干細(xì)胞源外泌體及改良外泌體在治療急性心肌梗死中的研究進(jìn)展

胡悅,何潔瓊,陳軍

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)深圳寶安臨床醫(yī)學(xué)院 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 深圳 518101)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)指冠狀動(dòng)脈急性閉塞、血流中斷引起的局部心肌缺血性壞死，是威脅人類(lèi)健康的重大疾病。2018年中國(guó)心血管病報(bào)告顯示，我國(guó)AMI患者的死亡率自2005年開(kāi)始呈快速上升趨勢(shì)[1]，隨著人們生活節(jié)奏的加快以及不良生活方式(加班熬夜、抽煙喝酒、高脂高熱量飲食等)的影響，AMI發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)[2]。目前AMI的預(yù)防和治療已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前臨床上AMI的治療包括溶栓、冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架置入術(shù)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)以及藥物治療，上述治療均可改善癥狀，但部分患者的療效不佳。研究表明，干細(xì)胞可增殖分化為心肌細(xì)胞，并替代受損心肌細(xì)胞，進(jìn)而改善心臟功能，其中外泌體發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用；通過(guò)包膜表面的特異性受體將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞，有望實(shí)現(xiàn)疾病的精準(zhǔn)治療[3-4]?，F(xiàn)對(duì)干細(xì)胞源外泌體治療AMI的機(jī)制以及改良外泌體治療AMI的研究進(jìn)展予以綜述。

1 外泌體

1.1外泌體的形成 活細(xì)胞能分泌多種膜狀囊泡，根據(jù)直徑和生成機(jī)制不同可分為外泌體(直徑40～100 nm)、微囊泡(直徑200～1 000 nm)和凋亡小體(直徑500～5 000 nm)[5]。外泌體是細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用形成初級(jí)內(nèi)體，初級(jí)內(nèi)體再將細(xì)胞質(zhì)中的信使RNA(messenger RNA，mRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等物質(zhì)包裹在其中形成多泡晚期內(nèi)體，然后多泡晚期內(nèi)體與細(xì)胞膜融合通過(guò)胞吐作用將攜帶的蛋白質(zhì)、基因和酶等物質(zhì)釋放到細(xì)胞外所形成的膜狀囊泡，其廣泛存在于血液、尿液、唾液、腹水等體液中[6-7]。

1.2外泌體的生物學(xué)特性 外泌體是細(xì)胞間進(jìn)行信息交流的樞紐[6]，其生物學(xué)特性為：①靶向性。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體表面表達(dá)特定的跨膜蛋白(CD63、CD9、CD81、熱激蛋白70等)，可靶向作用到特定的細(xì)胞[8]。②特異性。不同生理、病理狀態(tài)下分泌的外泌體會(huì)分泌特定的miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，其中miRNA是高度保守的小分子非編碼單鏈RNA，與靶mRNA 3′非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，通過(guò)降解mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯實(shí)現(xiàn)基因調(diào)控[9]，外泌體可通過(guò)這些特定的內(nèi)含物向靶細(xì)胞傳遞相應(yīng)的信號(hào)。③穩(wěn)定性。外泌體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，可避開(kāi)循環(huán)系統(tǒng)中RNA酶的降解，具有高度的生物穩(wěn)定性[10]。④低毒性和低免疫原性[11]。外泌體屬于非細(xì)胞體系，具有低毒性和低免疫原性，可避免發(fā)生排斥反應(yīng)，有利于外泌體作為載體向靶細(xì)胞傳遞信息。

2 外泌體治療AMI的作用

當(dāng)冠狀動(dòng)脈管腔發(fā)生急性完全閉塞時(shí)，其所供區(qū)域的心室壁心肌會(huì)出現(xiàn)透壁性壞死，臨床表現(xiàn)為典型的ST段抬高型心肌梗死，冠狀動(dòng)脈閉塞后20～30 min，其供血心肌有少量壞死，1～2 h后絕大部分心肌呈凝固性壞死，壞死組織1～2周后開(kāi)始吸收并逐漸纖維化，6～8周后進(jìn)入慢性期形成瘢痕愈合，較大瘢痕處可逐漸外凸出形成室壁瘤，波及心內(nèi)膜可導(dǎo)致附壁血栓形成，波及心包會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)性心包炎[12]。在心腔壓力作用下，壞死的心室壁可破裂，造成心包積血而引起猝死。雖然傳統(tǒng)治療(溶栓、冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架置入術(shù)、藥物治療等)可暫時(shí)改善患者癥狀，但部分患者仍遺留較多并發(fā)癥，最終導(dǎo)致慢性心力衰竭。

