MicroRNA-27b介導(dǎo)沉默同源盒蛋白HOXB8對(duì)人胃癌干細(xì)胞樣特性的調(diào)節(jié)作用

楊向超，田由京，陳 禺，李 合

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科，海南 ?？?570102)

胃癌(gastric cancer)是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤疾病，死亡率位于第三位[1]。近年來(lái)，盡管在分子靶向治療方面取得了重大的進(jìn)展，但由于耐藥性和復(fù)發(fā)性的出現(xiàn)，使得胃癌患者的中位生存率仍然很低。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cell,CSC)是臨床放射療法和化學(xué)療法不敏感的重要原因，也是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素[2]。胃癌干細(xì)胞在胃癌進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，消除胃癌干細(xì)胞將大大有助于胃癌的治療。MicroRNA(miRNA)是一類保守的非編碼小RNA，通過(guò)與靶mRNA的3'UTR結(jié)合來(lái)抑制基因表達(dá)，在腫瘤干細(xì)胞的特性如自我更新、侵襲和腫瘤發(fā)生中均發(fā)揮作用[3]，目前已成為癌癥診斷研究的重點(diǎn)內(nèi)容，可能是臨床抗腫瘤治療的一項(xiàng)新策略。miR-27b是位于C9orf3基因第14個(gè)內(nèi)含子，以往研究表明，miR-27b參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，包括細(xì)胞周期、分化、轉(zhuǎn)移及黏附等[4]。同源盒蛋白B8(Homeobox B8，HOXB8)屬于HOX基因家族成員，是胚胎發(fā)育過(guò)程中的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可在不同部位和不同組織中表達(dá)，并與多種腫瘤(如結(jié)直腸癌、宮頸癌、肺癌、惡性膠質(zhì)癌等)的發(fā)生、發(fā)展有密切的相關(guān)性[5,6]。本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌組織中miR-27b與HOXB8表達(dá)，并通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)方法在胃癌干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-27b，探究其對(duì)胃癌干樣細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響，以期為尋找新的胃癌治療策略提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料：收集30例胃癌組織及距癌組織邊緣5 cm以上的癌旁正常組織，均為我院2018年6月至2020年6月胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，其中男性患者21例，女性患者9例，年齡28～71歲，平均(48.23±5.16)歲。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療等輔助治療，臨床資料完整。所有病例標(biāo)本由2位專業(yè)的病理科副主任醫(yī)師診斷，患者及家屬均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與材料:人胃癌細(xì)胞株SGC-7901(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，B27、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白血病抑制因子、DMEM/F1培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone)，Trizol試劑盒和Lipofectamine 3000試劑盒(美國(guó) Invitrogen)，TaqMan?advanced miRNA cDNA Synthesis試劑盒和TaqMan advanced miRNA Assays試劑盒(Genecopoeia公司)，PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(日本Takara)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(南京諾維贊)，CD44+磁珠分選試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific)，免疫熒光染色試劑(南京凱基生物)，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、PVDF膜、結(jié)晶紫染液和ECL試劑液(上海碧云天)，CCK-8試劑盒和EdU染色試劑盒(杭州四季青)，兔抗人HOXB8(英國(guó)Abcam)，鼠抗人GAPDH和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(上海昊鑫生物)。miR-27b mimic與陰性對(duì)照、WT-HOXB8 3’-UTR質(zhì)粒載體與MUT-HOXB8 3’-UTR質(zhì)粒載體均交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3方 法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR:將收集的胃癌組織及癌旁正常組織在無(wú)菌超凈臺(tái)剪碎，加入液氮研磨勻漿，Trizol試劑抽提總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度、濃度。根據(jù)TaqMan?advanced miRNA cDNA Synthesis試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取miRNA的cDNA，利用TaqMan advanced miRNA Assays試劑盒檢測(cè)組織中miR-27b表達(dá)，以U6作為內(nèi)參。擴(kuò)增條件為：95℃，10 min，循環(huán)1次；95℃，15 s，60℃，60 s，循環(huán)40次；根據(jù)PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取HOXB8基因的cDNA，按照SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒檢測(cè)組織中HOXB8 mRNA表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參。擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min，循環(huán)1次；95℃ 3 s、60℃ 30 s，循環(huán)14次，99℃ 10 min，循環(huán)1次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA與基因的相對(duì)表達(dá)量。使用的引物序列如下：miR-27b上游引物：5′-GGGGTTCACAGTGGCTAAG-3′；下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCAGAATTTGCGT-3′；HOXB8上游引物：5′-ACACAGCTCTTCCCTGGAT-3′；下游引物：5′-CTTCTCCAGCTAAAGGGTCT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGATTTGGTGTCGTATTGGGC-3′，下游引物：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′；均交由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù):通過(guò)生物信息學(xué)工具TargetScan7.2軟件，預(yù)測(cè)miR-27b與HOXB8 3’-UTR結(jié)合的靶位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)并合成野生型(WT-HOXB8 3’-UTR)和突變型(MUT-HOXB8 3’-UTR)HOXB8的3’-UTR質(zhì)粒載體。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，調(diào)整密度以1×105個(gè)/孔接種于24孔板內(nèi)，37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，使用 Lipofactamine 3000分別將miR-27b mimic或陰性對(duì)照(miR-27b NC)聯(lián)合構(gòu)建好的WT-HOXB8 3’-UTR質(zhì)粒載體或MUT-HOXB8 3’-UTR質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到SGC-7901細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，PBS沖洗細(xì)胞，加入裂解液裂解細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3.3胃癌干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定:取培養(yǎng)于37℃、5%CO2恒溫箱、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，以2000r/min離心5min，棄上清，加入含20 mg/L B27、10 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10 μg/L表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和20 μg/L白血病抑制因子的DMEM/F1培養(yǎng)液，制備細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，隔日半量換液，傳代培養(yǎng)。取80 μL的細(xì)胞懸液，加入20 μL CD44+免疫磁珠混勻，置于4℃避光孵化30 min，離心棄上清，加入 Buffer溶液洗滌細(xì)胞，再將細(xì)胞重懸，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，通過(guò)流式細(xì)胞儀分選CD44+標(biāo)記的細(xì)胞。取分選后的細(xì)胞，按免疫熒光染色試劑盒說(shuō)明流程操作，驗(yàn)證CD44+/EpCAM+雙抗陽(yáng)性表達(dá)，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察并拍攝圖片。

