Neuritin 神經(jīng)可塑性機(jī)制研究

趙秋語(yǔ)，陳 黎，胡 敏

（昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院暨云南省第二人民醫(yī)院眼科/云南省眼部疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/云南省眼科研究所/云南省眼病臨床醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650021）

神經(jīng)氨酸（Neuritin）最初是在海藻酸誘導(dǎo)的海馬齒狀回中發(fā)現(xiàn)的一種與神經(jīng)可塑性相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，因其編碼的蛋白質(zhì)能夠促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長(zhǎng)而得名，也被稱(chēng)為候選可塑性相關(guān)基因15（candidate plasticity-related genes15，CPG15）[1，2]。作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，Neuritin 在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著許多作用，其中神經(jīng)可塑性及機(jī)制的研究備受關(guān)注。弱視是目前我國(guó)常見(jiàn)視覺(jué)障礙中的一種[3]，近年來(lái)研究顯示弱視的發(fā)生與視覺(jué)神經(jīng)通路的發(fā)育異常有著密切關(guān)聯(lián)[4，5]。但現(xiàn)今弱視的治療方案多為壓抑優(yōu)勢(shì)眼、屈光矯正及視覺(jué)訓(xùn)練，甚少有關(guān)于視覺(jué)神經(jīng)通路可塑性藥物治療方面的研究，Neuritin 的神經(jīng)可塑性可能為弱視及其他視覺(jué)系統(tǒng)損傷疾病提供新的治療思路。

1 Neuritin 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用及機(jī)制

Neuritin 是神經(jīng)活動(dòng)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族（NTs）共同作用的下游因子。在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，Neuritin 在大腦多個(gè)區(qū)域表達(dá)，并充當(dāng)神經(jīng)祖細(xì)胞和分化神經(jīng)元的生存因子[6]；發(fā)育的后期，Neuritin促進(jìn)軸突和樹(shù)突狀樹(shù)突的生長(zhǎng)和穩(wěn)定以及突觸形成和成熟[7，8]；成人大腦中，Neuritin 持續(xù)表達(dá)，其表達(dá)與活動(dòng)依賴(lài)的功能的可塑性相關(guān)[9]。因而Neuritin 在神經(jīng)可塑性領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。

1.1 抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)損傷后的恢復(fù) Zhang H 等[10]認(rèn)為Neuritin 在蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后可通過(guò)減輕血腦屏障破壞、腦水腫和細(xì)胞凋亡對(duì)早期腦損傷（EBI）發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而這種作用可能是通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）介導(dǎo)的凋亡途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。Gao R 等[11]發(fā)現(xiàn)Neuritin 在實(shí)驗(yàn)性大鼠脊髓損傷（SCI）模型中創(chuàng)造了促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活和神經(jīng)突再生的環(huán)境，從而有助于神經(jīng)再生和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。另一實(shí)驗(yàn)研究也證明[12]，Neuritin 治療不僅增加了坐骨神經(jīng)損傷中的坐骨纖維密度和組織以及髓鞘再生程度，而且還促進(jìn)了腓腸肌肌肉力量和神經(jīng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)。最近的研究顯示[13]，Neuritin 可通過(guò)改善施萬(wàn)細(xì)胞的存活率和功能從而改善大鼠糖尿病性神經(jīng)病中神經(jīng)元的生長(zhǎng)。以上研究證明，Neuritin 在中樞及周?chē)窠?jīng)中均有明顯的促進(jìn)損傷修復(fù)作用，但具體的修復(fù)機(jī)制仍有待探究。

