骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對高血壓大鼠血管內(nèi)皮的影響及機制研究

鄭 茜，張 勇，楊東偉

高血壓是以體循環(huán)動脈血壓升高為特征的慢性病，可伴有心、腦、腎等全身重要器官功能和器質(zhì)性損傷，是心腦血管病重要的危險因素[1]。血管內(nèi)皮功能受損是高血壓的重要發(fā)病機制，也是導(dǎo)致各靶器官損害的重要原因，因此，改善血管內(nèi)皮功能是治療高血壓的重要步驟[2-3]。外泌體(exosome，exo)是能被多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，可攜帶來源細(xì)胞的特征，與靶細(xì)胞受體結(jié)合，通過其攜帶和傳遞的蛋白、微小核糖核酸(microRNA，miRNA)、信使核糖核酸(messengerRNA，mRNA)等內(nèi)容物影響受體細(xì)胞功能[4]。研究證實，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)心肌梗死后新血管的形成，并有分化為心肌細(xì)胞的能力[5]，因此，BMSCs-exo成為心血管疾病治療研究的熱點。miRNA是外泌體發(fā)揮功能的重要物質(zhì)，miR-132-3p是具有血管形成能力的特異性miRNA，可調(diào)控血管內(nèi)皮功能，且經(jīng)Exocarta數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)BMSCs-exo含有miR-132-3p的表達(dá)[6]。目前關(guān)于BMSCs-exo在心肌梗死、腦缺血缺氧性損傷等方面的研究較多，但在高血壓方面的研究鮮見。故本研究通過分離培養(yǎng)誘導(dǎo)BMSCs-exo，干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，分析BMSCs-exo對高血壓大鼠血管內(nèi)皮的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SHR 40只，12周齡，體質(zhì)量260～280 g；SPF級雄性WKY大鼠10只，12周齡，體質(zhì)量260～280 g；SPF級WKY大鼠5只，2～3周齡，體質(zhì)量40～50 g。購自廣州市白云區(qū)龍歸興科動物養(yǎng)殖場，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2017-0042。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 EBM-2、L-DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，Ⅱ型膠原酶、雙抗(美國Hy Clone公司)，miR-132-3p高表達(dá)組慢病毒顆粒/空載體慢病顆粒(上海吉滿生物科技有限公司)，兔抗鼠CD63、CD81、CD34、CD45一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(德國默克公司)，內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)、前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，7500實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)、CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)，日立HITACHI透射電子顯微鏡(日本株式會社日立制作所)，M500熒光顯微鏡(賽默飛世爾科技中國有限公司)，moorLAB-NIBP小動物無創(chuàng)血壓測量儀(北京吉安得爾科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠BMSCs體外分離培養(yǎng)[7]及鑒定 脫頸法處死2～3周齡WKY大鼠，浸泡于75%乙醇中10 min，將雙下肢股骨、脛骨、肱骨取出放置于4%雙抗的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，暴露骨髓腔，以無菌注射器抽吸L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗獲取骨髓細(xì)胞，放置于離心管中，800×g離心5 min，去上清，L-DMEM完全培養(yǎng)基重懸，放置于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液1次，至細(xì)胞融合到80%～90%，傳代培養(yǎng)。

選取P3細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度1×106個/mL，分裝為5管，1管為對照組，剩余4管分別加入CD63、CD81、CD34、CD45，室溫避光孵育0.5 h，PBS洗滌后重懸細(xì)胞，以流式細(xì)胞技術(shù)鑒定細(xì)胞免疫表型。

