霉菌毒素對腸道黏膜屏障功能影響的研究進展

張 曼，霍 軍，王 軍，張利衛(wèi)，彭永帥，李月勤，宋予震，金 鑫

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)藥學院，河南鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河南鄭州 450046）

腸道是調(diào)節(jié)營養(yǎng)和水分攝入并排除潛在病原體和有毒物質的第一個物理屏障。研究顯示，腸黏膜上皮細胞層對于維持物理、化學和免疫學屏障功能至關重要，其可以阻止病原體、毒素和外源抗原等有害物質的進入（Constantinescu 等，2016），并且其結構中的黏附連接（AJs）和橋粒主要負責相鄰細胞的物理連接，而緊密連接（TJ）能夠控制細胞的間隙并選擇性的調(diào)節(jié)細胞旁離子溶質運輸。此外，研究還發(fā)現(xiàn)位于腸上皮細胞上方的腸道菌群能夠代謝各種飲食底物，并有助于發(fā)酵無法通過近端消化吸收的雜多糖（Jandhyala 等，2015）。另外，腸黏膜上皮細胞還可以通過多種防御機制保護宿主免受感染。因此，一旦畜禽腸黏膜屏障功能失調(diào)，不僅會引起腸道炎癥，而且會大大增加黏膜下層與外源性化學物質和病原體的接觸機會。

霉菌毒素是由絲狀真菌或霉菌在谷物的生長、收獲、儲存和加工過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其主要包括脫氧雪腐烯醇（DON）、黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、曲霉毒素A（OTA）、T-2 毒素和伏馬菌素B（FBs）。這些代謝物是動物飲食中常見的天然生物污染物，它們廣泛存在于飼料原料和畜禽飼料中。而腸道是霉菌毒素攻擊的首要靶標，畜禽一旦攝入被污染的食物或飼料后不僅會改變腸上皮的形態(tài)和結構，降低跨上皮電阻（TEER）和減少緊密連接蛋白的表達，其還會降低黏蛋白的表達并改變腸道菌群的豐度和結構（Huang 等，2019；Gao 等，2017）。更令人擔憂的是，在人體血液或母乳樣品中也檢測出霉菌毒素的污染（Yang 等，2020），提示霉菌毒素有通過動物性食品向人群傳播的可能，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全。因此，本文主要針對霉菌毒素對腸道黏膜物理、化學、免疫和生物學屏障功能的影響進行了總結，旨在為該領域的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 霉菌毒素對腸黏膜物理屏障功能的影響

腸黏膜物理屏障主要由腸上皮細胞和緊密連接蛋白組成，該屏障功能不僅是保護腸道免受病原體或有害物質侵襲腸道黏膜的關鍵，而且還為保持腸道上皮的選擇滲透性奠定了結構基礎。腸上皮細胞具有快速增殖和再生能力，可維持腸黏膜物理屏障功能。研究表明，霉菌毒素可通過破壞腸上皮的形態(tài)和組織完整性來破壞腸黏膜的物理屏障功能。例如，用DON 處理離體培養(yǎng)的豬空腸組織將會導致腸絨毛變短、腸細胞裂解和水腫（Silva 等，2014）。此外，用AFB1飼喂雞后發(fā)現(xiàn)，腸絨毛頂端壞死、絨毛萎縮、線粒體空泡化和消失，以及杯狀細胞數(shù)量明顯減少（Wang 等，2018）。

緊密連接在上皮細胞的附著，在維持上皮細胞結構和生物學功能中起重要作用，其中TEER、腸黏膜通透性和緊密連接蛋白的表達是反映細胞間緊密連接程度的重要指標。研究發(fā)現(xiàn)，DON 可降低豬回腸中Claudin、Occludin 和波形蛋白的基因表達（Lessard 等，2015）。Diesing 等（2011）研究發(fā) 現(xiàn)，將2000 ng/mL DON 作用于IPEC-1 和IPEC-J2 后，緊密連接蛋白ZO-1 的表達下降，并且腸物理屏障的完整性也遭到破壞。此外，體外Caco-2 細胞試驗表明，真菌毒素AFB1、FB1、OTA和T2 不僅能夠降低TEER 值，同時還能夠降低Claudin-3、Claudin-4 和Occludin 的表達水平（Barbara 等，2018）。

