利用伯克霍爾德氏菌脂肪酶富集裂壺藻油脂中的二十二碳六烯酸

蘭 君，宋曉金，譚延振，徐建春，崔 球,4，馮銀剛,*

（1.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，青島市單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室，山東省能源生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；3.青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有限公司，山東 青島 266400；4.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101）

利用伯克霍爾德氏菌脂肪酶富集裂壺藻油脂中的二十二碳六烯酸

蘭 君1,2，宋曉金1，譚延振1，徐建春3，崔 球1,4，馮銀剛1,*

（1.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，青島市單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室，山東省能源生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；3.青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有限公司，山東 青島 266400；4.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101）

目的：研究伯克霍爾德氏菌胞外脂肪酶對(duì)裂壺藻油脂中二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）的富集作用。方法：用三丁酸甘油酯平板篩選法，篩選產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌；以對(duì)硝基苯月桂酸酯為底物，對(duì)篩選得到的伯克霍爾德氏菌脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究；用該脂肪酶水解裂壺藻油脂，通過(guò)氣相色譜法測(cè)定酶解后水相和有機(jī)相的脂肪酸組成來(lái)研究其對(duì)裂壺藻油脂DHA的富集作用。結(jié)果：從廣州的泥土樣品中分離獲得一株高產(chǎn)胞外脂肪酶的伯克霍爾德氏菌，在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中30 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)40 h后，脂肪酶酶活力達(dá)到最大值70 U/mL。脂肪酶粗酶液酶活性的最適溫度為45 ℃，最適pH值為8.5。該菌的脂肪酶對(duì)裂壺藻油脂中的DHA有一定的富集作用，能夠使油脂中DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從最初的30%升高到40%。結(jié)論：篩選得到一株能夠產(chǎn)生選擇性富集DHA的脂肪酶的細(xì)菌，拓寬了可用于多不飽和脂肪酸分離純化的脂肪酶的范圍。

脂肪酶；伯克霍爾德氏菌；裂壺藻；油脂；二十二碳六烯酸富集

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）屬ω-3多不飽和脂肪酸，是人體大腦和視網(wǎng)膜的重要組成部分[1-2]。DHA具有抗衰老、增進(jìn)大腦細(xì)胞發(fā)育、改善老年癡呆等作用，并且對(duì)于癌癥的治療有明顯促進(jìn)作用[3]，因而廣泛用作嬰幼兒奶粉、各種食品、飲料和保健品的添加劑，近些年來(lái)關(guān)于它的研究十分廣泛[4-5]。DHA主要來(lái)源于深海魚(yú)油和海洋微藻油[6]，其中裂壺藻（Aurantiochytrium sp.）因?yàn)槠渲舅峤M成相對(duì)簡(jiǎn)單，DHA含量較高等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注[7-8]。目前DHA的富集方法主要有分子蒸餾法、超臨界流體萃取法、尿素包合法等[9-10]，但普遍存在設(shè)備要求較高，操作成本較高，回收效率低下等缺點(diǎn)，而脂肪酶富集法由于具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、催化活性高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于油脂的處理[11]。文獻(xiàn)[12-14]已報(bào)道用于多不飽和脂肪酸純化的脂肪酶主要來(lái)源于酵母和霉菌，例如皺褶假絲酵母、米黑根毛霉、白地霉等。

之所以能用脂肪酶來(lái)富集DHA，主要是因?yàn)椴糠种久妇哂歇?dú)特的底物選擇性[15-16]。有的脂肪酶具有甘油位置選擇性，能優(yōu)先水解甘油1、3位置上的飽和和單不飽和脂肪酸，從而將DHA富集到甘油三酯的2位上；有的脂肪酶對(duì)?；兼溇哂羞x擇性，可以水解掉甘油任意位置的非ω-3多不飽和脂肪酸，從而使DHA以甘油酯形式得到富集[17-18]。不飽和脂肪酸碳鏈中存在碳碳雙鍵和全順式構(gòu)型，這些結(jié)構(gòu)引起了整個(gè)脂肪酸分子的彎曲，分子中靠近酯鍵的最末端甲基對(duì)脂肪酶的進(jìn)攻形成阻礙作用，而DHA獨(dú)特的6 個(gè)雙鍵加強(qiáng)了這種阻礙作用，使得脂肪酶難以接觸到DHA與甘油形成的酯鍵，而飽和和單不飽和脂肪酸不存在這種阻礙作用，很容易被水解。