1.2 促進(jìn)突觸發(fā)育及神經(jīng)元遷移 有研究者為了研究突觸成熟過(guò)程中對(duì)Neuritin 的需求，建立了一個(gè)CPG15 基因敲除（CPG15 KO）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)這些小鼠的軸突和樹(shù)突狀樹(shù)突形成存在明顯的發(fā)育延遲[14]。電生理研究還表明，突觸的成熟被延遲，電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)許多樹(shù)突棘最初都缺乏功能性的突觸接觸。Subramanian J 等[15]發(fā)現(xiàn)Neuritin 可通過(guò)募集突觸后致密蛋白（PSD95）促進(jìn)興奮性突觸的穩(wěn)定和成熟。他們利用雙光子成像觀察到Neuritin 利用其糖基磷脂?；煎^（GPI 錨）與AMPA 受體（AMPAR）相互作用可使PSD95 募集到新生的棘突從而促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)及突觸的成熟，而PSD95 募集反過(guò)來(lái)會(huì)促進(jìn)AMPA 受體與未成熟突觸的接觸，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且功能成熟的突觸。此外也有研究表明[16]，Neuritin 能夠促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的遷移,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Neuritin 在永生的神經(jīng)元（GN11 細(xì)胞）遷移的小鼠模型中高表達(dá)，而在非遷移的神經(jīng)元（GT1-7 細(xì)胞）中沒(méi)有表達(dá)。同時(shí)，當(dāng)Neuritin 過(guò)表達(dá)或者沉默時(shí)，GN11 細(xì)胞出現(xiàn)了相對(duì)應(yīng)的遷移增強(qiáng)或減弱。這些結(jié)果提示Neuritin 在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟過(guò)程中起著不可替代的作用。

1.3 參與神經(jīng)可塑性的調(diào)控 唐娟等[17]觀察到Neuritin 可使DRG 和PC12 細(xì)胞出現(xiàn)濃度依賴(lài)性的神經(jīng)突增生。在NGF 的誘導(dǎo)下Neuritin 能使DRG 和PC12 細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的分化作用，其細(xì)胞突起數(shù)量及長(zhǎng)度明顯增加，相反，在缺乏Neuritin 的培養(yǎng)環(huán)境下幾乎觀察不到神經(jīng)突生長(zhǎng)。在大鼠抑郁癥模型中海馬神經(jīng)元樹(shù)突分支減少，同時(shí)Neuritin 基因在海馬神經(jīng)元中的表達(dá)由于慢性不可預(yù)測(cè)的壓力（CUS）而降低，而病毒介導(dǎo)的Neuritin 蛋白在海馬中的表達(dá)可防止CUS 引起的樹(shù)突和樹(shù)突棘萎縮[18]。

近年來(lái)，有研究者發(fā)現(xiàn)Neuritin 蛋白可能在聽(tīng)覺(jué)剝奪的情況下對(duì)上橄欖巖旁核（SPON）神經(jīng)元的存活和發(fā)育起重要作用[19]。SPON 神經(jīng)元在動(dòng)物發(fā)聲和人類(lèi)語(yǔ)音中編碼節(jié)奏信息起重要作用，他們發(fā)現(xiàn)與正常聽(tīng)覺(jué)的小鼠相比，在耳聾小鼠的SPON 中可溶性的Neuritin 被上調(diào)，膜時(shí)間常數(shù)減少和Ca2+電流的募集減少，從而使聽(tīng)覺(jué)剝奪小鼠的精確反彈峰值正?；?，推測(cè)Neuritin 可能促進(jìn)了神經(jīng)元的存活并延長(zhǎng)了SPON 電路的可塑性。以上這些研究表明Neuritin 在神經(jīng)可塑性中起重要作用。

2 Neuritin 分子生物學(xué)特性

2.1 Neuritin 基因的表達(dá)調(diào)控 在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)活動(dòng)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子均能單獨(dú)誘導(dǎo)Neuritin 的表達(dá)，但二者誘導(dǎo)Neuritin 表達(dá)的分子機(jī)制明顯不同。Neuritin 是許多經(jīng)典突觸可塑性信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游因子[20]，包括N 一甲基一天冬氨酸（NMDA）受體、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、鈣離子及鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的蛋白激酶（CaMK）和cAMP 反應(yīng)結(jié)合蛋白（CREB）。目前認(rèn)為，神經(jīng)活動(dòng)可以通過(guò)激活NMDA受體或者直接使L 型電壓敏感鈣通道（VSCCs）開(kāi)放，鈣離子內(nèi)流，進(jìn)一步激活鈣離子及鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的蛋白激酶CaMK 和MAPK 通路，最終促使一系列的轉(zhuǎn)錄因子包括CREB 激活，并與Neuritin 基因的啟動(dòng)子結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子均能單獨(dú)誘導(dǎo)Neuritin 蛋白的表達(dá)，表明Neuritin 是NTs 發(fā)揮作用的共同下游因子。在成年大鼠的齒狀回中外源性注入腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF），觀察到Neuritin mRNA 的表達(dá)上調(diào)[21]。在神經(jīng)元祖細(xì)胞（ST14A）中過(guò)表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF），發(fā)現(xiàn)Neuritin 等基因表達(dá)上調(diào)[22]，推測(cè)GDNF 通過(guò)誘導(dǎo)Neuritin 的表達(dá)從而參與神經(jīng)組織的發(fā)育和維持。

