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    羅哌卡因調(diào)控PI3K/Akt信號通路影響宮頸癌細胞HeLa的生物學行為

    2021-12-01 07:29:00陳麗娟張宏張健鄧大立吳瑕
    中國計劃生育和婦產(chǎn)科 2021年11期
    關(guān)鍵詞:可抑制羅哌卡因

    陳麗娟,張宏,張健,鄧大立,吳瑕

    宮頸癌是全球女性癌癥死亡的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計,全球每年約有新增宮頸癌患者50萬例,并有30萬人死于宮頸癌[1]。早期宮頸癌可通過手術(shù)切除治愈,但宮頸癌患者多為晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移,且放化療未能取得理想效果,患者預后較差[2-4]。因此,尋找新的宮頸癌治療策略至關(guān)重要。羅哌卡因是一類長效局麻藥,可用于減少急性、慢性和癌癥疼痛[5]。羅哌卡因和舒芬太尼的聯(lián)用可有效減輕宮頸癌根治術(shù)術(shù)后疼痛,是婦科手術(shù)理想的鎮(zhèn)痛方法[6]。最近研究發(fā)現(xiàn),羅哌卡因可抑制乳腺癌、結(jié)腸癌細胞增殖以及結(jié)腸癌皮下瘤的生長,具有抗腫瘤作用[7-8]。但羅哌卡因?qū)m頸癌生物學行為的影響尚不清楚。本研究探討了羅哌卡因?qū)m頸癌HeLa細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響,初步分析其潛在分子機制,現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    HeLa細胞購于上海通派生物科技有限公司;青鏈霉素雙抗溶液購于北京索萊寶生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Hyclone公司;CCK-8試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司;羅哌卡因(CAS號:98717-15-8,純度98%)購于上海研生實業(yè)有限公司;Transwell小室和基質(zhì)膠購于美國Corning公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma公司;RIPA裂解液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購于上海碧云天公司;山羊抗兔IgG、細胞周期依賴性激酶4(Cycle-dependent kinase 4,CDK4)兔單克隆抗體、MMP-2兔多克隆抗體、Bcl2兔單克隆抗體、Bax兔單克隆抗體購于美國Abcam公司;Akt兔多克隆抗體以及β-actin、p-Akt兔單克隆抗體購于美國CST公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) HeLa細胞接中含DMEM培養(yǎng)基(添加10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素雙抗溶液)培養(yǎng)瓶在37℃,CO2體積分數(shù)5%的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),每兩天更換一次培養(yǎng)液,當細胞融合度約為80%時,用胰酶消化傳代。

    1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活力 按照每孔5×103個細胞數(shù)(100 μL)的密度將對數(shù)生長期HeLa接種于96孔板,貼壁后,棄去細胞培養(yǎng)基,用含不同濃度(0、100、200和400 μg/mL)羅哌卡因的DMEM培養(yǎng)液(100 μL/孔)培養(yǎng)HeLa細胞48 h,參考CCK-8試劑盒加入CCK-8試劑。全自動酶標儀檢測各孔細胞在450 nm波長處的吸光度(A)值。

    1.2.3 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲 侵襲實驗:用DMEM培養(yǎng)基按照1∶8比例稀釋Matrigel,取50 μL均勻鋪于于Transwell小室膜表面,4℃風干。收集羅哌卡因(400 μg/mL)處理48 h的HeLa細胞和正常培養(yǎng)的HeLa細胞,胰酶消化細胞后,磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次,用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸使細胞濃度為2×105個/mL。向Transwell上室加入200 μL細胞懸液,取500 μL含DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)加入向24孔板下室,常規(guī)培養(yǎng)24 h,用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞,用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,隨后將Transwell小室倒置于顯微鏡下隨機選取5個視野進行觀察、拍照、計數(shù),以5個視野細胞數(shù)平均值表示侵襲細胞數(shù)目。遷移實驗用未包被基質(zhì)膠的小室,其他步驟參考侵襲實驗。