干細(xì)胞具有多向分化特性，目前廣泛用于心肌梗死后心臟再生治療。干細(xì)胞療法雖然可明顯改善心臟功能，但易產(chǎn)生排斥反應(yīng)和致畸作用[13]。移植細(xì)胞的旁分泌因子——外泌體可能在受損心肌細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程中起主要作用，而非移植細(xì)胞本身。Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)可通過(guò)抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成修復(fù)受損的心肌細(xì)胞，促進(jìn)心臟功能恢復(fù)，而無(wú)外泌體的人臍帶MSC幾乎不能促進(jìn)心臟功能恢復(fù)。提示人臍帶MSC對(duì)心肌細(xì)胞的修復(fù)是由外泌體介導(dǎo)的。外泌體本身具有低毒性和低免疫原性，可降低免疫排斥反應(yīng)，彌補(bǔ)干細(xì)胞移植的缺陷。Suzuki等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體主要通過(guò)抗凋亡、抗纖維化、抗炎、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成等幾個(gè)方面修復(fù)AMI后的心肌細(xì)胞。

2.1抗凋亡作用 細(xì)胞凋亡指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。心肌梗死區(qū)域心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，心肌缺血、缺氧等均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[16]，心肌細(xì)胞的進(jìn)行性喪失最終會(huì)導(dǎo)致心力衰竭，因此抑制早期心肌梗死中的心肌細(xì)胞凋亡對(duì)改善心臟功能、預(yù)防心室重塑和減少心血管事件非常重要，并且是治療心肌梗死的重要方法之一。外泌體作為細(xì)胞間信息傳遞的媒介，可與靶細(xì)胞結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞凋亡，改善心肌預(yù)后。有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-133可抑制細(xì)胞凋亡，輸注miR-133過(guò)表達(dá)MSC心肌梗死大鼠的梗死心肌面積縮小[17]，推測(cè)外泌體miR-133可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡改善心臟功能，縮小心肌梗死面積。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境下，骨髓MSC外泌體可通過(guò)上調(diào)miRNA-24抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減少心肌梗死面積。Dai等[19]的研究顯示，外泌體miRNA-379可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白8，降低心肌細(xì)胞凋亡水平，保護(hù)心肌細(xì)胞免受AMI誘導(dǎo)的心肌損傷。另有研究表明，脂肪干細(xì)胞分泌的miR-214具有抗細(xì)胞凋亡作用，AMI時(shí)心肌細(xì)胞通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用捕獲miR-214，導(dǎo)致心肌損傷，而氯丙嗪可抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，降低心肌細(xì)胞凋亡[20]，這一研究成果為AMI的治療提供了新的方法。

2.2抗纖維化作用 心肌纖維化是心肌梗死后的主要病理過(guò)程，梗死后的心肌細(xì)胞在1～2周后逐漸纖維化，損傷組織由纖維化瘢痕取代，但過(guò)度的纖維化會(huì)改變心室順應(yīng)性，增加心室壁厚度，影響心臟的收縮和舒張，嚴(yán)重者可導(dǎo)致心力衰竭[21]。研究顯示，心臟成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞之間存在聯(lián)系，心肌缺血再灌注損傷時(shí)，心臟成纖維細(xì)胞會(huì)分泌富含miR-423-3p的外泌體，外泌體作為重要的旁分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)，將miR-423-3p運(yùn)送到心肌細(xì)胞中，通過(guò)影響下游效應(yīng)因子Ras相關(guān)小鳥(niǎo)苷三磷酸酶蛋白超家族介導(dǎo)對(duì)心臟的保護(hù)作用[22]。目前抑制心肌過(guò)度纖維化是治療心肌梗死的理想方法，其中外泌體起重要作用。Luo等[23]通過(guò)建立大鼠心肌梗死模型和低氧誘導(dǎo)下心肌損傷體外模型研究miR-126過(guò)表達(dá)的脂肪干細(xì)胞源外泌體對(duì)損傷心肌細(xì)胞的作用，體外結(jié)果顯示，miR-126過(guò)表達(dá)的脂肪干細(xì)胞可降低心肌細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)；體內(nèi)研究證實(shí)，注入富含miR-126的外泌體大鼠心肌梗死模型的心臟纖維化和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)顯著降低，梗死后的心肌損傷面積也顯著縮小[23]。另外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1在調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞分化和膠原代謝中起關(guān)鍵作用，其可通過(guò)增加細(xì)胞外基質(zhì)沉積以及膠原蛋白和纖連蛋白的合成，促進(jìn)心肌纖維化，過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致心功能障礙[24]。Yu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-133a的過(guò)表達(dá)可降低心肌梗死后轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的水平，減少心肌膠原蛋白沉積，抑制心肌纖維化，改善心臟功能。