1.3.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的胃癌干細(xì)胞，調(diào)整密度以2×104個(gè)/孔接種于96孔板內(nèi)，37℃、5%CO2恒溫箱過(guò)夜培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、miR-27b NC組、miR-27b mimic組，將Lipofectamine 3000脂質(zhì)體分別與miR-27b mimic以及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照(miR-27b NC)轉(zhuǎn)染至胃癌干細(xì)胞，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，置于37℃、5%CO2恒溫箱轉(zhuǎn)染6 h，更換新鮮培養(yǎng)基，接著繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為保證轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染每2d執(zhí)行一次。

1.3.5Western Blot:收集轉(zhuǎn)染后的3組胃癌干細(xì)胞，加入PBS清洗，使用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，置于冰上裂解，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。制備10% SDS-PAGE凝膠，取等量各組蛋白樣品加樣，通過(guò)電泳分離蛋白質(zhì)，并電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉,室溫封閉2h，TBST洗膜，加入稀釋的兔抗人HOXB8(1∶500)一抗工作液，以鼠抗人GAPDH作為內(nèi)參蛋白(1∶1000)，4℃孵育過(guò)夜。次日，棄一抗工作液，TBST洗膜后，加入對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(1∶5000)二抗工作液，室溫孵育1h，TBST洗膜，利用ECL發(fā)光液顯色3min，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro-Plus系統(tǒng)分析各蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3.6CCK-8法:胃癌干細(xì)胞按照1.2.3方法轉(zhuǎn)染后，置于37℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h，每孔細(xì)胞中加入10μL CCK-8試劑液，混合均勻，繼續(xù)放在恒溫箱培養(yǎng)2h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450nm處吸光度值。

1.3.7EdU染色:收集轉(zhuǎn)染后的3組胃癌干細(xì)胞，調(diào)整密度按1×105個(gè)/孔接種在24孔板內(nèi)，置于37℃、5% CO2恒溫箱培養(yǎng)24h，再更換為終濃度10μmoL/L EdU的培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定20min，棄固定液，甘氨酸孵育5min，PBS洗滌后，滴加0.5% Triton X-100透膜10min，PBS再次洗滌細(xì)胞，加入Apollo567熒光染料室溫避光染色30min，清洗細(xì)胞后，通過(guò)Hoechst33342反應(yīng)液室溫避光孵育30min染核，PBS清洗細(xì)胞，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，紅色熒光為EdU陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.8細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn):收集轉(zhuǎn)染后的3組胃癌干細(xì)胞，胰酶消化，離心，加入含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基，吹打分散為單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞密度以1×103個(gè)/孔接種在96孔板內(nèi)，置于37℃、CO2恒溫中培養(yǎng)，1周后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞球形成情況，并測(cè)量球體直徑。