    1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 胰酶消化羅哌卡因(400 μg/mL)處理48 h的HeLa細胞和正常培養(yǎng)的HeLa細胞,磷酸鹽緩沖液沖洗細胞2次,用1×結(jié)合緩沖液調(diào)整為細胞濃度為1×106個/mL。參照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒使用說明分別加入Annexin V-FITC和PI,室溫避光反應15 min,1 h內(nèi)上機檢測細胞凋亡情況。

    1.2.5 Western bot檢測CDK4、MMP-2、Bcl2、Bax以及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路相關(guān)蛋白的表達水平 收集羅哌卡因(400 μg/mL)處理48 h的HeLa細胞和正常培養(yǎng)的HeLa細胞,RIPA緩沖液裂解細胞,15 000 rpm離心10 min獲得的上清液即為細胞總蛋白。將適量細胞蛋白與等體積的1×上樣緩沖液混合,100℃沸水浴3 min變性細胞蛋白。按照每孔30 μg加樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白分離后利用半干轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜。將膜置于孵育盒內(nèi),4℃下用5%脫脂牛奶封閉膜過夜。TBST洗膜后,室溫下分別加入CDK4(1∶2 000)、MMP-2(1∶500)、Bcl2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、p-Akt(2∶1 000)、Akt(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗體孵育膜2 h,TBST洗膜10 min×3次。用Ⅱ抗孵育1 h后,TBST洗膜10 min×3次。化學發(fā)光法顯影后,以β-actin為內(nèi)參,Graphpad軟件分析目的條帶的灰度值。

    1.3 統(tǒng)計學分析

    2 結(jié)果

    2.1 羅哌卡因?qū)m頸癌HeLa細胞和正常宮頸細胞Ect1/E6E7增殖的影響

    采用不同濃度羅哌卡因處理HeLa細胞和Ect1/E6E7細胞48 h,CCK-8法檢測細胞增殖活力,結(jié)果顯示,與0 μg/mL組比較,100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL組HeLa細胞的增殖活力顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),隨著羅哌卡因濃度增加,其對HeLa細胞的增殖抑制作用逐漸增加;與0 μg/mL組比較,400 μg/mL組Ect1/E6E7細胞的增殖活力顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),100 μg/mL、200 μg/mL組Ect1/E6E7細胞的增殖活力沒有明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳見表1,表明羅哌卡因?qū)eLa細胞有抑制作用且在較低濃度時對Ect1/E6E7細胞沒有明顯的細胞毒作用,選擇較低濃度的200 μg/mL進行后續(xù)實驗。

    表1 不同濃度羅哌卡因?qū)eLa細胞增殖的影響

    2.2 羅哌卡因?qū)eLa細胞遷移和侵襲的影響

    采用200 μg/mL羅哌卡因處理HeLa細胞48 h,Transwell法檢測HeLa細胞遷移和侵襲能力,結(jié)果顯示,與對照組比較,羅哌卡因處理組HeLa細胞的遷移和侵襲數(shù)目顯著減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1和表2。提示羅哌卡因可抑制HeLa細胞遷移和侵襲。

    圖1 羅哌卡因?qū)eLa細胞遷移和侵襲的影響

    表2 羅哌卡因?qū)eLa細胞遷移和侵襲的影響

    2.3 羅哌卡因?qū)eLa細胞凋亡的影響

    采用200 μg/mL羅哌卡因處理HeLa細胞48 h,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,結(jié)果顯示,與對照組比較,羅哌卡因處理組HeLa細胞凋亡率顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見表3和圖2。提示羅哌卡因可促進HeLa細胞凋亡。

    圖2 羅哌卡因?qū)eLa細胞凋亡的影響

    表3 羅哌卡因?qū)eLa細胞凋亡的影響

    2.4 羅哌卡因?qū)eLa細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

    采用200 μg/mL羅哌卡因處理HeLa細胞48 h,Western blot檢測CDK4、Bcl-2、MMP-2和Bax蛋白表達水平,結(jié)果顯示,羅哌卡因處理組HeLa細胞CDK4、MMP-2、Bcl-2蛋白的表達水平與對照組比較顯著降低,而Bax蛋白的表達水平與對照組比較顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