Carvalho等[19]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，用Candida cylindracea脂肪酶在35 ℃條件下催化水解巴西沙丁魚(yú)油16 h后，能夠使甘油三酯中的DHA含量增加1.2 倍；Okada等[20]分別用游離的和固定化的Candida rugosa脂肪酶水解沙丁魚(yú)油，在經(jīng)過(guò)90 min的作用后，ω-3多不飽和脂肪酸從原來(lái)的38.1%分別上升到了65.3%和64.8%，其中DHA從最初的7.2%分別上升到了15.5%和15.3%；Mbatia等[21]研究用脂肪酶法富集尼羅河鱸魚(yú)內(nèi)臟油中的多不飽和脂肪酸，在用不同來(lái)源的脂肪酶進(jìn)行水解時(shí)，由于Candida rugosa脂肪酶沒(méi)有位置選擇性，能夠水解任意甘油位置的脂肪酸，因此能夠使得二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）和DHA的物質(zhì)的量百分含量分別提高1 倍和1.6 倍，而Thermomyces lanuginosus脂肪酶具有1、3位置選擇性，能夠使DHA的物質(zhì)的量百分含量提高3.2 倍。但總的來(lái)說(shuō)，有關(guān)細(xì)菌來(lái)源的脂肪酶用于DHA的富集研究較少。

本實(shí)驗(yàn)從來(lái)自廣州的泥土樣品中分離得到一株高產(chǎn)脂肪酶的菌株，用16S rDNA法初步鑒定為伯克霍爾德氏菌（命名為Burkholderia sp. SD001）。本實(shí)驗(yàn)對(duì)其脂肪酶的性質(zhì)做了初步研究，利用該菌株的脂肪酶粗酶液對(duì)裂壺藻油脂進(jìn)行酶解發(fā)現(xiàn)，它對(duì)DHA有一定的富集效果，在多不飽和脂肪酸的分離純化方面有一定的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

泥土樣品采于廣州沿海各地，置于無(wú)菌塑料袋備用；裂壺藻SD116藻種為本實(shí)驗(yàn)室保藏，－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)硝基苯月桂酸酯（4-nitrophenyl laurate，p-NPL）、三丁酸甘油酯 美國(guó)Sigma公司；正己烷（色譜純） 韓國(guó)Honeywell Burdick & Jackson公司；化學(xué)試劑無(wú)水乙醇等（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；pMD18-T質(zhì)粒 日本TaKaRa公司。

7890 A氣相色譜儀（配有450GC Solution自動(dòng)進(jìn)樣器） 美國(guó)Agilent公司；T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

從來(lái)自廣州沿海各地的泥土樣品中各稱(chēng)取1.0 g，加入9.0 mL無(wú)菌生理鹽水并混勻。取等體積懸濁液混勻后梯度稀釋?zhuān)坎加诤Y選培養(yǎng)基平板，25 ℃培養(yǎng)48 h后，觀(guān)察菌落周?chē)乃馊Υ笮?。水解圈與菌落圈直徑比為2～4時(shí)，表示該菌產(chǎn)脂肪酶能力越強(qiáng)，挑選其中水解圈直徑較大者分離純化進(jìn)行液體發(fā)酵并測(cè)定脂肪酶活力，得到脂肪酶活性最高的菌株。培養(yǎng)基條件參考文獻(xiàn)[22]稍作如下改動(dòng)，篩選培養(yǎng)基為：蛋白胨4 g/L、(NH4)2SO41.5 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 4 g/L、瓊脂20 g/L，三丁酸甘油酯乳化液（V（三丁酸甘油酯）∶V（40 g/L聚乙烯醇）= 1∶4，下同）12 mL/L，羅丹明B 1 mL/L。發(fā)酵培養(yǎng)基為：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、三丁酸甘油酯乳化液30 mL/L，NaCl 10 g/L。

1.2.2 16S rDNA的克隆與菌株鑒定

1.2.2.1 16S rDNA的克隆

基因組DNA提取按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（生工SK8725）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增引物為p27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和p1429r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃、10 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃、5 min，4 ℃直至溫度平衡結(jié)束?；厥誔CR產(chǎn)物并連接入pMD18-T質(zhì)粒中，送上海桑尼測(cè)序公司測(cè)序。

1.2.2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建與菌株鑒定

使用BLAST軟件[23]在線(xiàn)分析并下載GenBank中與所得16S rDNA一致的序列。利用MEGA5軟件[24]進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳學(xué)分析。采用Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)各分支的置信度由Bootstrap 1 000循環(huán)檢驗(yàn)。

1.2.3 產(chǎn)酶培養(yǎng)及酶活力的測(cè)定

1.2.3.1 脂肪酶粗酶液的制備

產(chǎn)酶培養(yǎng)基采用文獻(xiàn)[25]中優(yōu)化的配方：牛肉膏31.8 g/L、橄欖油21 mL/L、TritonX-100 36.55 mL/L、可溶性淀粉10 g/L、NaNO32 mmol/L。經(jīng)30 ℃、200 r/min培養(yǎng)40 h后，6 800×g離心10 min后收集上清即獲得脂肪酶粗酶液。

