活性氧類在聲動(dòng)力療法中的研究進(jìn)展

閆春陽(yáng)，王碧琳，畢良佳

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院口腔科，哈爾濱 150001)

聲動(dòng)力療法(sonodynamic therapy，SDT)是由超聲聯(lián)合化學(xué)藥物聲敏劑，生成活性氧類(reactive oxygen species，ROS)并產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)的一種非傳統(tǒng)治療方式。ROS是一種可以使周圍底物被氧化的高反應(yīng)性試劑，可使靶組織產(chǎn)生一系列不可逆性損傷[1]。SDT于20世紀(jì)80年代末由Umemura等[2-3]首次提出，是基于光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)和超聲基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的新型微創(chuàng)且安全有效、性價(jià)比較高的特異性療法。SDT工作原理與PDT相近，均以ROS作為主要產(chǎn)物，但SDT在臨床中優(yōu)于PDT，關(guān)鍵在于SDT將超聲作為外源性激發(fā)源替代PDT中的光刺激，而且與PDT以線粒體作為靶細(xì)胞相比，SDT更注重以線粒體及線粒體的膜結(jié)構(gòu)作為重點(diǎn)[4-6]。同時(shí)，與PDT相比，SDT的穿透能力更強(qiáng)[7](超聲可以穿透幾十厘米的軟組織[8]，光的穿透單位仍以毫米居多)、費(fèi)用更低(可在CT/磁共振成像時(shí)進(jìn)行操作)、靶向給藥更精確，而且減少了由光刺激導(dǎo)致的組織變性。SDT很好地結(jié)合了超聲的無(wú)創(chuàng)性特點(diǎn)[9-10]，在臨床上廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)就ROS在SDT中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 ROS概述

1.1ROS的生物學(xué)特性 ROS是細(xì)胞內(nèi)聲敏劑在SDT作用下的產(chǎn)物，在腫瘤、炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化的診療中均具有重要意義。ROS的主要代表物包括羥基自由基、過(guò)氧化物、超氧化物、單線態(tài)氧、次氯酸鹽以及脂質(zhì)過(guò)氧化物等高活性分子。ROS的半衰期長(zhǎng)短決定了ROS的作用范圍及細(xì)胞毒性效應(yīng)，其中羥基自由基是氧化性能最強(qiáng)的ROS分子，可直接對(duì)細(xì)胞核酸及蛋白質(zhì)造成損害，而單線態(tài)氧是破壞性極強(qiáng)的ROS，這些主要產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境下能夠進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化，完成ROS的清除[11]。例如，細(xì)胞內(nèi)的超氧化物主要是由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)與NADPH氧化酶發(fā)生反應(yīng)及細(xì)胞自身線粒體代謝共同產(chǎn)生的，而生成的超氧化物可在超氧化物歧化酶作用下生成過(guò)氧化物，當(dāng)過(guò)氧化物積蓄到一定濃度時(shí)可在金屬陽(yáng)離子(錳離子、銅離子、鋅離子)的作用下生成羥基自由基；同時(shí)，生成的過(guò)氧化物又可在過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶及谷胱甘肽分子的作用下生成過(guò)氧化氫，ROS具有相互轉(zhuǎn)化的特性，增加了反應(yīng)的復(fù)雜性[12]。

1.2ROS的來(lái)源 ROS可由NADPH氧化酶和線粒體代謝產(chǎn)生，也可通過(guò)光刺激和聲刺激激發(fā)產(chǎn)生。根據(jù)產(chǎn)生的條件不同，ROS可分為內(nèi)源性ROS和外源性ROS。內(nèi)源性ROS主要由機(jī)體自身產(chǎn)生，另外，胞內(nèi)細(xì)胞器(線粒體產(chǎn)生約占總ROS產(chǎn)量的90%[13]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)、酶體系(過(guò)氧化物酶)[14]、巨噬細(xì)胞及粒細(xì)胞等也有產(chǎn)生ROS的能力。外源性ROS則是由外界環(huán)境(如超聲、光、藥物)刺激產(chǎn)生，外源性ROS主要有能量轉(zhuǎn)移和電子轉(zhuǎn)移兩種產(chǎn)生方式。

