大黃牡丹湯對脂多糖誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞焦亡及NLRP3/caspase-1通路的影響

賀海峰，華 鵬,崔 翔

(1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院脾胃病二科,陜西 西安 720082 2.陜西省安康市中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 安康 725000)

膿毒癥是嚴(yán)重?zé)齻?、休克和外科手術(shù)后等患者常會出現(xiàn)的并發(fā)癥，可由細(xì)菌引起。膿毒癥可導(dǎo)致腸道功能損傷，進而引發(fā)內(nèi)毒素移位，加重器官功能障礙，形成惡性循環(huán)[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要活性成分，在引發(fā)例如膿毒癥這種全身炎癥反應(yīng)中起著重要作用[2]。因此，研究內(nèi)毒素性腸損傷機制及其治療措施，對于防治內(nèi)毒素性器官功能障礙具有重要意義。細(xì)胞焦亡是一種細(xì)胞非典型死亡方式，與細(xì)胞凋亡的信號途徑和死亡方式不同，它可通過炎性信號通路的Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)，切割消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、促炎因子白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-1β和IL-18并釋放，細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)并膨脹破裂死亡[3]。大黃牡丹湯具有瀉熱消腫、破結(jié)散結(jié)的功效，可治療急性盆腔炎等濕熱瘀結(jié)類病癥[4]。目前關(guān)于大黃牡丹湯對LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞焦亡以及NLRP3/caspase-1炎性信號通路的影響鮮有報道，本研究通過體外細(xì)胞實驗對大黃牡丹湯對腸上皮細(xì)胞的保護作用及機制進行了初步探討，為預(yù)防和治療內(nèi)毒素性腸損傷提供一定的理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1實驗動物：32只250g～270g SPF級雄性SD大鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物資格證號：SCXK(湘)2019-0004。實驗在陜西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室進行，室溫為20～25℃，相對濕度為50%～60%，通風(fēng)良好。大鼠自由進食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。實驗嚴(yán)格遵循3R原則給予實驗動物人道的關(guān)懷照顧。

1.1.2主要試劑：大黃牡丹湯處方：3g牡丹皮、9g芒硝、9g桃仁、12g大黃、30g冬瓜仁。用6L蒸餾水煎煮，濃縮至1L時過濾去渣，加入芒硝再次煮沸，靜置冷卻后過濾取上清，藥劑使用前加蒸餾水稀釋至所需濃度。大鼠腸上皮細(xì)胞(貨號：LHY3015)；脂多糖(貨號：L6386)；DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM，貨號：C11960500BT )；噻唑藍(lán)(thiazolyl blue,MTT，貨號：PB180519)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO，貨號:133050)和0.25%胰蛋白酶溶液(貨號:PB180223)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；熒光二抗和熒光染料DAPI購自美國Life公司；IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、IL-18 ELISA試劑盒、NLRP3抗體、caspase-1抗體和GSDMD-C抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.1.3儀器：生物安全柜購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；CO2培養(yǎng)箱購自Forma公司；臺式高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；Facscalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；垂直板電泳槽、蛋白轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司，等。

1.2方 法

1.2.1將32只大鼠隨機分為4組：空白組和大黃牡丹湯低、中、高劑量組，每組8只，用藥劑量按照動物體表面積比率換算等劑量法，大黃牡丹湯低、中、高劑量組大鼠分別以2.52、5.04、7.56g/kg灌胃給藥，空白組大鼠給予蒸餾水灌胃，灌胃10mL/kg，1次/d、連續(xù)7d。最后1次給藥6h后，對各組大鼠進行腹主動脈穿刺取血，離心取上清并除菌滅活，儲于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞分組及培養(yǎng):將腸上皮細(xì)胞隨機分為5組，每組各設(shè)置10個平行對照：對照組：給予腸上皮細(xì)胞空白血清培養(yǎng)12h；LPS組：向腸上皮細(xì)胞中加入LPS(最終濃度為50mg/mL[5])和空白血清，培養(yǎng)12h；大黃牡丹湯低、中、高劑量組：向腸上皮細(xì)胞中加入LPS和大黃牡丹湯含藥血清，培養(yǎng)12h。