1.2.3.2 脂肪酶的純化

脂肪酶的純化采用雙水相萃取法[26]，按質(zhì)量配制雙水相體系（20 g）如下：異丙醇3.0 g、磷酸氫二鉀3.5 g、磷酸二氫鈉1.7 g、脂肪酶粗酶液11.8 g。慢慢攪拌，混合均勻后，1 700×g離心10 min使其充分分相，所得上相即為純化所得脂肪酶。

1.2.3.3 脂肪酶酶活力的測(cè)定

脂肪酶酶活力的測(cè)定 方法參考文獻(xiàn)[27]如下：溶液A：40 mg對(duì)硝基苯月桂酸酯溶于12 mL異丙醇；溶液B：90 mL磷酸鉀緩沖液（pH 7.0，100 mmol/L）加入0.4 g TritonX-100和0.1 g阿拉伯樹(shù)膠粉。

0.2 mL溶液A加入到3 mL溶液B中，振蕩混勻，置于35 ℃水浴中保溫5 min，然后加入0.1 mL粗酶液，對(duì)照組中加入0.1 mL無(wú)菌蒸餾水，35 ℃反應(yīng)20 min，測(cè)定OD405nm。根據(jù)對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算pNP的量，換算成酶活力單位。一個(gè)酶活力單位（U）表示在上述條件下1 min釋放1 μmol pNP所需要的酶量。

1.2.4 脂肪酶粗酶液酶學(xué)性質(zhì)的研究

最適pH值及pH值穩(wěn)定性：取100 μL的脂肪酶粗酶液于不同pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）的緩沖液中測(cè)定酶活力，以確定該酶的最適作用pH值。將脂肪酶粗酶液置于不同pH值（6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）的緩沖液中4 ℃保存12 h，測(cè)定其剩余酶活力，以保存在4 ℃的脂肪酶粗酶液酶活力為對(duì)照，確定該酶的pH值穩(wěn)定性。

最適溫度及溫度穩(wěn)定性：取100 μL的脂肪酶粗酶液在不同溫度（25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）條件下測(cè)定酶活力，以確定該酶的最適作用溫度。將脂肪酶粗酶液在不同溫度（35、45、55 ℃）條件下保溫，每隔1 h測(cè)定剩余酶活力，以保存在4 ℃的脂肪酶粗酶液酶活力為對(duì)照，確定該酶的溫度穩(wěn)定性。

1.2.5 脂肪酶粗酶液對(duì)裂壺藻油脂中DHA的富集作用

裂壺藻油脂由裂壺藻（Aurantiochytrium sp. SD116）[28]發(fā)酵提取制得。

依照文獻(xiàn)[29]設(shè)計(jì)酶解體系為油脂：緩沖液：脂肪酶粗酶液以體積比2∶3∶10混合，35 ℃、200 r/min的條件下進(jìn)行酶解。其中，緩沖液為含有體積分?jǐn)?shù)0.7% TritonX-100的磷酸鉀緩沖液（p H 7.0，1 0 0 m m o l/L）。對(duì)照組中使用等體積緩沖液代替脂肪酶粗酶液。

每隔1 h從體系中取100 μL樣品，加入1 mL乙醇和1 mL蒸餾水，然后加入0.5 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液，中和水解生成的脂肪酸，混勻后用正己烷萃取，得到未水解的脂，稱(chēng)為有機(jī)相；然后加入0.3 mL 2 mol/L鹽酸，釋放中和的脂肪酸，混勻后用正己烷萃取，得到水解生成的脂肪酸，稱(chēng)為水相。

1.2.6 酶解結(jié)果分析

脂肪酸組成成分的分析采用文獻(xiàn)[30]的方法并稍加改動(dòng)，具體如下：1 mL樣品（氯仿溶解）、100 μL十九酸（3 mg/mL，甲醇溶解）、2.5 mL硫酸甲醇（體積分?jǐn)?shù)為2%）在85 ℃水浴中反應(yīng)2.5 h，然后用1 mL色譜級(jí)正己烷萃取所得脂肪酸甲酯。脂肪酸測(cè)定采用氣相色譜法，條件參考文獻(xiàn)[31]，稍作改動(dòng)為：采用Agilent-GC7890 A氣相色譜儀，色譜柱為HP-INNOWax （30 m×250 μm，0.25 μm），載氣為高純氮，設(shè)定程序升溫為100 ℃保持1 min，然后每分鐘升溫15 ℃至240 ℃，240 ℃保持10 min，氫離子火焰檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度為260 ℃。恒流控制，氮?dú)饬髁繛?0 mL/min，氫氣流量為30 mL/min，空氣流量為400 mL/min。進(jìn)樣量為1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的篩選