2.3抗炎作用 AMI時(shí)心肌缺血缺氧可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，促使中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在梗死區(qū)域聚集，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心臟功能受損。白細(xì)胞介素-10是天然存在的抗炎細(xì)胞因子，參與抗炎、增殖、抗凋亡等過(guò)程[26]。Yue等[27]研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-10缺陷型心肌梗死小鼠心肌壞死加重，梗死面積增加，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多。經(jīng)白細(xì)胞介素-10治療后，炎癥反應(yīng)減輕，成纖維細(xì)胞活化增強(qiáng)，心肌重構(gòu)改善。進(jìn)一步研究證實(shí)，白細(xì)胞介素-10缺乏時(shí)可通過(guò)上調(diào)外泌體中的整合素連接激酶以及激活受體細(xì)胞中整合素連接激酶介導(dǎo)的核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)；當(dāng)外泌體中的整合素連接激酶表達(dá)降低時(shí)，炎癥反應(yīng)減輕[27]，進(jìn)而減少心肌損傷。Liu等[28]的研究表明，富含miR-93-5p的外泌體可通過(guò)靶向作用Toll樣受體4，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥因子的表達(dá)，減輕心肌損傷。Yuan等[29]發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p可通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)CD40減輕缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而在心肌缺血性損傷中起心臟保護(hù)作用。還有研究表明，心肌梗死后小鼠miR-155的表達(dá)增加，其中miR-155主要存在于巨噬細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞分泌的外泌體可將miR-155轉(zhuǎn)移到心臟成纖維細(xì)胞中，抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)，而miR-155抑制劑可抑制此作用，降低炎癥反應(yīng)和心臟破裂的發(fā)生率，并顯著改善心臟功能[30]。由此得出，miR-155抑制劑具有作為減輕AMI相關(guān)不良事件治療劑的潛力，這一研究成果也大大提高了利用外泌體修復(fù)缺血性心肌的可能性。

2.4內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成作用 心肌梗死后心肌供血不足導(dǎo)致部分心肌細(xì)胞缺氧壞死，進(jìn)而出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大和收縮力減弱，而新生血管增多可重新恢復(fù)心肌細(xì)胞氧供，增加冠狀動(dòng)脈血流，減少心肌梗死面積，保護(hù)心臟功能。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后循環(huán)系統(tǒng)中的外泌體及攜帶的基因選擇性地轉(zhuǎn)移到外周器官，并優(yōu)先轉(zhuǎn)移到骨髓[31]。轉(zhuǎn)移的miRNA通過(guò)下調(diào)骨髓細(xì)胞中趨化因子受體4的表達(dá)，動(dòng)員祖細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成。Ju等[32]向心肌梗死小鼠注入MSC源外泌體發(fā)現(xiàn)，MSC外泌體可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和血管生成，縮小梗死面積。Kang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞分泌的miR-31也可促進(jìn)血管生成，主要是通過(guò)抑制缺氧誘導(dǎo)因子1抑制因子發(fā)揮作用，缺氧誘導(dǎo)因子1是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄活化因子，通過(guò)轉(zhuǎn)錄活化編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的基因，促進(jìn)血管新生[34-35]。還有研究表明，間充質(zhì)細(xì)胞分泌的miR-125a和miR-30b可通過(guò)抑制血管生成抑制劑δ樣4的表達(dá)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管生成[36-37]。以上研究表明外泌體可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成改善心臟功能，縮小心肌梗死面積。

3 改良外泌體在AMI治療方面的研究

干細(xì)胞源外泌體作為非細(xì)胞體系，被認(rèn)為是治療心血管疾病的一種潛在方法。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，外泌體與MSC移植聯(lián)合、外泌體加載物質(zhì)或通過(guò)藥物阻斷吞噬系統(tǒng)對(duì)外泌體的內(nèi)吞作用，可顯著提高外泌體改善心肌損傷的作用。

已有研究證明，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)及其受體趨化因子受體4在干細(xì)胞移植到缺血性心肌組織中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，SDF-1表達(dá)在局部心肌缺血性損傷后1～3 d達(dá)到峰值[38]。然而，SDF-1表達(dá)升高時(shí)如果存在急性炎癥反應(yīng)和高氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)嚴(yán)重影響移植細(xì)胞的存活[39]。Huang等[40]的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可通過(guò)增加SDF-1的表達(dá)及降低炎癥反應(yīng)提高M(jìn)SC的存活率，該研究先將外泌體遞送到心肌，然后再將MSC移植到梗死心肌，與單獨(dú)使用外泌體或MSC治療的對(duì)照組相比，可顯著改善心臟功能，增加新血管形成并減少梗死面積。研究顯示，AMI后30 min向心肌內(nèi)注射外泌體，并在AMI后第3天聯(lián)合MSC移植治療可最大程度地改善心臟功能[40]。外泌體和MSC移植聯(lián)合治療AMI不僅為外泌體的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為AMI的治療開(kāi)辟了新道路。