霉菌毒素損傷腸道細胞的主要機制是氧化損傷和DNA 損傷。Taranu 等（2015）用10 mol/L 的ZEA 處理豬IPEC-1 后進行轉錄組分析，結果發(fā)現(xiàn)，在此濃度下細胞的存活率不受影響，但ZEA可以促進活性氧的產(chǎn)生和破壞DNA 的結構，從而引起細胞氧化損傷，而霉菌毒素對細胞DNA 的破壞可通過添加抗氧化劑來抑制。此外，將ZEA 應用于未分化的Caco-2 細胞后發(fā)現(xiàn)，ZEA 以劑量依賴性方式引起DNA 片段化和抑制DNA 加合物的形成，并產(chǎn)生梯狀DNA 圖案。另外，研究者還發(fā)現(xiàn)，若向Caco-2 細胞中添加維生素E 可以縮短細胞周期，減少DNA 片段的產(chǎn)生并修復DNA 損傷（Salwa 等，2003），而維生素E 修復細胞中DNA損傷的作用主要是利用其抗氧化活性，這就表明氧化物與DNA 損傷緊密相關。

2 霉菌毒素對腸道化學屏障功能的影響

腸道化學屏障主要由胃酸、膽汁、各種消化酶、溶菌酶、黏多糖和胃腸道分泌的其他化學物質以及腸道寄生蟲產(chǎn)生的抑菌物質組成，能夠有效抑制有害物質，防御不利因素對腸道黏膜的損傷。而腸道上的分泌細胞如杯狀細胞能夠將高度糖基化的黏蛋白分泌到腸腔中，這些黏蛋白在外來污染物進入腸道黏膜屏障的深層組織中發(fā)揮著重要作用，形成抵抗微生物入侵的第一道防線。

霉菌毒素可引起雞腸黏蛋白單糖組成的變化，進而影響?zhàn)さ鞍椎墓δ?。Antonissen 等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B 和DON 能夠改變?nèi)怆u十二指腸黏蛋白中單糖的比例，影響十二指腸黏液層的功能，即使是在低濃度下，霉菌毒素也能引起蛋雞腸道黏膜單糖組成的變化，這些變化可能有助于增強腸道對霉菌毒素的抵抗力。此外，Wan 等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，DON 和ZEA 的混合毒素增加了杯狀特異性蛋白MUC2 的mRNA 表達水平，而單獨或組合使用真菌毒素DON、ZEA、NIV 和FB1可顯著改變MUC5AC 和MUC5B 的mRNA 和蛋白表達水平。這表明至少某些轉錄或翻譯后的調(diào)控機制與霉菌毒素誘導的黏蛋白分子合成和分泌密切相關。

哺乳動物通過腸道上皮細胞分泌抗菌肽增強其屏障功能。研究表明，霉菌毒素能夠上調(diào)豬防御素-1（pBD-1）和pBD-2 的mRNA 表達（Wan 等，2013）。Han 等（2015）進行的一項體外研究發(fā)現(xiàn)，pBD2 可增加Caco-2 細胞中黏蛋白的mRNA 表達。因此，推測當真菌毒素對腸道造成損害時，腸道通過上調(diào)抗菌肽的分泌而增加黏蛋白的表達，從而增強腸道黏膜的化學屏障功能。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加復合抗菌肽或抗菌肽CWA可以改善受損的腸上皮細胞的自我修復能力和腸黏膜的屏障功能，促進腸道上皮細胞增殖和蛋白質合成（易宏波，2016），說明在飼料中添加抗菌肽可以拮抗霉菌毒素的毒性。

3 霉菌毒素對腸道黏膜免疫屏障功能的影響

免疫屏障主要由腸道免疫系統(tǒng)細胞組成，包括源自腸道相關淋巴組織和已擴散的免疫細胞。前者主要是指分布在腸道中的聚集性淋巴結節(jié)，是免疫應答的誘導和激活位點，而后者主要是腸黏膜免疫的發(fā)生部位。Gerez 等（2015）發(fā)現(xiàn)，DON可誘導仔豬腸系膜淋巴結細胞凋亡，刺激免疫細胞分泌細胞因子，引起腸道免疫應答和炎癥反應。此外，He 等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，AFB1可顯著降低雄性肉雞回腸黏膜中sIgA、IgA、IgG 和IgM 的含量。sIgA 是胃腸道和黏膜表面的主要體液免疫成分和效應分子，并且是抵抗腸黏膜黏附和定居的第一道防線，其含量的降低，可導致腸道黏膜免疫反應的缺失，從而損傷腸道黏膜免疫屏障。

IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 和IFN-γ 等是免疫細胞分泌的細胞因子，是調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應的重要介體。研究顯示，DON 能夠增加促炎因子IL-8、IL-1a、IL-1b 和TNF-a 的分泌，導致腸道的通透性增加，使腸道中的某些因子更容易通過腸進入血液（Cano 等，2013）。此外，用不同濃度的DON 刺激IPEC-J2 細胞后同樣發(fā)現(xiàn)，DON 可增加與炎癥和細胞凋亡相關基因IL-1β、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、IL-6、TNF-α、caspase-3、caspase-8和caspase-9 的表達（Kang 等，2019）。這些研究表明霉菌毒素進入腸道內(nèi)可破壞腸道免疫屏障，從而導致細胞凋亡。

4 霉菌毒素對腸道黏膜生物屏障功能的影響

腸道中的生物屏障由共同居住在腸道內(nèi)腔或定居在腸道黏膜表面的腸道菌群形成。在正常條件下，腸道黏膜表面會生長大量厭氧細菌，這些厭氧菌通過黏附與腸上皮緊密結合，形成可抵抗和排斥外源病原體入侵的膜屏障。如果腸道厭氧菌數(shù)量減少，腸道菌群平衡受到破壞，外源病原菌就會黏附于腸道黏膜，導致腹瀉和腸炎等一系列腸道疾病。

研究表明，動物的微生物群與攝入的霉菌毒素之間具有密切相互作用。Wang 等（2015）研究結果表明，AFB1可以劑量依賴的方式誘導微生物群落組成的變化，從而顯著改變腸道菌群的組成。Guo 等（2014）使用宏基因組學和基于培養(yǎng)的方法研究了OTA 對腸道菌群的影響。結果發(fā)現(xiàn)，OTA能夠降低腸道菌群的多樣性，并且乳酸菌的相對豐度明顯提高。Piotrowska 等（2014）研究ZEA 對腸道菌群的影響，結果發(fā)現(xiàn)使用ZEA 后，腸道內(nèi)的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌、腸桿菌科和大腸桿菌的濃度顯著降低。至于DON 對腸道微生物的影響，研究發(fā)現(xiàn)DON 可減少腸道微生物種類，降低Alpha 和Beta 多樣性，導致微生物菌群失衡（楊俊花等，2017），并且會重塑腸道微生物結構并完全破壞幾個細菌門、科和屬的豐度，從而導致生態(tài)平衡失衡（Lucke 等，2018）。此外，劉錦芳等（2019）研究還發(fā)現(xiàn)，DON 與AFB1單一及聯(lián)合染毒均可改變腸道內(nèi)菌群的豐度，降低有益菌豐度，升高有害菌豐度，并且DON 和AFB1表現(xiàn)出明顯的互作性，具有協(xié)同效應?？傊?，霉菌毒素對腸道生物屏障的損傷主要體現(xiàn)在破壞腸道正常菌群結構，造成腸道有益菌減少，致病菌增多。

5 總結

腸道是機體抵抗體外污染物入侵的第一道屏障。腸道與高濃度的霉菌毒素污染物接觸可能會損害腸黏膜。如果腸壁屏障的四個相互連接的組件（即物理、化學、免疫或生物屏障）中的任何一個遭到破壞，則可能會導致腸炎和癌癥等疾病的發(fā)生。因此，控制日糧中霉菌毒素的含量十分有必要，但這可能要通過在生產(chǎn)過程中對飼料進行排毒來實現(xiàn)。迄今為止，關于物理、化學和免疫屏障的報道比對生物屏障的報道要多，這可能是由于試驗技術的困難，因為腸道微生物群落的組成在很大程度上會受到飲食、環(huán)境、抗生素的使用和遺傳背景等各種因素的影響。在未來的研究中，我們將尋求一種合適的試驗系統(tǒng)來探索真菌毒素與腸道生物屏障之間的相互作用及作用機理，為開發(fā)減少真菌毒素引起的腸道損傷的藥物奠定理論基礎。