1.3ROS的雙面性

1.3.1重度氧化應(yīng)激反應(yīng) ROS的產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有雙面性[15]，高水平、大劑量ROS因具有強(qiáng)氧化性，因此殺傷作用強(qiáng)，最終可導(dǎo)致不可逆性損傷、癌變[16]或者促進(jìn)腫瘤的存活[17]，在強(qiáng)侵襲性、容易轉(zhuǎn)移、不易根治的腫瘤疾病中表達(dá)增強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞受到微環(huán)境刺激或抗氧化系統(tǒng)失調(diào)生成ROS過(guò)量時(shí)[18]，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生可破壞大分子生物的完整性，引起細(xì)胞損傷，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的線粒體DNA具有損傷作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]、壞死、衰老以及增殖阻滯[21]。

1.3.2輕度氧化應(yīng)激反應(yīng) 低水平、小劑量的ROS是機(jī)體內(nèi)普遍存在的一種生理形式，發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，可作為生物的第二信使，對(duì)支持細(xì)胞生命活動(dòng)起重要作用，通常以可逆化氧化蛋白巰基基團(tuán)作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，使生成和清除的ROS維持動(dòng)態(tài)平衡[22]。ROS的清除主要依賴于非酶類抗氧化分子(組氨酸)和ROS清除酶(超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶)[23]。

1.4ROS常見(jiàn)的檢測(cè)手段

1.4.1直接檢測(cè)法 由于單線態(tài)氧的活性壽命極短，產(chǎn)量低，不易檢測(cè)，目前直接檢測(cè)方法主要包括帶濾光片的近紅外光譜分析儀和以磷光體作為熒光屏的近紅外光光電倍增管掃描儀(原理是檢測(cè)1 270 nm時(shí)單線態(tài)氧發(fā)出的磷光)。帶濾光片的近紅外光譜分析儀根據(jù)記錄時(shí)間的長(zhǎng)度分為多通道計(jì)數(shù)法、門控光子計(jì)數(shù)法以及時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)法。多通道計(jì)數(shù)法因具有采集時(shí)間短、范圍廣、時(shí)間精準(zhǔn)(可精確到1 ns)等特點(diǎn)，是主要的檢測(cè)方法[24]。

1.4.2間接檢測(cè)法 間接檢測(cè)法以探針(熒光探針、化學(xué)發(fā)光探針)作為主要手段進(jìn)行熒光檢測(cè)，但存在細(xì)胞毒性，因間接檢測(cè)探針能與其他蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。目前市面上常用的探針包括9,10-蒽二丙酸熒光探針[25]、1,3-二苯基異苯并呋喃熒光探針以及紅色線粒體超氧化物熒光探針等，其中紅色線粒體超氧化物熒光探針是常見(jiàn)的測(cè)量超氧化物的熒光探針[26]。化學(xué)發(fā)光探針通過(guò)與單線態(tài)氧的結(jié)合迅速發(fā)光釋放能量，通過(guò)對(duì)發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)，得到單線態(tài)氧的含量。目前，含蒽衍生物發(fā)光探針是主流探針。

1.5ROS的不足 目前ROS的不足主要包括：①擴(kuò)散距離短，存在還未到達(dá)靶組織就被清除的可能性，且單線態(tài)氧在細(xì)胞微環(huán)境中的擴(kuò)散距離僅為45 nm，這種擴(kuò)散程度不足以穿透細(xì)胞單層膜結(jié)構(gòu)；②壽命短，單線態(tài)氧是最具破壞性的ROS，但在水溶劑中單線態(tài)氧的壽命僅為3.5 μs；③有氧環(huán)境對(duì)SDT中超聲激活聲敏劑產(chǎn)生ROS至關(guān)重要，因而是否存在有氧環(huán)境對(duì)SDT中ROS的療效影響較大；④ROS會(huì)被特定的淬滅劑作用產(chǎn)生淬滅，如D-甘露醇和疊氮鈉；⑤ROS的大量產(chǎn)生依賴于外界刺激(如光刺激)，但外界這種不正常的刺激會(huì)對(duì)人體造成傷害[27]。目前納米聲敏劑載體仍作為ROS靶向運(yùn)輸?shù)耐窇?yīng)用于SDT[28]。