本實(shí)驗(yàn)從3 份土壤樣品中分離得到18 個(gè)菌落，其中具有分泌胞外脂肪酶能力的細(xì)菌3 株。從中選擇分泌脂肪酶能力最強(qiáng)的一株進(jìn)行分析。該菌在LB瓊脂平板培養(yǎng)基上的形態(tài)如圖1A所示，菌落呈黃色，圓形，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣整齊，不透明；在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)如圖1B所示，菌體呈短桿狀，菌體長(zhǎng)度約1～1.5 μm，寬度約0.3～0.7 μm；在篩選培養(yǎng)基上的形態(tài)如圖1C所示，該菌能夠產(chǎn)生很明顯的水解圈，水解圈與菌落圈直徑比值約為3，說(shuō)明該菌的胞外脂肪酶活力較強(qiáng)。

2.2 產(chǎn)酶菌株SD001的鑒定

通過(guò)PCR擴(kuò)增，得到該菌的16S rDNA，經(jīng)過(guò)測(cè)序之后，根據(jù)16S rDNA序列相似性比對(duì)確定該菌為伯克霍爾德氏菌屬，通過(guò)MEGA5軟件采用鄰位相連法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），鑒定為伯克霍爾德氏菌（Burkholderia sp.），命名為Burkholderia sp. SD001，GenBank登錄號(hào)為KJ725085。

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Neighbor-Joining phylogenetic tree resulting from analysis of the 16S rDNA sequences

2.3 脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 Burkholderia sp. SD001的產(chǎn)酶時(shí)間曲線(xiàn)

微生物來(lái)源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，在生長(zhǎng)曲線(xiàn)的對(duì)數(shù)末期酶活力較高。將該菌在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中30 ℃、200 r/min的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，從產(chǎn)酶曲線(xiàn)（圖3）可以看出，在40 h內(nèi)，酶活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，到40 h時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，約為70 U/mL。文獻(xiàn)[32-35]中伯克霍爾德氏菌的產(chǎn)酶活力在1.90～540.46 U/mL之間，但不同文獻(xiàn)使用的培養(yǎng)條件、酶活力測(cè)定方法和底物不盡相同。40 h后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中酶活力漸漸降低。這可能是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)成分耗盡，菌體不再外分泌脂肪酶，反而水解脂肪酶作為氮源或是已經(jīng)分泌至培養(yǎng)液中的脂肪酶活性逐漸降低所致。

圖3 3 Burkholderiaderia sp. SD001在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的酶活力變化Fig.3 The lipase activity of Burkholderia sp. SD001 during cultivation

2.3.2 脂肪酶的最適作用溫度及熱穩(wěn)定性

圖4 溫度對(duì)Burkholderiaderia sp. SD001脂肪酶粗酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of crude lipase from Burkholderia sp. SD001

以雙水相萃取所得上相作為粗酶液，分別在25～70 ℃條件下測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖4。在溫度較低時(shí)，酶活力隨著溫度的升高而增大，并且在45 ℃時(shí)達(dá)到最大，而在溫度大于45 ℃時(shí)，酶活力隨著溫度的升高而降低。這表明該酶的最適作用溫度為45 ℃。將酶液分別在35、45、55 ℃條件下保溫，測(cè)定其熱穩(wěn)定性，曲線(xiàn)如圖5所示，該酶在35 ℃條件下比較穩(wěn)定，隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力損失很小；45 ℃條件下保溫時(shí)，酶活力隨保溫時(shí)間延長(zhǎng)而降低，5 h后，酶活力降為原來(lái)的50%；55 ℃條件下保溫時(shí)，酶活力急劇下降，保溫1 h后，酶活力已經(jīng)損失超過(guò)60%，保溫5 h后，酶活力基本喪失。因此酶解油脂實(shí)驗(yàn)所選用的溫度定為35 ℃。

圖5 溫度對(duì)脂肪酶粗酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the stability of crude lipase from Burkholderia sp. SD001

2.3.3 脂肪酶的最適作用pH值及pH值穩(wěn)定性

圖6 pH值對(duì)Burkholddeerriiaa sp. SD001脂肪酶粗酶活性的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of crude lipase from Burkholderia sp. SD001

以雙水相萃取所得上相作為酶液，測(cè)定不同pH值條件下的酶活力，結(jié)果如圖6所示。在pH值低于8.5時(shí)，酶活力隨著pH值的升高而增大，pH值到8.5時(shí)達(dá)到最大值，而后隨pH值升高，酶活力降低。表明該酶的最適pH值為8.5。將酶液在不同pH值緩沖液中4 ℃保存12 h后，測(cè)定剩余酶活力，對(duì)照為在4 ℃保存的酶液酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖7。在pH 6.0～10.0的范圍內(nèi)，雖然酶活力有所降低，但該酶仍能保持70%以上的酶活力。說(shuō)明該酶在以上pH值范圍內(nèi)都能夠保持穩(wěn)定，考慮到裂壺藻油脂在中性pH值條件下比較穩(wěn)定，因此酶解油脂實(shí)驗(yàn)所選用的緩沖液pH值定為7.0。