1.3.9細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn):收集轉(zhuǎn)染后的3組CRC-CSCs細(xì)胞，離心并吹打分散為單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞密度以1×103個(gè)接種到無(wú)菌培養(yǎng)皿，輕晃培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻，置于37℃、CO2恒溫箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)14d后出現(xiàn)明顯細(xì)胞集落，PBS清洗后，4%多聚甲醛固定菌落，0.5%結(jié)晶紫染液染色15min，流水沖洗干凈，干燥，光學(xué)顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)目，將≥50個(gè)細(xì)胞聚集即為1個(gè)細(xì)胞菌落。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織及癌旁組織中miR-27b與HOXB8表達(dá)比較：miR-27b在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織(t=36.768,P<0.001)，而HOXB8在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織(t=41.649,P<0.001)，見圖1。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織中miR-27b與HOXB8表達(dá)

2.2miR-27b與HOXB8靶向關(guān)系驗(yàn)證：通過(guò)TargetScan7.2預(yù)測(cè)到miR-27b與HOXB8 3’-UTR在特定區(qū)域存在堿基互補(bǔ)現(xiàn)象，見圖2A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，miR-27b mimic和WT-HOXB8 3’-UTR重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光值較miR-27b NC和WT-HOXB8 3’-UTR重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組顯著降低(t=23.165,P<0.001)，而miR-27b mimic和MUT-HOXB8 3’-UTR重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組與miR-27b NC和MUT-HOXB8 3’-UTR重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.569,P=0.278)，見圖2B。

圖2 miR-27b與HOXB8靶向關(guān)系驗(yàn)證

2.3胃癌干細(xì)胞的鑒定：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選前后胃癌干細(xì)胞比例，結(jié)果顯示出在分選前與分選后CD44+標(biāo)記的細(xì)胞亞群比例分別為1.34%、95.90%，可見分選后CD44+標(biāo)記的細(xì)胞亞群比例明顯增加(t=30.426,P<0.001)，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，說(shuō)明分選到高純度CD44+標(biāo)記的胃癌干細(xì)胞，見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選前后CD44+標(biāo)記的細(xì)胞亞群比例

通過(guò)免疫熒光染色觀察分選后細(xì)胞中CD44和EpCAM雙抗體的表達(dá)，可見CD44顯示綠色熒光，主要表達(dá)于細(xì)胞膜，EpCAM顯示紅色熒光，主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，見圖4。

圖4 免疫熒光染色觀察細(xì)胞中CD44和EpCAM

2.4轉(zhuǎn)染后胃癌干細(xì)胞miR-27b與HOXB8表達(dá)檢測(cè)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后胃癌干細(xì)胞中miR-27b表達(dá)，3組細(xì)胞間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.602，P<0.001)。與空白對(duì)照組比較，miR-27b mimic組細(xì)胞內(nèi)miR-27b表達(dá)顯著升高(P<0.01)，miR-27b NC組和空白對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.375)，見圖5A。Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后胃癌干細(xì)胞中HOXB8表達(dá)，3組細(xì)胞間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.771，P<0.001)。與空白對(duì)照組比較，miR-27b mimic組細(xì)胞內(nèi)HOXB8蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)，miR-27b NC組和空白對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.413)，見圖5B。

圖5 轉(zhuǎn)染后胃癌干細(xì)胞miR-27b與HOXB8表達(dá)比較

2.5miR-27b對(duì)胃癌干細(xì)胞活性影響：CCK-8檢測(cè)各處理組胃癌干細(xì)胞的活性，在轉(zhuǎn)染24、48、72h后，3組細(xì)胞間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F24h=14.782,P<0.001;F48h=17.253,P<0.001;F72h=26.033，P<0.001)。與空白對(duì)照組比較，miR-27b mimic組細(xì)胞活性在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著下降(P均<0.05)，而在各時(shí)間點(diǎn)miR-27b NC組和空白對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P24h=0.321；P48h=0.513;P72h=0.428)，見圖6。

圖6 CCK-8檢測(cè)各處理組胃癌干細(xì)胞活性

EdU染色結(jié)果如圖7所示，可見空白對(duì)照組和miR-27b NC組有大量EdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，而miR-27b mimic組中EdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少，3組細(xì)胞間EdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.581，P<0.001)。與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，miR-27b NC組和空白對(duì)照組之間則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.118)。

圖7 EdU染色檢測(cè)各處理組胃癌干細(xì)胞增殖(×100)

2.6miR-27b對(duì)胃癌干細(xì)胞干性維持的影響：細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果如圖8所示，通過(guò)倒置顯微鏡可觀察到空白對(duì)照組胃癌干細(xì)胞有大量細(xì)胞成球，直徑達(dá)到(515.46±40.48)μm，miR-27b NC組細(xì)胞也有大量細(xì)胞成球，直徑為(542.82±43.41)μm，而miR-27b mimic組細(xì)胞成球個(gè)數(shù)較少，直徑為(263.67±21.55)μm，球體積明顯變小。

