基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在抗肝纖維化中應(yīng)用的研究進(jìn)展▲

艾丁丁 羅偉生

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)脾胃科，南寧市 530000，電子郵箱:378621449@qq.com)

【提要】 基因治療是指將外源性正常基因?qū)氚屑?xì)胞以治療疾病的一種方法，現(xiàn)階段主要運用于腫瘤及某些特殊疾病的治療。有研究顯示，將基因治療的轉(zhuǎn)染技術(shù)用于抗肝纖維化的治療可以逆轉(zhuǎn)纖維化，或可成為治療肝纖維化的潛在方案。本文就基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在抗肝纖維化中應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

肝纖維化是肝炎發(fā)展到肝硬化、肝癌的中心環(huán)節(jié)，在肝纖維化過程中，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的增殖與抑制是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵。而肝纖維化既是一個病理進(jìn)展過程又是一個可逆性疾病，同時存在于慢性肝病發(fā)生、發(fā)展和修復(fù)的過程中。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)干預(yù)HSC細(xì)胞的增殖來抑制肝纖維化，是近年來治療肝纖維化疾病的新方向。本文就基因轉(zhuǎn)染技術(shù)用于肝纖維化治療的研究進(jìn)展做一綜述。

1 基因治療的概述

基因治療是一種將同種健康遺傳分子物質(zhì)導(dǎo)入患者細(xì)胞以取代異?；虻男滦椭委煼椒ǎ瑢儆诜浅Ｒ?guī)治療手段，其通過改變病體原有的基因產(chǎn)物以達(dá)到目的基因產(chǎn)物正?；哪康摹Ｖ委熯^程主要是借助必要的載體將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入有缺陷的組織或細(xì)胞的指定位置，使其產(chǎn)物對相應(yīng)基因進(jìn)行矯正、置換或增補，以預(yù)防或治療某種疾病[1]，其中，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是基因治療的一種方法，也是影響治療效果的關(guān)鍵[2]。

2 轉(zhuǎn)染技術(shù)的概述

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是一種將遺傳物質(zhì)定向、定點傳輸入靶目標(biāo)生物體的方式，轉(zhuǎn)染技術(shù)能使遺傳信息得到高效的、完整的保存和應(yīng)用，是基因治療的關(guān)鍵。主要分為病毒感染法和非病毒轉(zhuǎn)染法，非病毒轉(zhuǎn)染法中的基因轉(zhuǎn)染因操作簡便而更為常用，但病毒仍是最常見的基因治療導(dǎo)入載體。

2.1 病毒感染方法 根據(jù)載體的特點病毒感染方法可分為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法和慢病毒載體法。近年來，慢病毒載體法成為基因治療研究的熱點，如何提高轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性、普適性和轉(zhuǎn)染率是學(xué)者們關(guān)注的焦點。

2.1.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法：RNA病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法的主要載體，在逆轉(zhuǎn)錄下以單鏈RNA載入病毒后形成雙鏈DNA，最終整合為原病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體易于制備，Kang等[3]的實驗研究表明，慢病毒介導(dǎo)的CNN2shRNA轉(zhuǎn)染到SK-hep-1細(xì)胞后對細(xì)胞表達(dá)的蛋白進(jìn)行定向修飾，能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。但逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA病毒)的病毒載量小、轉(zhuǎn)化效率低，使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法的應(yīng)用受限，因此，如何提高轉(zhuǎn)化效率是目前有待攻克的技術(shù)性難題。

2.1.2 慢病毒載體法：慢病毒載體法主要是以腺病毒相關(guān)病毒為主要載體，具有轉(zhuǎn)染率高、靶向性好等優(yōu)勢，其在基因治療腫瘤中的應(yīng)用已成為近年來的研究熱點。Doggybone DNA(dbDNA)是一種新型DNA，其適配的功能性的慢病毒載體可以用于體內(nèi)外的遺傳信息傳遞，但以此法制作的慢病毒載體成本較高，因此，大量高質(zhì)量DNA的生產(chǎn)仍然是基因治療中病毒載體生產(chǎn)的主要瓶頸[4]。

2.2 非病毒轉(zhuǎn)染方法 非病毒載體法是指用化學(xué)、物理或生物方法將正常基因?qū)氚屑?xì)胞的方法[5]，該方法操作相對簡單，有較高的轉(zhuǎn)染率，比較適合初學(xué)者。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，陽離子脂質(zhì)體載體的微循環(huán)DNA復(fù)合體可以在保持原有細(xì)胞活力的前提下提高視網(wǎng)膜原代細(xì)胞和大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率[6]。非病毒轉(zhuǎn)染法主要包括化學(xué)、生物和物理轉(zhuǎn)染法。