圖7 pH值對(duì)脂肪酶粗酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH on the stability of crude lipase from Burkholderia sp. SD001

2.4 對(duì)裂壺藻油脂的DHA富集作用

表1 裂壺藻油脂初始的主要脂肪酸組成Table 1 Initial fatty acid composition of Aurantiochyttrriiuumm sp. SD116 oil

裂壺藻油脂的主要脂肪酸組成經(jīng)氣相色譜（gas chromatography，GC）檢測(cè)，所得結(jié)果如表1。其中，C16∶0和C22∶6的百分含量相對(duì)較高。C16∶0的相對(duì)百分含量高達(dá)52.11%，而C22∶6的相對(duì)百分含量約為29.29%。

圖8 經(jīng)過(guò)脂肪酶粗酶液酶解后脂肪酸含量的變化Fig.8 Changes in fatty acid composition of Aurantiochytrium sp. SD116 oil after treatment with crude lipase

經(jīng)過(guò)脂肪酶粗酶液水解后，用GC法對(duì)反應(yīng)體系的水相和有機(jī)相脂肪酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖8所示，其中脂肪酸的絕對(duì)含量由內(nèi)標(biāo)十九酸的質(zhì)量通過(guò)氣相色譜峰面積計(jì)算得到。從水相和有機(jī)相脂肪酸的絕對(duì)含量變化（圖8A、8B）來(lái)看，隨著脂肪酶水解過(guò)程的進(jìn)行，有機(jī)相中的脂肪酸逐漸減少，水相中的脂肪酸逐漸增加，到8 h后基本維持恒定，說(shuō)明水解反應(yīng)在此時(shí)達(dá)到了平衡狀態(tài)。圖8顯示，裂壺藻油脂中所有的脂肪酸都不同程度的從有機(jī)相轉(zhuǎn)移到了水相，其中棕櫚酸（C16∶0）從有機(jī)相轉(zhuǎn)移到水相的絕對(duì)量要遠(yuǎn)大于DHA（C22∶6）。從有機(jī)相脂肪酸的相對(duì)含量變化（圖8C）中可以看出，棕櫚酸在經(jīng)過(guò)該酶水解8 h后含量從最初的50%下降到30%，而DHA含量則從最初的30%升高到了40%。這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所使用的脂肪酶相對(duì)于DHA與甘油形成的酯鍵來(lái)說(shuō)，更多的作用于棕櫚酸與甘油形成的酯鍵。正是脂肪酶的這種對(duì)于底物的差異性識(shí)別作用，使得裂壺藻油脂中的DHA能夠以甘油酯的形式得到富集。之后隨著水解過(guò)程的進(jìn)行，棕櫚酸的相對(duì)含量略有上升，DHA的相對(duì)含量略有下降，可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò)脂肪酶水解后有機(jī)相中棕櫚酸和DHA的絕對(duì)含量相當(dāng)，加上水解反應(yīng)達(dá)到平衡，脂肪酶對(duì)于這兩種脂肪酸的差異性識(shí)別作用降低所致。在不添加酶液的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中（圖9），水相和有機(jī)相的脂肪酸絕對(duì)含量基本保持不變，同時(shí)由于DHA的穩(wěn)定性較低，其在有機(jī)相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有輕微的降低，這進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)使用的伯克霍爾德氏菌脂肪酶具有一定的DHA富集效果。

圖9 不添加脂肪酶的對(duì)照組裂壺藻油脂的脂肪酸含量的變化Fig.9 Changes in fatty acid composition of the control group without treatment with lipase

3 討 論

伯克霍爾德氏菌是一種廣泛存在于水、土壤和植物中的革蘭氏陰性菌，伯克霍爾德氏菌脂肪酶在之前的文獻(xiàn)報(bào)道中，其最適溫度范圍在30～60 ℃，最適pH值范圍在9.0～10.0，屬堿性脂肪酶[33,36]。本研究從廣州的泥土樣品中所篩選得到的脂肪酶最適溫度為45 ℃，最適pH值為8.5，是一種典型的伯克霍爾德氏菌脂肪酶。脂肪酶催化天然底物油脂水解，其發(fā)揮水解作用活性是在油水界面上[37]。因此，為了能夠使脂肪酶最大限度的發(fā)揮水解作用，水解實(shí)驗(yàn)的緩沖液中加了體積分?jǐn)?shù)0.7%的表面活性劑Triton X-100，構(gòu)成乳化體系。由于乳化體系的不均一性，不同時(shí)間點(diǎn)所取樣品的體積會(huì)存在一定的誤差，結(jié)果造成了圖8中水解曲線(xiàn)的波動(dòng)，但對(duì)脂肪酸總體的變化趨勢(shì)影響不大。