除以上因素外，雄激素及HuD 蛋白也與Neuritin 基因的表達(dá)有關(guān)。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用睪丸激素治療可使神經(jīng)損傷的倉(cāng)鼠體內(nèi)的NeuritinmRNA 水平增加數(shù)倍，而使用氟他胺（雄激素受體阻滯劑）同時(shí)治療時(shí)NeuritinmRNA 并沒(méi)有出現(xiàn)變化[23]，這證實(shí)雄激素是通過(guò)雄激素受體對(duì)Neuritin 基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。HuD 是Hu 蛋白家族中一種神經(jīng)特異性的mRNA 穩(wěn)定性調(diào)控因子，有研究顯示[24]，HuD 可以直接與Neuritin 結(jié)合并穩(wěn)定Neuritin mRNA，提示HuD可能參與了Neuritin mRNA 的穩(wěn)定性調(diào)控。

通過(guò)以上研究結(jié)果可發(fā)現(xiàn)Neuritin 的表達(dá)受到多方面的調(diào)控，但目前對(duì)于各個(gè)調(diào)控通路之間是否相關(guān)或相互影響并未見(jiàn)相關(guān)研究。

2.2 Neuritin 相關(guān)信號(hào)通路及分子機(jī)制 盡管已知Neuritin 通過(guò)與受體結(jié)合發(fā)揮非細(xì)胞自主作用[7]，但就目前而言，Neuritin 仍被認(rèn)為是一種孤兒配體，尚未確定特定的Neuritin 受體，下游效應(yīng)因子尚不清楚。

2.2.1 Neuritin 與胰島素受體（IR）有研究表明[25]，將小腦顆粒神經(jīng)元（CGNs）與Neuritin 一起培養(yǎng)可增加CGNs 在時(shí)間和濃度依賴(lài)下瞬時(shí)外向鉀電流（IA）的密度，這些變化是由Kv4.2（IA 通道的主要亞基）轉(zhuǎn)錄和翻譯的增強(qiáng)而引起。將胰島素注射到CGNs也可以誘導(dǎo)IA 密度增加以及Kv4.2 表達(dá)增加，從而推測(cè)Neuritin 引起的Kv4.2 表達(dá)增強(qiáng)可能與IR 激活有關(guān)。生化分析表明，Neuritin 可以激活I(lǐng)R，而通過(guò)藥理學(xué)阻斷IR 可完全抵消Neuritin 引起的作用。盡管缺乏證據(jù)表明Neuritin 可直接與IR 結(jié)合，但以上的研究結(jié)果表明Neuritin 可能是IR 的潛在配體。

2.2.2 Neuritin 激活絲裂原激活的蛋白激酶-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MEK-ERK）和PI3K-Akt-mTOR 通路 ERK 通路是NGF 和IR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶標(biāo)。Ying Y 等[25]將CGNs 與Neuritin 一起培養(yǎng)30 min 可增加ERK1/2 的磷酸化，而加入MEK/ERK 通路阻滯劑U0126 后，由Neuritin 介導(dǎo)的IA 的密度增加以及Kv4.2 的表達(dá)增加都被逆轉(zhuǎn)。與ERK 相似，孵育過(guò)程中Akt 和mTOR 的磷酸化均增加，但二者反應(yīng)速度不同且均慢于ERK，同樣，加入相應(yīng)阻滯劑后可逆轉(zhuǎn)Neuritin 介導(dǎo)的反應(yīng)。

2.2.3 Neuritin 激活NFATc4/Ca2+/CaN 通路 Zhao QR等[26]利用鈣成像和蛋白質(zhì)印跡分析發(fā)現(xiàn)Neuritin 可增強(qiáng)高K+誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的增加，并刺激CaV1.2 和CaV1.3（L 型鈣通道的亞基）的細(xì)胞表面表達(dá)，進(jìn)而抑制IR 或促分裂原激活的蛋白激酶激酶/ERK。也有其他研究稱(chēng)，Neuritin 可能是刺激CaV3.3α（T 型鈣通道的亞基）的細(xì)胞表面表達(dá)[27]。利用L 型鈣通道抑制劑、鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）可消除Neuritin 對(duì)神經(jīng)突長(zhǎng)度和脊柱密度的影響。另外，通過(guò)沉默活化的T 細(xì)胞核因子（NFAT）c4 也獲得了相似的結(jié)果，而該因子在CGNs 中可被Neuritin 激活[28]。