2.2.1 化學(xué)轉(zhuǎn)染法:化學(xué)轉(zhuǎn)染法主要有陽離子法、磷酸鈣共沉淀法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，其中磷酸鈣共沉淀法僅用于實驗性基礎(chǔ)研究的開發(fā)。Reinhard等[7]采用陽離子脂質(zhì)低聚物進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗時發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化裂解方案可以最大限度地減少三氟乙酸加合物的形成，從而提高合成的效率。因化學(xué)轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染率低而運用受限，但與其他方法聯(lián)合使用可提高活體內(nèi)的轉(zhuǎn)染率，如將化學(xué)轉(zhuǎn)染法和物理轉(zhuǎn)染法合并使用的TurboFect試劑轉(zhuǎn)染聯(lián)合機械轉(zhuǎn)導(dǎo)聯(lián)合轉(zhuǎn)染方法,能有效增強腫瘤細(xì)胞中的基因載體傳遞[8]。

2.2.2 生物、物理及其他轉(zhuǎn)染方法:近年來，非病毒轉(zhuǎn)染方法中的生物和物理轉(zhuǎn)染法較為常用，其中受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法和直接注射法是近期研究的熱點。生物轉(zhuǎn)染法中，受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法使用的質(zhì)粒DNA與載體形成的復(fù)合體大多能被肝臟攝取，因此該轉(zhuǎn)染法更適用于慢性肝病的轉(zhuǎn)染治療，但該復(fù)合體在活體內(nèi)持續(xù)表達(dá)的時間較短導(dǎo)致該轉(zhuǎn)染法使用受限。最新研究表明，引入基因治療增強劑可以增強生物材料支架系統(tǒng)的傳遞潛力，如活化的聚酰胺酰胺樹狀大分子轉(zhuǎn)染試劑配合特定的復(fù)合支架可用于各種組織缺陷的再生治療[9]，這使得生物轉(zhuǎn)染法的應(yīng)用取得新的進(jìn)展。物理轉(zhuǎn)染法較為直接，如顯微鏡注射法是在顯微鏡下利用外源性基因直接注射入細(xì)胞，該方法適合靶基因在肌肉、肝臟和脾臟等細(xì)胞中的表達(dá)培養(yǎng)，如基于納米通道陣列平臺進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的基因治療[10]。

3 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在肝纖維化中的應(yīng)用

隨著基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的逐漸成熟化，該技術(shù)在肝纖維化、肝硬化和肝癌等慢性肝病中的治療成為可能。目前，將基因轉(zhuǎn)染技術(shù)應(yīng)用于抗肝癌或抑制肝纖維化是基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在慢性肝病研究中應(yīng)用的首要突破口。而尋找活體內(nèi)的可行性、最高效的基因轉(zhuǎn)染關(guān)鍵靶點是提高基因轉(zhuǎn)染治療效果的關(guān)鍵。有研究顯示，暫時性膽道阻塞可以提高基因轉(zhuǎn)染治療的效果，并且肝膽道可能是基因治療的重要給藥部位[11]。

3.1 基因轉(zhuǎn)染調(diào)控蛋白抗肝纖維化 Xu等[12]成功構(gòu)建重組pIRES2-EGFP-ARTS質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染入活化的人LX-2 HSC，結(jié)果顯示ARTS過表達(dá)可能是潛在的逆轉(zhuǎn)肝纖維化的新型治療手段，使基因轉(zhuǎn)染治療肝纖維成為可能。有研究顯示，丙型肝炎病毒蛋白具有多種調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的機制并可促進(jìn)細(xì)胞自噬，該發(fā)現(xiàn)可能使丙型肝炎病毒蛋白成為預(yù)防或治療丙型肝炎病毒相關(guān)肝纖維化、肝硬化或肝癌的病理靶標(biāo)[13]。在小鼠肝纖維化模型中，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)-30a過表達(dá)后可直接抑制Beclin1介導(dǎo)的細(xì)胞自噬來預(yù)防肝纖維化，miRNA-30a成為潛在的抑制肝纖維化發(fā)展的新靶點[14]。由此可見，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)主要通過調(diào)節(jié)某些分子機制來改變上游蛋白的表達(dá)，從而直接逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展，并通過相關(guān)信號通路間接抑制肝腫瘤細(xì)胞的增殖。