在用該脂肪酶水解裂壺藻油脂的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果單純看有機(jī)相中脂肪酸相對(duì)含量的變化，DHA在有機(jī)相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在經(jīng)過(guò)8 h脂肪酶的水解作用后從最初的30%升高到了40%，有一定的效果。但是如果結(jié)合有機(jī)相中DHA的絕對(duì)含量的變化情況，則發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過(guò)酶解8 h后，有機(jī)相樣品中DHA的含量從最初的10.44 mg下降到5.0 mg，損失了約50%。因此，該酶對(duì)裂壺藻油脂DHA的富集作用比較有限，有待進(jìn)一步改善。在有關(guān)用酵母或霉菌脂肪酶富集DHA的文獻(xiàn)中，有結(jié)果顯示來(lái)自于Candida rugosa的脂肪酶對(duì)于ω-3多不飽和脂肪酸的富集效果最明顯，能夠使其相對(duì)含量上升20%～30%[38]。本實(shí)驗(yàn)所篩選的脂肪酶來(lái)源于細(xì)菌，因其生長(zhǎng)速率較快，在降低脂肪酶的成本方面有一定的實(shí)用價(jià)值，但其選擇性有待通過(guò)水解條件優(yōu)化或蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)一步提高。

除了利用脂肪酶對(duì)油脂的水解反應(yīng)來(lái)富集DHA，還有利用脂肪酶的特殊催化性能比如酯化、轉(zhuǎn)酯化等進(jìn)行DHA富集的報(bào)道[39]。另外，脂肪酶法與其他的物理化學(xué)方法相結(jié)合能夠進(jìn)一步提高DHA的富集效果，文獻(xiàn)[40]中也已經(jīng)有關(guān)于這方面的研究。因此，DHA的富集可以結(jié)合脂肪酶的多種催化性能和其他物理化學(xué)方法，最終實(shí)現(xiàn)高效低成本的工業(yè)應(yīng)用。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從來(lái)自廣州的泥土樣品中分離得到一株高產(chǎn)脂肪酶的伯克霍爾德氏菌，命名為Burkholderia sp. SD001。對(duì)其脂肪酶粗酶液進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該酶的最適作用溫度為45 ℃，最適作用pH值為8.5，在短鏈醇酮類(lèi)有機(jī)溶劑中有較好的耐受性。通過(guò)該酶對(duì)裂壺藻油脂的水解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該酶可以將油脂中的DHA從最初的30%提高到40%，對(duì)DHA有一定的富集效果。本研究表明細(xì)菌脂肪酶也可用于富集油脂中的DHA，拓寬了可用于多不飽和脂肪酸分離純化的脂肪酶的范圍。

[1] CARLSON S J, FALLON E M, KALISH B T, et al. The role of the omega-3 fatty acid DHA in the human life cycle[J]. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, 2013, 37(1): 15-22.

[2] LORENTE-CEBRI N S, COSTA A V, NAVAS-CARRETERO S, et al. Role of omega-3 fatty acids in obesity, metabolic syndrome, and cardiovascular diseases: a review of the evidence[J]. Journal of Physiology and Biochemistry, 2013, 69(3): 633-651.

[3] SIDDIQUI R A, HARVEY K A, WALKER C, et al. Characterization of synergistic anti-cancer effects of docosahexaenoic acid and curcumin on DMBA-induced mammary tumorigenesis in mice[J]. BMC Cancer, 2013, 13: 418.

[4] RUSSELL F D, BURGIN-MAUNDER C S. Distinguishing health benefits of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids[J]. Marine Drugs, 2012, 10(11): 2535-2559.

[5] TAI E K K, WANG Xiaobo, CHEN Zhenyu. An update on adding docosahexaenoic acid (DHA) and arachidonic acid (AA) to baby formula[J]. Food & Function, 2013, 4(12): 1767-1775.

[6] WARD O P, SINGH A. Omega-3/6 fatty acids: alternative sources of production[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(12): 3627-3652.

[7] QU Liang, REN Lujing, HUANG He. Scale-up of docosahexaenoic acid production in fed-batch fermentation by Schizochytrium sp. based on volumetric oxygen-transfer coeffi cient[J]. Biochemical Engineering Journal, 2013, 77: 82-87.

[8] QU Liang, REN Lujing, SUN Guannan, et al. Batch, fed-batch and repeated fed-batch fermentation processes of the marine thraustochytrid Schizochytrium sp. for producing docosahexaenoic acid[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2013, 36(12): 1905-1912.