圖8 細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)各處理組胃癌干細(xì)胞成球能力(左：×50；右：×200)

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9，3組細(xì)胞間克隆數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.903，<0.001)。與空白對(duì)照組比較，miR-27b mimic組胃癌干細(xì)胞克隆形成數(shù)目顯著減少(P<0.01)，而miR-27b NC組較空白對(duì)照組的細(xì)胞克隆數(shù)目之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.081)。

圖9 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各處理組胃癌干細(xì)胞克隆形成能力

3 討 論

胃癌在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)生率和死亡率，然而導(dǎo)致胃癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍不完全清楚，存在于胃癌組織中的腫瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的致瘤性，能夠產(chǎn)生更多促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的胃癌細(xì)胞亞群，是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，并且對(duì)化學(xué)治療藥物具有較強(qiáng)的抵抗力[2]。多項(xiàng)研究已表明，胃癌干細(xì)胞是負(fù)責(zé)啟動(dòng)胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和腫瘤耐藥的關(guān)鍵機(jī)制[8]，這為胃癌的診治研究提供了新視角。

細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)檢測(cè)是鑒定腫瘤干細(xì)胞的重要方法，目前，胃癌干細(xì)胞鑒定的幾種表面標(biāo)記物有CD133、CD44和醛脫氫酶1(ALDH1)。其中，CD44是具有多種生物學(xué)作用的跨膜糖蛋白，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起核心作用，以往研究結(jié)果表明，CD44+胃癌細(xì)胞比CD44-胃癌細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的成球能力和侵襲能力，CD44+胃癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性，目前使用CD44+標(biāo)記分選胃癌干細(xì)胞已在多項(xiàng)研究中運(yùn)用[7,9]。同樣，在本研究中通過(guò)CD44+標(biāo)記磁珠分選法分選胃癌干細(xì)胞后，再次通過(guò)CD44和EpCAM雙抗體進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示CD44+標(biāo)記的細(xì)胞亞群比例高達(dá)95.90%，說(shuō)明成功分選出胃癌干細(xì)胞。

胃癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，miRNA可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的表達(dá)影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，包括致瘤性、侵襲性以及耐藥性。miR-27b在多種癌癥類型中起著復(fù)雜的作用，例如：Zhang等人[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-27b在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平降低，通過(guò)靶向Snail1抑制肺癌的生長(zhǎng)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程；Feng等[11]研究指出miR-27b在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平均下調(diào)，且miR-27b在TNM分期較高、腫瘤組織較大的組織中表達(dá)更低。本研究結(jié)果同樣顯示，miR-27b在胃癌組織中表達(dá)降低，而在胃癌干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mimic以過(guò)表達(dá)miR-27b后發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞活性與增殖受到明顯抑制，同時(shí)腫瘤干細(xì)胞的成球能力與克隆形成能力均下降，由此推測(cè)，miR-27b可能在胃癌進(jìn)程中起著抑癌基因的作用。

HOX基因家族作為胚胎發(fā)育中的重要轉(zhuǎn)錄因子，在各種組織中差異表達(dá)。研究表明，該同源異形基因家族與多種癌癥及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展均相關(guān)聯(lián)。例如，HOXB8在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高，而抑制HOXB8表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法的敏感性增加有關(guān)[12]；HOXB8在人骨肉瘤組織和細(xì)胞系中均高度表達(dá)，敲低HOXB8可以通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制骨肉瘤的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[13]；在宮頸癌細(xì)胞中HOXB8作為miR-32-5p的下游調(diào)控靶標(biāo)，降低HOXB8表達(dá)可抑制HeLa細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力[14]。目前已發(fā)現(xiàn)HOXB8通過(guò)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來(lái)調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]，這一結(jié)果揭示沉默HOXB8可能與逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的惡性表型有關(guān)。但HOXB8在胃癌干細(xì)胞中的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)HOXB8是miR-27b的直接靶基因，miR-27b可負(fù)調(diào)控HOXB8的表達(dá)，這表明了miR-27b可能通過(guò)直接調(diào)節(jié)HOXB8影響了胃癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性。

綜上所述，在胃癌組織中miR-27b低表達(dá)而HOXB8高表達(dá)，HOXB8是miR-27b的靶標(biāo)基因，miR-27b通過(guò)調(diào)控HOXB8表達(dá)抑制胃癌干細(xì)胞活性與自我更新能力。本研究表明miR-27b可能為胃癌潛在的治療靶點(diǎn)，為今后該疾病的診治研究提供了新的切入點(diǎn)。