當(dāng)外泌體最大程度地作用于AMI心臟時(shí)才能充分發(fā)揮作用。為提高M(jìn)SC源外泌體對(duì)心臟的靶向性，Wang等[41]將缺血性心肌靶向肽基序CSTSMLKAC裝載到外泌體表面，使其靶向作用于缺血性心肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，載有缺血性心肌靶向肽的外泌體作用于缺血性心肌細(xì)胞的數(shù)量較空白外泌體顯著增多；并證實(shí)在心肌梗死小鼠中MSC衍生的缺血性心肌靶向肽外泌體可顯著抑制炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)血管生成、縮小心肌梗死面積并改善心臟功能[41]。Vandergriff等[42]的研究顯示，心臟歸巢肽與外泌體結(jié)合可增加心臟外泌體的含量，進(jìn)而增強(qiáng)外泌體對(duì)心肌損傷的修復(fù)作用。Kim等[43]通過(guò)在外泌體膜上表達(dá)心臟靶向肽的基因修飾，顯著增加了外泌體的心臟遞送。以上研究顯示，外泌體與靶向肽的結(jié)合可顯著提高心臟組織中外泌體的含量，增強(qiáng)外泌體對(duì)心臟的保護(hù)作用。

外泌體具有特異性、靶向性和穩(wěn)定性，但其在體內(nèi)的運(yùn)輸仍受到多種因素的干擾，如單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)外泌體的內(nèi)吞作用阻礙外泌體到達(dá)相應(yīng)靶器官(包括心臟)。有研究發(fā)現(xiàn)，輸注到動(dòng)物體內(nèi)的外泌體優(yōu)先聚集在肝臟和脾臟，主要是因?yàn)檫@兩個(gè)器官存在大量的巨噬細(xì)胞[44]。網(wǎng)格蛋白重鏈作為一種由CLTC基因編碼的蛋白質(zhì),在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，并介導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)揮內(nèi)吞作用。Wan等[45]采用兩步外泌體遞送策略，先向阿霉素誘導(dǎo)的心肌毒性模型輸注網(wǎng)格蛋白重鏈抑制劑(如氯丙嗪)，顯著阻斷脾臟和肝臟中單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的內(nèi)吞作用，再注入裝載miR-21的外泌體，與未輸注網(wǎng)格蛋白重鏈抑制劑組相比，裝載miR-21的外泌體對(duì)心肌的保護(hù)作用顯著增強(qiáng)。通過(guò)阻止單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)外泌體的攝取，再遞送治療性外泌體的策略是一種有前途的治療方法。外泌體在體內(nèi)移植后的低保留率也是臨床的一大難題。有研究顯示，用功能性肽水凝膠封裝外泌體后植入大鼠梗死心肌可增加外泌體的保留率和穩(wěn)定性，顯著改善心肌功能[46]。另外，將超聲微泡與外泌體同時(shí)輸注到小鼠體內(nèi)，然后在心臟組織中特異性誘導(dǎo)超聲靶向微泡破壞，結(jié)果顯示外泌體在心臟組織中的含量顯著增加[47]。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了超聲靶向微泡破壞技術(shù)促進(jìn)外泌體運(yùn)輸?shù)叫呐K的潛力，此方法有望成為一種新的AMI治療方式。

4 結(jié) 語(yǔ)

外泌體近年備受關(guān)注，其膜表面有靶向信號(hào)，具有較強(qiáng)的器官特異性，可用于疾病的靶向治療。干細(xì)胞源外泌體可通過(guò)抗凋亡、抗炎、抗纖維化、促進(jìn)血管生成等作用修復(fù)心肌細(xì)胞、縮小心肌梗死面積、改善心臟功能，改良后的外泌體可顯著提高其對(duì)心臟的保護(hù)作用。目前外泌體在心血管治療方面的研究還處于起步階段，其內(nèi)容物的作用及其介導(dǎo)信息傳遞通路的作用仍有待進(jìn)一步探究。另外，外泌體的分離需大量原材料且產(chǎn)出不高，未來(lái)還需進(jìn)一步研究外泌體的分離提純技術(shù)。盡管在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面外泌體治療AMI的研究取得了一定的進(jìn)展，但如何應(yīng)用于臨床還需要深入研究。