[9] 林文, 田龍, 王志祥, 等. 尿素包合法聯(lián)合分子蒸餾技術(shù)提純乙酯化魚(yú)油中EPA及DHA的工藝研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2012, 27(12): 84-88; 92.

[10] RUBIO-R ODRIGUEZ N, BELTRAN S, JAIME I, et al. Production of omega-3 polyunsaturated fatty acid concentrates: a review[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2010, 11(1): 1-1 2.

[11] MCNEILL G, ACKMAN R, MOORE S. Lipase-catalyzed enrichment of long-chain polyunsaturated fatty acids[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 1996, 73(11): 1403-1407.

[12] KAHVECI D, FALKEBORG M, GREGERSEN S, et al. Upgradi ng of farmed salmon oil through lipase-catalyzed hydrolysis[J]. Open Biotechnology Journal, 2010, 4: 47-55.

[13] KAHVECI D, XU X. Repeated hydrolysis process is effective for enrichment of omega 3 polyunsaturated fatty acids in salmon oil by Candida rugosa lipase[J]. Food Chemistry, 2011, 129(4): 1552-1558.

[14] SHIMADA Y, MARUYAMA K, OKAZAKI S, et al. Enrichment of p olyunsaturated fatty acids with Geotrichum candidum lipase[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 1994, 71(9): 951-954.

[15] MURALIDHAR R V, CHIRUMAMILLA R R, MARC HANT R, et al. Understanding lipase stereoselectivity[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2002, 18(2): 81-97.

[16] DODSON G, WLODAWER A. Catalytic triads and their relatives[J]. Trends in Biochemical Sciences, 1998, 23(9): 347-352.

[17] LEE J E, CHANG Y H, GANESAN P, et al. Concentration of n-3 polyunsaturated fatty acids in cholesterol-reduc ed cod-liver oil by lipases[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2011, 46(7): 1462-1468.

[18] YAN H, NORITOMI H, NAGAHAMA K. Concentration of docosahexaenoic acid in glyceride by hydrolysis of tuna oil with Candida rugosa lipase[J]. Kagaku Kogaku Ronbunshu, 2002, 28(1): 31-35.

[19] CARVALHO P D, CAMPOS P R B, NOFFS M D, et al. Enzymatic hydrolysis of salmon oil by nativ e lipases: optimization of process parameters[J]. Journal of the Brazilian Chemical Society, 2009, 20(1): 117-124.

[20] OKADA T, MORRISSEY M T. Production of n-3 polyunsaturated fatty acid concen trate from sardine oil by immobilized Candida rugosa lipase[J]. Journal of Food Science, 2008, 73(3): C146-C150.

[21] MBATIA B, ADLERCREUTZ P, MULAA F, et al. Enzymatic enrichment of omega-3 polyunsaturated fatty acids in Nile perch (Lates niloticus) viscera oil[J]. European Journal of Lipid Science and Technology, 2010, 112(9): 977-984.

[22] MA Qiongli, SUN Xuepiao, GONG Shufeng, et al. Screening and identifi cation of a highly lipolytic bacterial strain from barbecue sites in Hainan and characterization of its lipase[J]. Annals of Microbiolo gy, 2010, 60(3): 429-437.

[23] ALTSCHUL S F, GISH W, MILLER W, et al. Basic local alignment search tool[J]. Journal of Molecular Biology, 1990, 215(3): 403-410.

[24] TAMURA K, PETERSON D, PETERSO N N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolu tion, 2011, 28(10): 2731-2739.

[25] 苑博華, 蔡宇杰, 廖祥儒, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化Burkholderia sp. SYBC LIP-Y發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶條件的研究[J]. 工業(yè)微生物, 2011, 41(4): 21-25.

[26] OOI C W, TEY B T, HII S L, et al. Direct purifi cation of Burkholderia pseudomallei lipase from fermentation broth using aqueous two-phase systems[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2009, 14(6): 81 1-818.

[27] 李蓓, 李曉暉, 衣杰榮. 對(duì)硝基苯酚法對(duì)雅致放射毛霉脂肪酶特性的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2011, 32(11): 220-222; 263.

[28] GAO Mang, SONG Xiaojin, FENG Yingang, et al. Isolation and characterization of Aurantiochytrium species: high docosahexaenoic acid (DHA) production by the newly isolated microalga, Aurantiochytrium sp. SD116[J]. Journal of Oleo Science, 2013, 62(3): 143-151.

[29] GáMEZ-MEZA N, NORIEGA-RODRí?GUEZ J A, MED INAJUáREZ L A, et al. Concentration of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid from fish oil by hydrolysis and urea complexation[J]. Food Research International, 2003, 36(7): 721-727.