綜上所述，Neuritin 可能通過(guò)IR、ERK/PI3KAkt-mTOR 通路以及NFATc4/Ca2+/CaN 導(dǎo)致Kv4.2上調(diào)并增加IA 密度，進(jìn)而對(duì)CGN 中神經(jīng)突和脊柱生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。

2.2.4 其他信號(hào)通路 李賀等[29]建立神經(jīng)元樣Neuro-2a（N-2a-N）細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)Neuritin 能夠上調(diào)并激活ERK1/2 和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），進(jìn)而介導(dǎo)白血病病毒前病毒插入位點(diǎn)1（Pim-1）和GAP-43 蛋白表達(dá)，促進(jìn)受損N-2a-N細(xì)胞神經(jīng)突起的再生。Shimada T 等[30]發(fā)現(xiàn)Neuritin與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）共同作用可以減少苔蘚纖維的生長(zhǎng)，而這一過(guò)程是通過(guò)FGF 通路引發(fā)的。在實(shí)驗(yàn)性糖尿病性神經(jīng)病中，Nan G 等[31]發(fā)現(xiàn)Neuritin 與酪氨酸激酶A（TrkA）受體共同定位于大鼠DRG 神經(jīng)元中，然而目前并沒(méi)有直接的證據(jù)表明神經(jīng)氨酸激活了TrKA 受體。Pan Z 等[32]發(fā)現(xiàn)Neuritin和神經(jīng)化的E3 泛素蛋白連接酶1（NEURL1）（Notch調(diào)節(jié)劑）之間存在相互作用。重組Neuritin 恢復(fù)了由Notch 激活引起的神經(jīng)突回縮，而Neuritin 刺激的神經(jīng)突生長(zhǎng)被NEURL1 部分阻滯，這提示Neuritin 是NEURL1 的上游和負(fù)調(diào)節(jié)劑，可抑制Notch 信號(hào)傳導(dǎo)從而促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)。

3 Neuritin 與視路

3.1 Neuritin 在視路中的分布 Neuritin 在視路中廣泛表達(dá)，主要分布在視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、外側(cè)膝狀體、視皮層及視上丘[2]。在視網(wǎng)膜中Neuritin mRNA 僅在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中被檢測(cè)到，且集中于軸突。Fujino T 等[33]搜索到了一個(gè)稱(chēng)為CPG15-2 的潛在旁系同源物。CPG15-2 也是一個(gè)活性調(diào)節(jié)基因，其基因組結(jié)構(gòu)與CPG15 相似，但二者分布區(qū)域不全相同。與CPG15 在大腦皮層和海馬中的含量最高相反，CPG15-2 mRNA 在視網(wǎng)膜和嗅球中含量最高。在視網(wǎng)膜中，CPG15 集中于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs），而CPG15-2 主要在雙極細(xì)胞中表達(dá)。但是迄今為止，還缺乏關(guān)于CPG15-2 的研究。

3.2 Neuritin 基因表達(dá)在視路發(fā)育過(guò)程中的變化 通過(guò)原位雜交的方法分別觀察貓和大鼠從視覺(jué)發(fā)育初期到成年期全過(guò)程中初級(jí)視皮層Neuritin mRNA 表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Neuritin 基因表達(dá)高峰出現(xiàn)在視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期[34，35]。陳霞等[36]觀察到正常發(fā)育大鼠視皮層中的Neuritin mRNA 和蛋白表達(dá)與視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)和年齡有關(guān)，在視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期達(dá)到高峰，且單眼形覺(jué)剝奪會(huì)明顯影響視皮層中Neuritin 的表達(dá)。這些研究均表明Neuritin 基因可能參與視覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的全過(guò)程，并且在視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期參與視皮層神經(jīng)元可塑性的調(diào)節(jié)，由此可推測(cè)Neuritin 是參與視覺(jué)發(fā)育可塑性變化的分子基礎(chǔ)之一。

