內質網(wǎng)應激在卵巢衰老中的研究進展

伏玉潔，張學紅

卵巢是女性對老化最為敏感的器官，伴隨個體年齡增長的卵巢功能衰退為生理性卵巢衰老，年齡是預測生育力的粗標準，是預測自然受孕或體外受精-胚胎移植成功概率的基本指標[1]。而由于遺傳和環(huán)境等因素作用導致的卵巢功能提前衰退即非生理性卵巢衰老，其發(fā)生與年齡無直接關系。內質網(wǎng)是負責幾種特定細胞功能的主要細胞器，這些功能包括細胞表面蛋白的合成、折疊、修飾、運輸和分泌，脂質代謝和Ca2+存儲。在蛋白質的生產(chǎn)過程中，幾個內質網(wǎng)特異性分子可感應合成蛋白質的數(shù)量和質量，以及是否正確折疊成其天然結構。在此過程中，未折疊或錯誤折疊的蛋白質在內質網(wǎng)內腔中的過多積累會導致內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。為了應對增加的折疊需求，細胞激活了未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)，UPR能夠在轉錄翻譯水平上維持內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，減少未折疊蛋白及錯誤折疊蛋白的合成[2]。UPR最初是一種細胞的保護性反應，是細胞針對有害刺激而產(chǎn)生的自身代償性行為。過度UPR影響細胞內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，持續(xù)的功能紊亂會誘發(fā)細胞死亡，從而導致各種疾病的發(fā)生。慢性ERS是諸多疾病的主要病因，包括神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、癌癥和代謝性疾病[3]。ERS是與炎癥和氧化應激密切相關的局部因素，也是組織纖維化中促纖維化重構的重要決定因素[4]。越來越多的證據(jù)表明，UPR與卵巢發(fā)育和功能的發(fā)揮之間存在聯(lián)系，包括卵泡生長和成熟，卵泡閉鎖和黃體生成。另外，在病理條件下，ERS和UPR在卵巢中也可能起重要作用[5]。本文主要對ERS在卵巢生理和病理中的雙重作用進行綜述，為診斷和治療卵巢衰老潛在作用靶點提供新的思路。

1 內質網(wǎng)應激

UPR信號是由3個ERS調節(jié)蛋白所介導的，分別是肌醇需求激酶1(inositol requiring protein 1，IRE1)、蛋白激酶R樣內質網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase,PERK)、激活轉錄因子-6(activating transcription factor 6，ATF6)[6]。如PERK被激活后通過磷酸化真核轉錄起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)，從而抑制核糖體組裝來整體抑制蛋白合成，同時還上調激活轉錄因子-4(activating transcription factor 4，ATF4)，來誘導細胞穩(wěn)態(tài)基因的表達，并激活轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)等促凋亡因子。另外，ATF4亦可以誘導激活轉錄因子-3(activating transcription factor 3，ATF3)的表達，繼而通過結合組蛋白脫乙?；敢种苹蜣D錄。正常狀況下，內質網(wǎng)標志性伴侶蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78 kDa(glucose-regulated protein 78 kDa，GRP78)又稱重鏈免疫球結合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BIP)，主要和IRE1、PERK、ATF6穩(wěn)定結合，呈現(xiàn)封閉UPR的無活性狀態(tài)，GRP78參與了內質網(wǎng)的大部分功能，其中重要的一點是，幫助蛋白質新生肽鏈折疊[7-8]。當內質網(wǎng)中錯誤折疊或未折疊蛋白量超過了積累的閾值，GRP78就會與內質網(wǎng)跨膜傳感器分離，并激活所有傳感器介導的信號通路。但超負荷的ERS會啟動細胞凋亡途徑，ERS繼發(fā)細胞凋亡主要有3條通路：C-Jun氨苯末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)通路、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶12(cysteine aspartic acid specific protease 12，Caspase12)凋亡通路和CHOP相關通路[6]。