[ 30] DODDS E, MCCOY M, REA L, et al. Gas chromatographic quantifi cation of fatty acid methyl esters: fl ame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry[J]. Lipids, 2005, 40(4): 419-428.

[31] AKANBI T O, ADCOCK J L, BARROW C J. Selective concentration of EPA and DHA using Thermomyces lanuginosus lipase is due to fatty acid selectivity and not regioselectivity[J]. Food Chemistry, 2013, 138(1): 615-620.

[32] CHAIYASO T, SEESURIYACHAN P, ZIMMERMANN W, et al. Purification and characterization of lipase from newly isolated Burkholderia multivorans PSU-AH130 and its application for b iodiesel production[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(4): 1615-1624.

[33] WEI Hanning, SHI Lingling, WU Bo. Production and characteristics of an enantioselective lipase from Burkholderia sp. GXU56[J]. Chemical Engineering & Technolo gy, 2008, 31(2): 258-264.

[34] LAU H L, ARIFF A, WOO K K, et al. Production and optimization of alkalostable lipase by alkalophilic Bur kholderia cenocepacia ST8[J]. African Journal of Biotechnology, 2011, 10(36): 7002-7009.

[35] LO C F, YU C Y, KUAN I C, et al. Optimization of lipase production by Burkholderia sp. using response surface methodology[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13(11): 14889-14897.

[36] DALAL S, SINGH P K, RAGHAVA S, et al. P urification and properties of the alkaline lipase from Burkholderia cepacia ATCC 25609[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 2008, 51: 23-31.

[37] REIS P, HOLMBERG K, WATZKE H, et al. Lipases at interfaces: a review[J]. Advances in Colloid and Interface Scie nce, 2009, 147-148: 237-250.

[38] SUN T, PIGOTT G M, HERWIG R P. Lipase-assisted concentration of n-3 polyunsaturated fatty acids from viscera of farmed Atlantic salmon (Salmo salar L.)[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(1): 130-136.

[39] JONZO M D, HIOL A, ZAGOL I, et al. Concentrates of DHA from fish oil by selective esterification of cholesterol by immobilized isoforms of lipase from Candida rugosa[J]. Enzyme and Microbial Technolog y, 2000, 27(6): 443-450.

[40] 吳彩娥, 許克勇, 李元瑞. n-3多不飽和脂肪酸富集純化的研究進(jìn)展[J].中國(guó)油脂, 2005, 30(12): 45-49.

Concentration of Docosahexaenoic Acid in Aurantiochytrium sp. Oil by Burkholderia Lipase

LAN Jun1,2, SONG Xiaojin1, TAN Yanzhen1, XU Jianchun3, CUI Qiu1,4, FENG Yingang1,*
(1. Shandong Provincial Key Laboratory of Energy Genetics, Qingdao Engineering Laboratory of Single Cell Oil, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China; 2. College of Life Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Qingdao Langyatai Co. Ltd., Qingdao 266400, China; 4. Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China)

Purpose: To explore the effect Burkholderia lipase on enrichment of docosahexaenoic acid (DHA) in Aurantiochytrium sp. oil. Methods: Tributyrin plate method was used to screen a lipase-producing bacterium. Using 4-nitrophenyl laurate as substrate, the enzymatic properties of the Burkholderia lipase were studied. The lipase was used to hydrolyze Aurantiochytrium oil. To evaluate the enrichment efficiency of DHA with the lipase, the fatty acid compositions in the aqueous and the organic phase after hydrolysis were detected by gas chromatography. Results: The lipase-producing bacterium obtained from mud samples collected from Guangzhou city was identifi ed as Burkholderia sp. SD001. Its lipase activity reached the maximum value of 70 U/mL in the culture after fermentation at 30 ℃ for 40 h. The lipase had an optimal pH of 8.5 and an optimal temperature of 45 ℃. When the lipase was used to hydrolyze the oil from Aurantiochytrium sp., the percentage of DHA content in the oil was increased from 30% to 40%. Conclusions: A bacterium producing a lipase capable of enriching DHA has been obtained. The lipase from this strain with expanded applicability is useful for the enrichment of polyunsaturated fatty acid.

lipase; Burkholderia sp.; Aurantiochytrium sp.; oil; docosahexaenoic acid enrichment

Q81

A

1002-6630（2015）01-0128-07

10.7506/spkx1002-6630-201501025

2014-01-15

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA02A707；2014AA021701）；

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（41306132）

蘭君（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榱阎硥鼐椭姆治雠c應(yīng)用。E-mail：lanjun@qibebt.ac.cn

*通信作者：馮銀剛（1977—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與蛋白質(zhì)工程。E-mail：fengyg@qibebt.ac.cn