1.2.3MTT法檢測腸上皮細(xì)胞活性:將腸上皮細(xì)胞以5×104個/mL的密度接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，按照1.2.2中的分組進行處理。每孔加入20μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4h后，離心，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，避光并混勻，通過酶標(biāo)儀測定每孔細(xì)胞的570nm吸光度(A)值。細(xì)胞活性(%)=(A1～5-A空白組)/(A1-A空白組)×100%，A空白組為150μL細(xì)胞培養(yǎng)基于570nm A值，用以排除本底A值對結(jié)果的影響。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測腸上皮細(xì)胞凋亡情況：將腸上皮細(xì)胞配制為1×106個/mL密度的單細(xì)胞懸液，2mL/孔接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。按照1.2.2中的分組培養(yǎng)細(xì)胞，棄去上層培養(yǎng)基并加入胰蛋白酶對細(xì)胞進行消化，加入新的培養(yǎng)基終止消化后，離心收集細(xì)胞，無菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)洗滌細(xì)胞2次，隨后用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒中的緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL。取各組100 μL重懸后的細(xì)胞分別加入流式管中，再向流式管中加入5 μL Annexin V-FITC抗體和5μL Annexin V-PI抗體，快速混勻后避光孵育15min，加入400μL緩沖液混勻后流式細(xì)胞儀中分析細(xì)胞凋亡情況，注意全程冰上操作。

1.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western-blot,WB)檢測NLRP3、caspase-1和GSDMD-C的表達(dá)水平：將腸上皮細(xì)胞以1×106個/mL的密度接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，按照2.2中的分組進行處理。棄去培養(yǎng)基后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止后離心，無菌PBS洗滌細(xì)胞2次，再次離心棄上清，加入細(xì)胞裂解液，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后取50g進行SDS-PAGE電泳，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏(二)氟乙烯(Polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上，在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h，加入稀釋(1∶1000)的對應(yīng)一抗，4 ℃搖床孵育過夜，棄去一抗溶液并洗滌PVDF膜，加入稀釋(1∶2000)的二抗溶液，室溫?fù)u床1 h，洗膜3次，增強化學(xué)發(fā)光劑(Enhanced chemilum inescence,ECL)顯色并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.6免疫熒光法檢測細(xì)胞中NLRP3的表達(dá):配制2×105個/mL密度的腸上皮細(xì)胞，2mL接種于24孔板中培養(yǎng)過夜，按照2.2中的分組進行處理。棄培養(yǎng)基后進行細(xì)胞固定，PBS洗滌3次，用5%牛血清白蛋白室溫封閉1h，加入NLRP3抗體過夜，PBS洗滌后加入熒光二抗，室溫孵育2h，洗滌后加入熒光染料DAPI孵育3min，PBS洗滌3次，封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7ELISA檢測細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18的含量:在96孔ELISA板中4℃過夜包被IL-1β抗體，棄去后用含吐溫-20的PBS洗板3次，加入5%脫脂奶室溫封閉1h。棄去封閉液后加入各組細(xì)胞上清液，室溫孵育2h后洗板3次，加入100μL/孔的檢測抗體，室溫孵育1h后洗板3次，加入100μL/孔的二抗溶液，室溫孵育30min后洗板5次，100μL/孔顯色液孵育15min，加入50μL/孔終止液終止反應(yīng)，測定每孔450nm處的吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1大黃牡丹湯對LPS損傷腸上皮細(xì)胞活性、及凋亡率的影響:與對照組相比，LPS組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)；與LPS組相比，大黃牡丹湯各組的細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)，各組細(xì)胞活性數(shù)據(jù)如表1所示。LPS組細(xì)胞凋亡率相比于對照組顯著升高(P<0.05)；大黃牡丹湯各組細(xì)胞凋亡率相比于LPS組顯著降低(P<0.05)，結(jié)果如表1、圖1所示。

圖1 大黃牡丹湯對LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

表1 大黃牡丹湯對LPS損傷腸上皮細(xì)胞活性及凋亡率的影響

2.2大黃牡丹湯對LPS損傷腸上皮細(xì)胞NLRP3、caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)水平的影響：與對照組相比，LPS組NLRP3、caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)；與LPS組相比，大黃牡丹湯各組細(xì)胞NLRP3、caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)，如表2、圖2所示。免疫熒光結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的NLRP3熒光強度相較于對照組顯著增強(P<0.05)，大黃牡丹湯各組細(xì)胞的NLRP3熒光強度相較于LPS組顯著降低(P<0.05)，見表2、圖3。