1.2.2 BMSCs-exo培養(yǎng)及鑒定 應(yīng)用差速離心法提取BMSCs-exo，取生長良好的P3 BMSCs，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，更換15%不含外泌體的胎牛血清配制L-DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，4 ℃、500×g離心8 min，2 000×g離心20 min，取上清液，微孔濾過膜過濾后加入超速離心管中，4 ℃、120 000×g離心2 h，棄上清液，PBS沖洗管壁，更換新的超速離心管，4 ℃、120 000×g離心70 min，去上清，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。取外泌體懸液50 μL，2.5%戊二醛固定于100目碳膜銅網(wǎng)，濾紙吸去邊緣液體，加入3%磷鎢酸室溫下負(fù)染1 min，濾紙吸干后于烤燈下烤干，銅網(wǎng)置于樣品槽中，透射電鏡下調(diào)節(jié)焦距及亮度，觀察外泌體形態(tài)。

應(yīng)用20 μL RIPA裂解液提取膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分泌的外泌體(GSCs-exo)蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉液封閉2 h，加入CD63、CD81一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，孵育、曝光、顯影，以圖像分析軟件分析目的條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶β-actin比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.3 SHR分組及干預(yù)方法 SHR適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為BMSCs-exo組(10只)、對照組(10只)、miR-132-3p高表達(dá)組(10只)、miR-132-3p空載組(10只)，WKY大鼠為健康組(10只)。BMSCs-exo組以BMSCs-exo尾靜脈注射，每次30 μg，隔日1次，連續(xù)注射7次，miR-132-3p高表達(dá)組與miR-132-3p空載組分別以miR-132-3p高表達(dá)慢病毒顆粒和空載體慢病毒顆粒尾靜脈注射，每次0.1 mL，3 d注射1次，至BMSCs-exo組干預(yù)結(jié)束，對照組和健康組與BMSCs-exo組同法注射生理鹽水。

1.2.4 qRT-PCR檢測大鼠主動脈miR-132-3p表達(dá)情況 于-80 ℃保存主動脈，液氮中研磨后，采用Trizol法提取組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法鑒定后，進(jìn)行qRT-PCR，按照試劑盒說明書操作設(shè)置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性7 min，95 ℃變性20 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，重復(fù)40個循環(huán)。以U6為管家基因，2-△△ct為目的基因的相對表達(dá)強度，所有實驗重復(fù)3次取Ct平均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 血壓檢測 末次注射后6 h測量大鼠血壓，大鼠放置于鼠袋中，尾巴套入傳感器，信號穩(wěn)定后測量尾動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)，連續(xù)測量3次取平均值。

1.2.6 血管內(nèi)皮功能指標(biāo)ET-1、NO、TXB2、PGI2水平檢測 檢測血壓后，禁食不禁水12 h，眶靜脈取血2 mL，4 ℃靜置2 h，3 500 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上層血漿，以酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測ET-1、TXB2、PGI2含量，以化學(xué)一步法檢測NO含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.7 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察主動脈病理變化 眶靜脈取血后迅速開胸，分離胸主動脈，PBS沖洗，以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm厚度切片，HE染色，光鏡下觀察病理變化。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs形態(tài)觀察及鑒定 倒置顯微鏡下觀察，原代BMSCs培養(yǎng)1 d開始貼壁，形態(tài)以圓形或梭形多見；培養(yǎng)5 d，可見貼壁細(xì)胞形態(tài)較為一致，各集落細(xì)胞呈旋渦狀排列，逐漸融合成片；P3細(xì)胞形態(tài)為梭形或多角形，形態(tài)均一，增殖較快，成旋渦狀分布。詳見圖1。流式細(xì)胞術(shù)鑒定P3 BMSCs表面標(biāo)志物結(jié)果顯示CD63、CD81表達(dá)陽性，表達(dá)率分別為99.9%、58.6%，CD34、CD45表達(dá)陰性，表達(dá)率分別為0.3%、1.2%，符合BMSCs表面抗原表達(dá)。詳見圖2。

圖1 BMSCs形態(tài)觀察(×40)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定P3 BMSCs表面標(biāo)志物

2.2 BMSCs-exo形態(tài)觀察鑒定 透射電鏡觀察，BMSCs-exo為類圓形、脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小泡，腔內(nèi)可見低密度亮光區(qū)，詳見圖3。蛋白印跡法(Western Blot)檢測外泌體膜CD81、CD63蛋白陽性，詳見圖4。