2 內質網(wǎng)應激與顆粒細胞

卵巢顆粒細胞是指包繞在卵母細胞外圍的細胞層，是卵母細胞基本的供能細胞。作為卵巢組織內最重要的體細胞，卵巢顆粒細胞和卵泡液構成了卵母細胞最主要的微環(huán)境，其與卵母細胞之間存在著廣泛、緊密、復雜的多重聯(lián)系[9]。顆粒細胞的凋亡對于優(yōu)勢卵泡的選擇非常關鍵，影響著正常卵巢功能的發(fā)揮[10]。如Luman募集因子(Luman recruiting factor，LRF)可能通過ERS途徑參與誘導顆粒細胞凋亡，并且可能在小鼠卵泡選擇中起關鍵作用[11]。ERS途徑參與誘導的顆粒細胞凋亡與卵泡閉鎖密切相關，凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)主要位于顆粒細胞中，在卵泡閉鎖過程中，AIF的表達顯著增加。AIF介導Caspase依賴性細胞凋亡并引起染色質固縮和DNA片段化，而AIF耗竭或AIF基因的敲除可以保護ERS介導的山羊顆粒細胞凋亡。AIF可能是卵泡閉鎖過程中的關鍵因素[9]。Sigma-1受體在卵巢組織廣泛表達，參與卵巢功能的調節(jié)。Sigma-1受體蛋白與GRP78緊密結合，發(fā)揮促進蛋白正確折疊、調節(jié)細胞增殖活性、維持內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)等多重保護效應[12]。卵巢儲備功能低下患者顆粒細胞中Sigma-1受體表達量下降伴隨著細胞凋亡率的上升。在卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)體系中，通過激活Sigma-1受體，調控ERS誘導的細胞凋亡通路，可改善細胞凋亡狀態(tài)，這可為卵巢儲備功能下降疾病的病因探討及患者臨床治療提供新的思路[1]。

ERS是與炎癥密切相關的局部因素[4]。脂多糖處理可誘導小鼠顆粒細胞內ERS和血清雌激素水平降低。通過抑制炎癥反應可減少ERS的激活并減少血清雌激素水平的降低[13]。子宮內膜異位癥患者顆粒細胞中的衰老表型和ERS加劇[14]。褪黑激素給藥可在體內外改善子宮內膜異位癥患者卵巢顆粒細胞的中細胞衰老表型以及線粒體膜電位和三磷酸腺苷的異常，并在體外通過抑制ERS標記GRP78和CHOP,從而改善小鼠卵巢顆粒細胞生存能力[15]。ERS也是與氧化應激密切相關的局部因素[4]。跨膜結構和卷曲螺旋結構域1蛋白(transmembrane and coiled-coil domain，TMCO1)是一種內質網(wǎng)跨膜蛋白，可主動防止Ca2+儲備過多。TMCO1基因敲除小鼠(TMCO1 -/-)表現(xiàn)出卵巢卵泡逐漸喪失，卵巢卵泡發(fā)育受損和亞生育力，其表型類似于女性的卵巢早衰。TMCO1 -/-小鼠顆粒細胞中ERS介導的細胞凋亡增加和活性氧水平升高，表明TMCO1缺乏引起顆粒細胞功能障礙，從而導致卵巢卵泡發(fā)育受損[16]。

在生殖毒理學研究中發(fā)現(xiàn)，一種來自鐮刀菌真菌的非甾體類雌激素霉菌毒素，玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)以劑量依賴性方式降低卵巢顆粒細胞的細胞活力并增加細胞凋亡，ZEA通過上調與ERS相關的蛋白GRP78，HERP和CHOP來激活ERS。而內質網(wǎng)膜蛋白HERP的耗竭通過自噬激活和凋亡抑制作用從而阻止ZEA誘導的卵巢顆粒細胞凋亡[17]。毒胡蘿卜素(thapsigargin，Tg)在體外通過誘導山羊顆粒細胞系中的ERS，從而降低了孕酮的產(chǎn)生和類固醇生成酶的表達[18]。臨床研究發(fā)現(xiàn)不育癥患者的卵泡液中存在較高水平的棕櫚酸，且具有顆粒細胞毒性，棕櫚酸影響了細胞增殖，凋亡和ERS標志物，如降低了顆粒細胞中磷酸化蛋白激酶B(一種抗凋亡相關蛋白)水平并增加了caspase-3和CHOP的表達水平[19]。

