循環(huán)中，中性粒細胞被大量激活并釋放HBP，血液中其含量升高。有研究表明HBP 在膿毒癥早期72 h 內(nèi)就顯著升高，并存在較寬的窗口期，對膿毒癥有很好的診斷效能，適合作為膿毒癥早期預(yù)測指標(biāo)[21]。還有研究對比了膿毒癥患者治療前后的肝素結(jié)合蛋白檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)治療后HBP 較治療前降低，提示患者的治療有效。研究結(jié)果還顯示，治療后大部分嚴重膿毒癥與膿毒癥休克患者的病情得到控制，分級轉(zhuǎn)為一般膿毒癥[22]。

4 氧化應(yīng)激介質(zhì)

4.1 丙二醛（MDA）和高級氧化蛋白產(chǎn)物（AOPPs）MDA 和AOPPs 是細胞中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等與自由基氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。當(dāng)機體發(fā)生膿毒癥時，體內(nèi)大量炎性因子進入到血液循環(huán)中，氧化應(yīng)激過程加劇，促使氧代謝產(chǎn)物MDA，AOPPs 等過度生成，其中MDA 是氧自由基損傷脂質(zhì)后再與細胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)后生成的產(chǎn)物，可以間接反映膿毒癥患者的氧化損傷程度[23]。而AOPPs 是由脂質(zhì)氧化而成，其體內(nèi)濃度可以有效地反映組織細胞損傷的嚴重程度?？傊琈DA 和AOPPs 的檢測可以反映一段時間內(nèi)患者體內(nèi)的氧自由基含量，如果兩者生成增多則說明氧化應(yīng)激反應(yīng)被激活，細胞結(jié)構(gòu)受到自由基的攻擊增多[24]。

4.2 超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）SOD和CAT 是體內(nèi)具有抗氧化作用的催化酶。膿毒癥時，激活的炎癥細胞能夠產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)(ROS),體內(nèi)大量聚集的ROS 導(dǎo)致細胞發(fā)生氧化損傷。而SOD 是抗氧化劑，能將自由基還原為過氧化氫，特異性清除體內(nèi)的ROS，減輕自由基對細胞膜的損傷程度，此時體內(nèi)的SOD 被大量消耗，已有研究表明SOD 的濃度可以有效地反映出機體抵抗酶類氧化的能力[25]，同時其濃度的降低程度與器官的受損程度相關(guān)[26]。CAT 是過氧化氫酶，能使體內(nèi)的過氧化氫還原為水，與SOD 共同作用使自由基被還原并清除[27]。

也有研究表明革蘭陰性菌感染患者血清中氧化應(yīng)激介質(zhì)的升高或降低較革蘭陽性菌感染患者更為顯著[28]，但其在血清中的含量能否區(qū)別革蘭陽性菌和革蘭陰性菌感染仍是目前的研究趨勢。

5 病原菌鑒定基因

對于細菌引起的膿毒癥，快速準(zhǔn)確地鑒定病原菌是診斷和治療的根本。隨著分子生物學(xué)和基因診斷技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)檢測也為膿毒癥的早期診斷提供了新的思路。相對于生化反應(yīng)而言病原菌的基因組更穩(wěn)定，通過基因擴增及其后續(xù)技術(shù)可準(zhǔn)確、快速地檢測出病原菌。

5.1 16S 核糖體核糖核酸( 16S ribosomal Ribonucleic Acid，16S rRNA) 16S rRNA 基因是細菌染色體中編碼為16S rRNA 的對應(yīng)DNA 序列，是細菌等原核生物特有的RNA[29]，具有高度的保守性，不同種屬細菌的16S rRNA 基因同源性較高，能夠達到90%以上，在細菌鑒定中發(fā)揮著重要的作用[30]。通過16S rRNA的基因PCR擴增，進而對擴增產(chǎn)物分析，便能夠?qū)Ω腥镜牟≡M行早期判斷。有研究者對80例疑似膿毒癥患者血培養(yǎng)檢測結(jié)果與16S rRNA 的PCR 檢測結(jié)果進行分析比對得出后者的陽性率為41.25% ，明顯高于血液標(biāo)本培養(yǎng)陽性結(jié)果，表明PCR 檢測16S rRNA 基因在鑒別細菌感染疾病方面具有較高的陽性率，且受抗生素的影響較小[31]。但由于某些細菌種間差異較小，16S rRNA 基因的分辨力有限。

5.2 16S～23S 核糖體核糖核酸 ( 16S～23S Ribosomal Ribonucleic Acid，16S～23S rRNA) 現(xiàn)有研究者通過16S～23S rRNA 基因進行病原菌的鑒定，16S～23S rRNA 基因是位于16S rRNA基因與23S rRNA基因之間的區(qū)間序列，具有高度變異及相對保守性，不同種屬細菌16S～23S rRNA 區(qū)間的拷貝數(shù)、長度和堿基序列存在差異，具有種特異性，因此可用于細菌菌種間的鑒別，可作為很好的分子靶標(biāo)[32]。但有研究者通過對16S rRNA 的研究得出結(jié)論，在血流感染時，病原菌的拷貝數(shù)并不高，無法直接分析患者血液標(biāo)本中的rRNA 基因，仍需要將血培養(yǎng)標(biāo)本進行純培養(yǎng)后進行分析，所以此種方法能否在膿毒癥早期即鑒定出病原菌以指導(dǎo)臨床抗生素應(yīng)用仍有待進一步研究[33]。

綜上所述，急診膿毒癥患者病情危急、死亡率高，進行早期診斷及合理抗生素治療對于提高患者生存率及改善預(yù)后有極大的意義，必須給予高度重視。上述血清炎性介質(zhì)、氧化應(yīng)激介質(zhì)及分子生物學(xué)方法在膿毒癥早期的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展及預(yù)后評估中都具有重要的診斷價值，臨床醫(yī)生可選擇某一指標(biāo)或多個指標(biāo)聯(lián)合檢測對膿毒癥進行早期診斷。但由于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌所致膿毒癥抗生素治療方案不同，仍需通過大量研究找到其水平能夠明確區(qū)分病原菌類型的生物介質(zhì)，或者找到介質(zhì)水平變化能夠?qū)χ委熢\斷及預(yù)后評價進行指導(dǎo)的生物介質(zhì)。此外，16S～23S rRNA 基因的檢測能夠準(zhǔn)確鑒定出病原菌，但是由于檢測成本、檢驗時限等原因尚未大量應(yīng)用于臨床，如果能夠提高檢測技術(shù)水平，直接對患者血清標(biāo)本進行鑒定，則可以縮短24～48 h的細菌培養(yǎng)時間，極大程度地為臨床提供治療依據(jù)，指導(dǎo)抗菌藥物治療。