圖3 透射電鏡觀察BMSCs-exo形態(tài)(×50 000)

圖4 Western Blot檢測BMSCs-exo膜蛋白表達(dá)

2.3 各組miR-132-3p相對表達(dá)量比較 各組miR-132-3p相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與健康組比較，對照組、BMSCs-exo組、miR-132-3p空載組miR-132-3p相對表達(dá)量降低，miR-132-3p高表達(dá)組相對表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，BMSCs-exo組、miR-132-3p高表達(dá)組miR-132-3p相對表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與BMSCs-exo組比較，miR-132-3p高表達(dá)組miR-132-3p相對表達(dá)量升高，miR-132-3p空載組相對表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組miR-132-3p相對表達(dá)量與miR-132-3p空載組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組miR-132-3p相對表達(dá)量比較(±s)

2.4 各組尾動脈收縮壓比較 各組尾動脈收縮壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與健康組比較，對照組、BMSCs-exo組、miR-132-3p高表達(dá)組、miR-132-3p空載組尾動脈收縮壓均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，BMSCs-exo組、miR-132-3p高表達(dá)組尾動脈收縮壓降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與BMSCs-exo組和miR-132-3p高表達(dá)組比較，miR-132-3p空載組尾動脈收縮壓升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BMSCs-exo組與miR-132-3p高表達(dá)組尾動脈收縮壓比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照組與miR-132-3p空載組尾動脈收縮壓比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組尾動脈收縮壓比較(±s) 單位：mmHg

2.5 各組血漿ET-1、NO、TXB2、PGI2水平比較 各組血漿ET-1、NO、TXB2、PGI2比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與健康組比較，對照組、BMSCs-exo組、miR-132-3p高表達(dá)組、miR-132-3p空載組ET-1、TXB2水平升高，NO、PGI2水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，BMSCs-exo組、miR-132-3p高表達(dá)組ET-1、TXB2水平降低，NO、PGI2水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與BMSCs-exo組和miR-132-3p高表達(dá)組比較，miR-132-3p空載組血漿ET-1、TXB2水平升高，NO、PGI2水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BMSCs-exo組ET-1、NO、TXB2、PGI2與miR-132-3p高表達(dá)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照組與miR-132-3p空載組ET-1、NO、TXB2、PGI2比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組血漿ET-1、NO、TXB2、PGI2水平比較(±s)

2.6 各組主動脈病理變化觀察 健康組主動脈血管壁結(jié)構(gòu)正常，無明顯的內(nèi)膜增生，細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊；對照組大鼠胸主動脈血管壁增厚明顯，血管壁面積增大，管腔狹窄，動脈壁中層平滑肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂；BMSCs-exo組、miR-132-3p高表達(dá)組有血管內(nèi)膜增厚及管腔縮小表現(xiàn)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列不齊，病理變化較對照組輕，但BMSCs-exo組、miR-132-3p高表達(dá)組病理變化相當(dāng)；miR-132-3p空載組主動脈血管壁結(jié)構(gòu)病理變化與對照組相當(dāng)。詳見圖5、圖6。

圖5 各組大鼠主動脈血管腔HE染色圖(×40)

圖6 各組大鼠主動脈血管壁HE染色圖(×400)

3 討 論

原發(fā)性高血壓是由遺傳和環(huán)境因素綜合作用的臨床綜合征，為臨床常見的慢性病之一[8]。長期動脈血壓升高可增加靶器官的壓力負(fù)荷，并觸發(fā)血管重塑與血管內(nèi)皮功能異常，直接影響心、腦、腎等器官的灌注，并造成交感神經(jīng)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)的過度激活、代謝異常及炎癥會加重對靶器官的損害[9]。近年來細(xì)胞旁分泌效應(yīng)成為研究熱點，外泌體是旁分泌效應(yīng)中發(fā)揮作用的關(guān)鍵物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs-exo參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，其攜帶和傳遞的內(nèi)容物可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[10]。因BMSCs旁分泌效應(yīng)強，且有體外易分離培養(yǎng)、增殖速率快、擴增能力強的優(yōu)勢，是提取外泌體的理想細(xì)胞。通過探索BMSCs-exo對高血壓大鼠血管內(nèi)皮的影響及機制，可為高血壓病的分子機制和治療研究提供新的思路。