3.2 基因轉(zhuǎn)染調(diào)控HSC活化抗肝纖維化 HSC是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，細(xì)胞本身的活化和抑制是防治肝纖維化的關(guān)鍵，目前，免疫調(diào)節(jié)劑、受體等對HSC的調(diào)節(jié)成為基因治療肝纖維化的研究熱點。核苷酸結(jié)合寡聚化域樣受體5是寡聚化域樣受體家族的最大成員，被確定為能夠影響肝纖維化發(fā)展的免疫反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，因此，寡聚化域樣受體5或可通過調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)錄過程HSC活化蛋白的差異表達(dá)來逆轉(zhuǎn)肝纖維化[15]。有研究顯示，腱生蛋白C是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，其在肝纖維化過程中表達(dá)上調(diào)，并且隨著HSC的激活其表達(dá)水平升高，而給予過表達(dá)的pTARGET-腱生蛋白載體轉(zhuǎn)染后，HSC的活化有所增強[16]。有研究表明，相關(guān)蛋白是人體重要的功能性下游蛋白，其在活化的HSC中表達(dá)降低有助于獲得HSC的靜止表型，且其可能是HSC活化和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的新標(biāo)靶途徑[17]。還有研究顯示，miRNA-942靶向過氧化物酶體增殖物激活受體γ能降低人肝纖維化中HSC的活化[18]。因此，采用基因轉(zhuǎn)染方法調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達(dá)可能是治療慢性乙型肝炎性肝纖維化的新策略。

3.3 基因轉(zhuǎn)染調(diào)控信號通路抗肝纖維化 近年來，有學(xué)者采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)對信號通路進(jìn)行調(diào)控來抗肝纖維化，如采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)對轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)信號通路、經(jīng)典的Wnt信號通路和Smad3經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等與生長和發(fā)育相關(guān)的重要信號通路進(jìn)行干預(yù)。有研究表明，miRNA-29b與TGF-β1/Smad3信號通路之間的反饋環(huán)是一種惡性循環(huán)，而miRNA-29b對TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞(人類HSC細(xì)胞)活化具有抑制作用，因此，對此反饋環(huán)進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)可能是抗肝纖維化的方法之一[19]。還有研究顯示，移植uPA基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以抑制被CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的肝纖維化、改善肝功能，其可能成為治療肝纖維化的一種新方法[20]。Notum(一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白抑制劑)通過下調(diào)Wnt5a介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑也可以抑制乙型肝炎病毒誘導(dǎo)的肝纖維化[21]。以上文獻(xiàn)提示，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)對常見的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行干預(yù)均可抗肝纖維化，但相關(guān)研究結(jié)果在臨床上應(yīng)用還需要大規(guī)模、多樣本的臨床研究結(jié)果支撐。

3.4 基因轉(zhuǎn)染保護(hù)肝細(xì)胞發(fā)揮抗肝纖維化作用 肝細(xì)胞凋亡是許多肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展的主要特征之一，而保護(hù)肝細(xì)胞并抑制其凋亡的主要作用是改變肝細(xì)胞的自身狀態(tài)，如降低肝細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝，改變細(xì)胞外基質(zhì)對肝細(xì)胞的作用。研究證實，采用染色體10上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物腺病毒進(jìn)行基因治療或為抗肝纖維化的治療方法之一[22]。另有研究顯示，靶向法尼醇X受體可抑制肝纖維化中肝細(xì)胞的凋亡[23]，這使得臨床利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制肝細(xì)胞凋亡與衰老從而抗肝纖維化成為可能。通過細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)干擾素信號傳導(dǎo)和HCV-RNA的復(fù)制可減少肝纖維化物質(zhì)的累積[24]，據(jù)此或可研發(fā)一種抑制并逆轉(zhuǎn)肝纖維化發(fā)展的新藥物。

總之，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)保護(hù)肝細(xì)胞或為臨床最直接、最簡單的抑制肝纖維化進(jìn)程的途徑，而從細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和細(xì)胞代謝等方面保護(hù)肝細(xì)胞，是未來研究的新方向。

4 小 結(jié)

目前，基因治療技術(shù)發(fā)展迅速，尤其是基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在多學(xué)科交叉層次的研究逐漸深入，其在肝臟疾病的診斷和治療方面也取得一定成效，轉(zhuǎn)染技術(shù)在抗肝纖維化治療中的用藥靶點和信號通路機制研究均有突破性進(jìn)展。但基因轉(zhuǎn)染技術(shù)也有其局限性，如非病毒轉(zhuǎn)染法存在轉(zhuǎn)染率低的問題，將來還需進(jìn)行多方面的基礎(chǔ)實驗研究以提高基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的轉(zhuǎn)染率。