3.3 視路可塑性與Neuritin 基因的表達(dá)調(diào)控 研究表明[37]，Neuritin 在大鼠視覺(jué)皮質(zhì)的表達(dá)具有光誘導(dǎo)性。將正常大鼠置于黑暗環(huán)境2 周后，其視皮層中的Neuritin 表達(dá)減少，而給予光刺激4 h 后其表達(dá)又回復(fù)到原來(lái)的正常水平。但有研究發(fā)現(xiàn)[35]，Neuritin 基因表達(dá)調(diào)節(jié)分為兩個(gè)階段：早期的表達(dá)雖與睜眼時(shí)間相吻合，但并不受暗環(huán)境、視網(wǎng)膜驅(qū)動(dòng)動(dòng)作電位或單眼剝奪的影響，表達(dá)相對(duì)獨(dú)立；在視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期，Neuritin 表達(dá)的活性依賴(lài)成分出現(xiàn)，并且隨著年齡的增長(zhǎng)，視網(wǎng)膜動(dòng)作電位阻滯的作用變得更加明顯。

偉偉等[38]在大鼠視神經(jīng)損傷模型中發(fā)現(xiàn)Neuritin 基因在受損視神經(jīng)中表達(dá)上升，而Neuritin 基因過(guò)表達(dá)可提高RGCs 的活性。另一研究報(bào)道稱(chēng)[39]，Neuritin 在體外和體內(nèi)軸突損傷后對(duì)神經(jīng)切除的RGCs 均表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)、再生作用并保留了RGCs功能，研究者通過(guò)腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)的Neuritin 過(guò)表達(dá)延遲了RGCs 凋亡，再生了受損軸突并維持了視神經(jīng)損傷后RGCs 的功能，從而支持了Neuritin 的視神經(jīng)保護(hù)作用。Huang T 等[40]對(duì)Neuritin 對(duì)視神經(jīng)損傷的修復(fù)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，認(rèn)為Neuritin 的功能性分子激活了Akt1 和STAT3 途徑，并抑制了線粒體的凋亡途徑。Azuchi Y 等[41]研究了視神經(jīng)損傷（ONI）對(duì)Neuritin 基因敲除（KO）小鼠視網(wǎng)膜變性的影響。在ONI 小鼠模型中Neuritin mRNA 上調(diào)，對(duì)于剔除Neuritin 基因的成年小鼠，其視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和RGCs 數(shù)量正常，而剔除Neuritin 基因小鼠的ONI 模型顯示RGCs 死亡和視網(wǎng)膜內(nèi)部變性更為嚴(yán)重，提示Neuritin 蛋白促進(jìn)了損傷后RGCs存活和軸突再生。Picard N 等[42]指出，小鼠胚胎時(shí)期Neuritin 的整體敲除會(huì)導(dǎo)致出生后視覺(jué)皮層中興奮性網(wǎng)絡(luò)的異常發(fā)育以及相關(guān)視覺(jué)感受野特性發(fā)展中斷。此外，盡管重復(fù)的視覺(jué)刺激會(huì)引起野生型小鼠視皮層細(xì)胞反應(yīng)的增強(qiáng)和抑制，但Neuritin 基因敲除小鼠抑制卻較慢，表明短期抑制機(jī)制的損害。

以上研究顯示在不同的損傷模型中，Neuritin可以在不同階段被下調(diào)和上調(diào)，但是神經(jīng)損傷后Neuritin 總體水平會(huì)增加，表明Neuritin 在視覺(jué)系統(tǒng)神經(jīng)可塑性中起到重要作用。

4 總結(jié)

目前弱視的定義仍在強(qiáng)調(diào)臨床檢查無(wú)可見(jiàn)器質(zhì)性病變，但已有研究可以證明弱視的視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，并且具有一定的可塑性和可塑期，具體機(jī)制尚不清楚。Neuritin 目前雖然較少應(yīng)用于弱視研究，但通過(guò)探究Neuritin 的神經(jīng)可塑性與視路可塑性的關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)，其分布與弱視的解剖變化部位有重合，且其表達(dá)變化與視覺(jué)關(guān)鍵期的形成一致，推測(cè)Neuritin 可能作為重要的一環(huán)參與了弱視的形成。因此對(duì)于Neuritin 的深入研究可能為今后弱視的發(fā)病機(jī)制及藥物治療的研究提供新的思路。