外泌體是細(xì)胞間通信通路的重要媒介，含有來源細(xì)胞形式功能的關(guān)鍵分子。BMSCs具有多向分化功能，能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，應(yīng)用于心血管疾病、糖尿病腎病等疾病的治療[11]。李紅巖等[12]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植可降低野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠的肺動脈壓。Varela 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)新生血管的形成，降低腎血管性高血壓大鼠的血壓水平，改善腎功能，為BMSCs-exo治療高血壓奠定了基礎(chǔ)。內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的功能障礙與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)。ET-1、NO、TXB2、PGI2是由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的血管活性物質(zhì)，可反映血管內(nèi)皮功能[14]。NO與PGI2是血管張力的主要調(diào)節(jié)因子，各種病理因素導(dǎo)致的內(nèi)皮依賴性血管舒縮功能障礙，可使NO與PGI2合成釋放性下降，血壓升高[15]；ET-1與TXB2具有收縮血管作用，其水平的升高是導(dǎo)致血壓升高的重要原因[16-17]。本研究中顯微鏡下可觀察BMSCs培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)鑒定P3 BMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)符合特征；透射電鏡下可見BMSCs-exo為類圓形、脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊狀小泡，Western Blot檢測表達(dá)相關(guān)標(biāo)志蛋白，提示BMSCs-exo提取成功；BMSCs-exo組尾動脈收縮壓及血漿ET-1、TXB2水平均低于對照組，血漿NO、PGI2水平均高于對照組，主動脈病理變化觀察顯示BMSCs-exo組存在血管內(nèi)膜增厚及管腔縮小表現(xiàn)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列不齊等病理改變，且病理變化較對照組輕，說明BMSCs-exo可降低高血壓大鼠血壓，改善血管內(nèi)皮功能，減輕血管病理改變。

本研究結(jié)果還顯示BMSCs-exo組、miR-132-3p高表達(dá)組的miR-132-3p相對表達(dá)量均高于對照組；miR-132-3p高表達(dá)組的尾動脈收縮壓及血漿ET-1、TXB2水平均低于對照組，血漿NO、PGI2水平均高于對照組；BMSCs-exo組尾動脈收縮壓及血漿NO、PGI2、ET-1、TXB2水平與miR-132-3p高表達(dá)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明BMSCs-exo組可能通過調(diào)節(jié)miR-132-3p的表達(dá)，降低高血壓大鼠的尾動脈壓，改善血管內(nèi)皮功能，減輕病理變化。miR-132是具有組織特異性的多功能miRNA，具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性。miR-132-3p是miR-132家族成員，在內(nèi)皮靶向p120RasGAP，誘導(dǎo)新血管形成，改善血管內(nèi)皮功能[18]。Wang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)老年SHR存在miRNA譜失調(diào)，包括miR-132-3p。杜東輝等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miR-132-3p間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可修復(fù)缺氧受損腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。以上分析與研究證實，BMSCs-exo可能通過上調(diào)miR-132-3p的表達(dá)，降低高血壓大鼠血壓，改善血管內(nèi)皮功能，緩解動脈血管病理變化。

綜上所述，BMSCs-exo具有調(diào)節(jié)高血壓大鼠血壓、改善血管內(nèi)皮功能、減輕動脈血管病變的作用，其機制可能與升高miR-132-3p的表達(dá)有關(guān)。在今后高血壓疾病的治療中，可考慮將BMSCs-exo作為研究方向。