圖2 大黃牡丹湯對LPS損傷腸上皮細(xì)胞NLRP3、caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)水平的影響

圖3 大黃牡丹湯對LPS損傷腸上皮細(xì)胞NLRP3蛋白熒光強度的影響

表2 大黃牡丹湯對LPS損傷腸上皮細(xì)胞NLRP3 caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)水平的影響

2.3大黃牡丹湯對LPS損傷腸上皮細(xì)胞IL-1β和IL-18含量的影響:與對照組相比，LPS組細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，大黃牡丹湯各組細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18含量顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 大黃牡丹湯對LPS損傷腸上皮細(xì)胞IL-1β和IL-18含量的影響

3 討 論

革蘭氏陰性細(xì)菌感染可引起膿毒癥，該癥病情兇險，可導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)和器官功能障礙[6]。膿毒癥引起功能障礙的始發(fā)器官為腸道，細(xì)菌內(nèi)毒素主要活性成分脂多糖可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞屏障功能喪失，不僅破壞腸道功能還可引發(fā)全身免疫系統(tǒng)激活，促進慢性病毒感染和代謝性疾病的發(fā)展[7]。因此，尋找安全有效的藥物和治療方法保護腸上皮細(xì)胞，對于減輕膿毒癥癥狀非常重要。

Hersoug[8]等研究報道，腸道微生物群的脂多糖可刺激脂肪細(xì)胞，激活多個caspase蛋白，引起一種高度炎癥性的程序性細(xì)胞死亡(即焦亡)。細(xì)胞焦亡是于2001年發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞程序性死亡方式，有別于細(xì)胞凋亡和壞死，表現(xiàn)為：細(xì)胞膜出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞破裂使內(nèi)容物釋放，引起炎癥反應(yīng)[9]。細(xì)胞焦亡為一種依賴于caspase-1活化的炎性細(xì)胞死亡方式，受到病原信號刺激的NLRP3可結(jié)合pro-caspase-1形成炎性復(fù)合體，促使其活化為caspase-1，caspase-1則促進促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放，另外caspase-1還能切割GSDMD，使其N端片段釋放后結(jié)合細(xì)胞膜的磷脂類分子，致使細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞滲透壓發(fā)生變化，細(xì)胞腫脹膨大并最終破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外滲，造成細(xì)胞焦亡[10]。于此同時，細(xì)胞滲出物成為新的炎性刺激物，造成更加廣泛和劇烈的炎性反應(yīng)。Wen[11]等研究報道，清熱養(yǎng)陰祛濕丸能抑制NLPR3炎癥復(fù)合體激活，降低NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)，下調(diào)炎癥因子IL-1β和IL-18的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，減輕關(guān)節(jié)炎。熊云昭[12]等報道，對梗阻性腎病大鼠模型給予化瘀解毒方灌藥，可下調(diào)細(xì)胞炎性因子IL-1β等的表達(dá)，減輕腎臟炎性損傷。大黃牡丹湯出自《金匱要略》，方中大黃可逐瘀解毒、牡丹皮清熱散瘀、芒硝軟堅散結(jié)、桃仁破血、冬瓜仁利濕，使結(jié)瘀濕熱速下，消腫減痛[13]。本研究結(jié)果顯示，大黃牡丹湯可使LPS損傷腸上皮細(xì)胞活性顯著升高，降低細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞NLRP3、caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)顯著降低，IL-1β和IL-18含量顯著降低。提示大黃牡丹湯可能調(diào)控NLRP3/caspase-1通路，減少細(xì)胞焦亡。推測因大黃牡丹湯具有減輕炎癥反應(yīng)、阻止細(xì)胞焦亡的功效，可用于對炎癥性腸病的治療[14]。

綜上所述，大黃牡丹湯可抑制NLRP3/caspase-1信號通路的激活，降低細(xì)胞炎性反應(yīng)，對LPS誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞焦亡起保護作用。但中藥方的有效成分及作用機制較為復(fù)雜，且本研究并未設(shè)計陽性藥物處理組，因此，還需更多實驗探究其具體作用機制，也是下一步研究重點方向。