    圖3 羅哌卡因?qū)eLa細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達的影響

    2.5 羅哌卡因?qū)eLa細胞PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

    采用200 μg/mL羅哌卡因處理HeLa細胞48 h,Western blot分析PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt蛋白表達水平,結(jié)果顯示,與對照組比較,羅哌卡因處理組HeLa細胞總PI3K和Akt蛋白的表達水平變化無統(tǒng)計學意義,p-PI3K和p-Akt的表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4。提示羅哌卡因可抑制HeLa細胞PI3K/Akt信號通路活化。

    圖4 Western blot檢測羅哌卡因?qū)eLa細胞 PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

    3 討論

    羅哌卡因是單一對映結(jié)構(gòu)體長效酰胺類局麻藥,已廣泛用于介入性手術(shù)。最近研究發(fā)現(xiàn),在進行腫瘤切除術(shù)時使用局部麻醉可以減少癌癥復發(fā),提高生存率[5]。一定濃度的局部麻醉藥可抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移,促進細胞凋亡[9]。本研究擬探討羅哌卡因?qū)m頸癌HeLa細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響和其潛在的分子機制。

    近年來,羅哌卡因在癌癥研究中的作用受到越來越多的關(guān)注。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因可抑制肝癌細胞活力,并通過破壞線粒體功能激活caspase-3信號通路促進肝癌細胞凋亡;Yang等[11]研究表明羅哌卡因通過下調(diào)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2磷酸化水平對胃癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用,但對細胞的侵襲能力無明顯影響;然而,羅哌卡因通過抑制Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1/jun激酶/樁蛋白/黏著斑激酶(Rac1/JNK/paxillin/FAK)通路卻具有強大的抗食管鱗癌細胞遷移作用[12]。本研究結(jié)果顯示,羅哌卡因可顯著抑制HeLa細胞增殖活力,隨著羅哌卡因濃度的增加,其對HeLa細胞的增殖抑制作用逐漸增強。同時,羅哌卡因還可顯著抑制HeLa細胞的遷移和侵襲能力,促進HeLa細胞凋亡。CDK4是在G1期中發(fā)揮重要作用,CDK4通過與Cyclin D1結(jié)合形成CDK4/Cyclin D1復合物促進細胞周期向S期推進,促進細胞過度增殖,抑制CDK4表達可抑制腫瘤發(fā)生[13]。基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)可降解細胞外基質(zhì),參與細胞信號傳導,在宮頸癌轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白表達減少,Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)表達增多是細胞凋亡的主要特征。本研究顯示,羅哌卡因作用于HeLa細胞,能夠抑制CDK4、MMP-2和Bcl2蛋白表達,促進Bax蛋白表達,與功能實驗結(jié)果一致。提示羅哌卡因?qū)eLa細胞具有抑制增殖、遷移和侵襲,促進凋亡的作用。

    PI3K/Akt途徑是調(diào)控多種生物過程的重要通路,它在許多癌癥中異常活躍。PI3K/Akt信號通路的激活可促進細胞周期進程,減少凋亡并促進癌細胞的遷移[14]。在宮頸癌中PI3K/Akt通路經(jīng)常發(fā)生失調(diào),抑制PI3K/Akt通路可抑制宮頸癌細胞的生長和遷移[15-16]。Zheng等[17]研究顯示羅哌卡因通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制慢性髓系白血病的生長和存活。本研究結(jié)果顯示,羅哌卡因可降低HeLa細胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達,抑制PI3K/Akt信號通路活化,推測羅哌卡因可能通過抑制PI3K/Akt通路進而在宮頸癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。

    綜上,羅哌卡因可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移、侵襲,誘導細胞凋亡,其機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路激活有關(guān)。本研究闡明了羅哌卡因?qū)m頸癌細胞生物學行為的影響,為羅哌卡因在宮頸癌治療中的應用奠定了理論基礎(chǔ)。

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