人胎盤來源的間充質干細胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells，hPMSCs)的移植通過抑制ERS的IRE1α信號通路誘導的顆粒細胞凋亡，從而改善自身免疫性卵巢早衰小鼠的卵巢衰竭，有助于卵巢功能恢復[20]。順鉑誘導的ERS可能促進顆粒細胞的自噬和凋亡，從而引起過多的卵泡丟失和內分泌失調。用4-苯基丁酸減輕ERS，可以防止順鉑誘導的顆粒細胞凋亡和卵巢損傷。因此，在女性化療期間，4-苯基丁酸可用于保護卵巢。研究結果可作為確定由化療引起的卵巢損傷的潛在病理生理學的參考點，并可能提供潛在的藥物治療選擇[21]。

3 內質網(wǎng)應激與卵泡生長、成熟、閉鎖

內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)在卵巢卵泡形成，卵丘細胞存活，卵丘-卵母細胞復合體相互作用以及卵母細胞質量中起著至關重要的作用[22]。UPR在卵泡生長過程中被激活，參與卵泡生長和成熟、卵泡閉鎖和胚胎植入等過程[18,23]。在32周齡小鼠的生發(fā)泡(GV)階段卵母細胞中，ERS相關基因(包括AdipoR2，IRAK-1，RCAN1和MsrB1)顯著下調，表明ERS可能在卵母細胞衰老中發(fā)揮作用[24]。?；切苋パ跄懰?tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)通過減輕潛在的錯誤折疊蛋白質的聚集，以減輕ERS，作為化學伴侶參與導致細胞適應和存活的各種信號傳導途徑[25]。ERS的存在會損害牛卵母細胞復合物成熟過程中的發(fā)育能力，而這一過程可以被TUDCA逆轉[26]。卵母細胞體外成熟培養(yǎng)(in vitro maturation，IVM)系統(tǒng)證明TUDCA補充至培養(yǎng)基，可通過減輕ERS改善小鼠未成熟卵母細胞IVM后的胚胎發(fā)育[27]。在原代培養(yǎng)4～5代的衰老的小鼠卵巢表面上皮細胞中發(fā)生的UPR，這種細胞衰老可通過TUDCA緩解[28]。

糖化是細胞衰老的主要原因。人的半乳糖1磷酸尿嘧啶轉移酶(galactose-1 phosphate uridylyltransferase，GalT)活性降低會導致經(jīng)典半乳糖血癥，而GalT缺乏癥(GalT -/-)小鼠與患者具有相似的臨床特征，如表現(xiàn)為亞生育力和小腦共濟失調。GalT -/-小鼠卵巢組織顯示ERS標記物，GRP78升高，并且經(jīng)典的抗凋亡、促存活的通路磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號下調。突變體中原始卵泡的數(shù)量減少，從而重現(xiàn)了人類患者中卵巢加速老化的現(xiàn)象[29]。口服化合物Salubrinal(eIF2α磷酸酶抑制劑)可導致卵巢GRP78表達降低，挽救PI3K/Akt信號傳導，并使GalT -/-小鼠卵巢組織中的原始卵泡數(shù)量增加一倍。Salubrinal以通過ERS調節(jié)蛋白PERK介導的相關作用來防止半乳糖血癥引起的原始卵泡丟失，并且這種方式的干預顯著改善卵巢功能，提高生育能力和生殖力[29]。卵泡中晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)影響濾泡微環(huán)境，在含有卵母細胞的卵泡中，卵泡液中游離AGEs的含量增加，可導致卵母細胞發(fā)育為形態(tài)不良的胚胎，并且AGEs通過激活UPR因子ATF4刺激了顆粒細胞中IL-6和IL-8的產(chǎn)生。卵泡中AGEs的積累通過激活卵泡微環(huán)境中的ERS而觸發(fā)炎癥，從而降低了卵母細胞的能力。ERS可能是潛在的治療靶點，可改善表現(xiàn)出AGEs卵巢積聚患者的卵母細胞發(fā)育能力[30]。