2 ROS-SDT的作用

正常生理功能下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和代謝的ROS處于平衡穩(wěn)定狀態(tài)，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂、消除炎癥反應(yīng)，且不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。SDT采用的聲敏劑主要來(lái)源于PDT的光敏劑，光敏劑的靶向作用位點(diǎn)不同則作用機(jī)制不同。研究表明，當(dāng)光敏劑作用于線粒體時(shí)，極低量的PDT即可激發(fā)線粒體的呼吸傳遞鏈，使生成的ROS對(duì)細(xì)胞凋亡起到重要作用[29]。當(dāng)光敏劑的靶向位點(diǎn)為線粒體和溶酶體時(shí)，可激發(fā)細(xì)胞凋亡機(jī)制，使細(xì)胞發(fā)生凋亡；當(dāng)光敏劑的靶向位點(diǎn)為細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)，則會(huì)發(fā)生自噬現(xiàn)象；當(dāng)光敏劑的靶向位點(diǎn)為細(xì)胞膜時(shí)，則直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡[30-31]。血卟啉單甲醚是應(yīng)用較廣的聲敏劑，超聲與血卟啉單甲醚結(jié)合時(shí)，可產(chǎn)生ROS，進(jìn)而激活胱天蛋白酶(caspase)-3、caspase-9、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)等通路，誘導(dǎo)DNA斷裂、促凋亡細(xì)胞高表達(dá)[32]。

2.1ROS-SDT的功能性效應(yīng) SDT中ROS的生成是基于SDT超聲空化作用中的慣性空化效應(yīng)。超聲空化作用是一種獨(dú)特的物理現(xiàn)象，是超聲作用于液態(tài)組織時(shí)產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)過(guò)程?？栈饔米鳛镾DT的主流效應(yīng)，可分為兩種類型，即非慣性(穩(wěn)定)空化效應(yīng)和慣性(瞬態(tài))空化效應(yīng)[33]。在穩(wěn)定空化下，超聲的頻率占主要因素，氣泡直徑的變化甚微，主要表現(xiàn)為產(chǎn)生的氣泡不會(huì)劇烈變化導(dǎo)致坍塌，且存在周期較長(zhǎng)；氣泡以被迫振動(dòng)為主要振動(dòng)方式，在外界環(huán)境的改變下，膜滲透性增高[34]。在慣性空化中，液體氣泡吸收大量的超聲能量，且在極短的時(shí)間內(nèi)急劇釋放，氣泡先收縮后膨脹至其共振尺寸的2～3倍，最后壓縮在半周內(nèi)，可在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生高熱，經(jīng)歷強(qiáng)烈超聲的輻射，形成自由基[1]。當(dāng)細(xì)胞受到外源性的強(qiáng)烈刺激時(shí)，會(huì)對(duì)自身結(jié)構(gòu)和支持代謝的酶產(chǎn)生不可逆性的損傷[35-36]。同時(shí)，為了提高SDT的治療效果，需要對(duì)超聲的頻率、強(qiáng)度及聲敏劑的靶向性更加關(guān)注。

因?qū)χ車M織的損傷情況不同，穩(wěn)定空化效應(yīng)是目前研究的重點(diǎn)生物學(xué)效應(yīng)，這使得低頻、低強(qiáng)度(<1 MHz、3 W/cm2)的超聲成為主流。SDT可激活Bax/Bcl-2異二聚體或Bax/Bax同源二聚體、Fas/FasL信號(hào)通路的高表達(dá)以及caspase-8和caspase-3升高等一系列變化[37]。以上生物學(xué)效應(yīng)導(dǎo)致組織中的水分子裂解產(chǎn)生自由基(如羥基自由基、單線態(tài)氧)等ROS，這些物質(zhì)聯(lián)合聲敏劑及超聲協(xié)同殺滅靶細(xì)胞[38]。ROS可以損傷脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的特性，表明SDT下產(chǎn)生的ROS在細(xì)胞水平上產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)性改變。

2.2ROS-SDT的作用機(jī)制 首先，SDT誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，使線粒體膜電位下調(diào)，導(dǎo)致線粒體不能進(jìn)行正常的氧化磷酸化和腺苷三磷酸的合成步驟，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。其次，SDT的激發(fā)使線粒體膜上的Bax高表達(dá)和Bcl-2低表達(dá)，Bax與Bcl-2呈拮抗關(guān)系，Bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2起到抑制細(xì)胞凋亡的作用，Bax通過(guò)形成Bax/Bcl-2異二聚體或Bax/Bax同源二聚體方式增加線粒體膜的通透性，導(dǎo)致內(nèi)源性凋亡的可能；同時(shí)，SDT的存在使線粒體生物膜上鈣離子含量增高呈過(guò)載狀態(tài)，當(dāng)鈣離子含量超過(guò)閾值時(shí)，細(xì)胞膜破裂并不再完整[39]。線粒體膜電位的降低可促進(jìn)ROS生成，產(chǎn)生細(xì)胞毒性[7]。這些均證明SDT對(duì)ROS的產(chǎn)生具有正向促進(jìn)作用。

2.3SDT介導(dǎo)ROS產(chǎn)生的過(guò)程 SDT介導(dǎo)ROS產(chǎn)生的過(guò)程主要包括：①生物相容性良好的聲敏劑先與靶組織結(jié)合；②超聲在特定區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生機(jī)械效應(yīng)；③超聲與聲敏劑相結(jié)合產(chǎn)生空化現(xiàn)象、熱效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng)，使介質(zhì)震蕩，同時(shí)超聲照射靶組織；④短時(shí)間內(nèi)的局部高壓環(huán)境使介質(zhì)中的氣泡崩塌，產(chǎn)生大量熱能、羥基自由基陰離子和氫離子[40]；⑤聲敏劑同崩塌的細(xì)胞相結(jié)合產(chǎn)生電子躍遷，電子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，伴隨能量的釋放，產(chǎn)生殺死靶細(xì)胞的ROS物質(zhì)[7]；⑥ROS產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞核酸、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)損傷[25]。

2.4ROS在SDT中的應(yīng)用 SDT作為一種安全、無(wú)創(chuàng)、無(wú)毒的新型療法，在臨床中應(yīng)用廣泛。SDT作為PDT的延伸，使用特定的、對(duì)周圍組織不產(chǎn)生損害的聲波來(lái)代替PDT中的光波，增加了定位準(zhǔn)確性。同時(shí)，使用特定頻率、波長(zhǎng)及強(qiáng)度的超聲與集聚在靶組織中的聲敏劑相結(jié)合形成的SDT可以彌補(bǔ)單純超聲及PDT的局限性。Li等[41]對(duì)荷瘤小鼠模型腫瘤安全消融的研究表明，當(dāng)黑磷[42]納米片作為聲敏劑載體時(shí)，可產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)性的羥基自由基陰離子，與外界環(huán)境添加的過(guò)氧化物產(chǎn)生協(xié)同作用，在黑磷納米片上生成ROS；以2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽作為ROS敏感熒光探針，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在53 kHz、0.14 W/cm2的超聲和0.05 mg/L的黑磷納米片作用下單線態(tài)氧和過(guò)氧化物均高表達(dá)，腫瘤體積顯著縮小。Li等[43]以硫化銀作為聲敏劑，以紅細(xì)胞(在哺乳動(dòng)物體內(nèi)能進(jìn)行氧氣運(yùn)輸，具有過(guò)氧化氫酶的特性，可避免產(chǎn)生有毒物質(zhì))作為載體作用于腫瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示，在SDT刺激下腫瘤內(nèi)的氧分子轉(zhuǎn)化為氧自由基和單線態(tài)氧，可有效消除腫瘤，提高小鼠存活率。Yang等[44]以全氟戊烷為核心，將血卟啉單甲醚與葉酸(folate，F(xiàn)A)結(jié)合到含有磷脂的細(xì)胞膜中作為聲敏劑與納米脂質(zhì)體(nanodroplets，NDs)相結(jié)合形成FA-H@NDs系統(tǒng)，并通過(guò)光聲成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A-H@NDs系統(tǒng)經(jīng)聲致相變后轉(zhuǎn)變成氣泡，進(jìn)一步增強(qiáng)了超聲和納米脂質(zhì)體的穿透能力，同時(shí)FA-H@NDs系統(tǒng)在超聲照射下可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致人卵巢癌SKOV3細(xì)胞抑制率顯著增高，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞和組織凋亡、壞死，表明SDT介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS對(duì)腫瘤的治療效果顯著。

3 小 結(jié)

ROS主要存在于生物自身組織細(xì)胞中，小劑量的ROS并不能對(duì)機(jī)體細(xì)胞代謝產(chǎn)生負(fù)向作用。SDT主要通過(guò)超聲機(jī)械壓力、超聲與聲敏劑結(jié)合產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、空化效應(yīng)三者協(xié)同破壞靶細(xì)胞。SDT是繼傳統(tǒng)手術(shù)療法、藥物療法后最具潛力的療法。SDT因聲敏劑選擇的差異性、超聲的強(qiáng)度、頻率參數(shù)的不同以及對(duì)熱效應(yīng)與空化效應(yīng)檢測(cè)的缺失性而具有限制性。未來(lái)應(yīng)明確ROS產(chǎn)生與SDT機(jī)械效應(yīng)的機(jī)制，優(yōu)化空化效應(yīng)，以減少其他不必要的機(jī)械效應(yīng)對(duì)能量的削弱。