生殖毒理學研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸影響豬卵母細胞中組蛋白修飾和表觀遺傳標記，細胞凋亡和ERS標志物，從而損害體外生長的卵母細胞的發(fā)育能力[19]。在小鼠卵丘-卵母細胞復合物中，脂肪酸誘導的ERS會損害蛋白質分泌和線粒體活性，從而導致異常的胚胎發(fā)育，這種異?？杀籈RS抑制劑逆轉[31]。殼聚糖納米顆粒(chitosan nanoparticle,CSNP)用作藥物或基因傳遞載體。CSNPs可以被內化到小鼠胚泡中，例如透明帶、玻璃體周間隙和細胞質。CSNPs誘導的ERS會同時增加GRP78，CHOP，ATF4，PERK和IRE1 mRNA的表達水平以及活性氧。此外，CSNPs顯示出雙膜和多膜自噬囊泡，并導致囊胚細胞死亡。相反，雷帕霉素(作為治療細胞增殖和應激反應的重要調節(jié)劑)的治療減少了CSNPs誘導的線粒體Ca2+超載、細胞凋亡、氧化應激、ERS和自噬。雷帕霉素治療可以改善CSNPs誘導的植入前胚胎發(fā)育缺陷。這項研究的數(shù)據(jù)將有助于了解這些CSNP的毒性，并使更安全的納米材料得以生物工程化[32]。

ERS是與氧化應激密切相關的局部因素。褪黑激素可通過降低氧化應激誘導的ERS來保護其免受表柔比星誘導的卵巢損害?；熢黾幽[瘤患者存活并降低復發(fā)，但它會誘發(fā)卵巢損傷，并導致化療引起的閉經(jīng)，探索機制并確定針對化療期間卵巢毒性的保護劑是當務之急[33-34]。在經(jīng)衣霉素(5μg/ mL，22小時)預處理的豬成熟卵丘-卵母細胞復合物中添加褪黑激素(0.1μmol/ L)可恢復減數(shù)分裂成熟率和大多數(shù)UPR標記物(GRP78，ATF4，ATF6和CHOP)的表達。體現(xiàn)了褪黑激素在豬卵母細胞體外培養(yǎng)過程中對UPR信號通路的調節(jié)和減少ERS中的作用[35]。

靜脈內將人類內皮祖細胞(human endothelial progenitor cells,hEPCs) 給藥到老年小鼠中，通過遷移，歸巢到目標組織、整合新血管形成促進血管修復，可減少炎癥、ERS和凋亡，從而增強胚胎發(fā)育和卵母細胞質量。hEPCs處理的老年小鼠的卵裂和胚泡形成率以及囊胚中細胞數(shù)量的增加證明了hEPCs對生殖衰老具有保護作用。hEPCs雖不能挽救因衰老而丟失的卵母細胞，但可以顯著延遲與年齡有關的生育能力下降[36]。

4 結語與展望

ERS在卵巢顆粒細胞和卵泡液構成的卵母細胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持、卵泡發(fā)育的不同階段中起到了重要的作用，ERS與炎癥、氧化應激等局部因素協(xié)調作用，對顆粒細胞的凋亡、卵母細胞發(fā)育和雌孕激素的分泌調控有著重要的影響。隨著不同因素導致卵母細胞數(shù)量減少和質量的下降，激活ERS，加速了疾病的進程。反之，ERS也會通過若干機制來保護卵巢功能，具體機制還需進一步深入的分子生物學研究。盡管卵巢早衰的發(fā)病率逐年提高，但是導致該病進展的潛在機制還未被完全闡明，而ERS發(fā)生通路中的關鍵蛋白有望成為治療卵巢早衰的潛在作用靶點。隨著再生醫(yī)學的發(fā)展，干細胞給藥有望成為治療不育或化學療法等因素誘發(fā)的卵巢損傷的新策略?？笶RS或凋亡療法可能是延緩與年齡相關的不育癥的關鍵方法，從而為揭示某些生殖內分泌疾病的發(fā)病機理，探索新型治療方法，改善輔助生殖技術提供新的指導。