宏基因組二代測序在肺部感染診治的臨床價值

馮玲 熊佳麗 易榮 劉毅

肺部感染是臨床常見的呼吸道疾病，發(fā)病率高，是我國乃至全球范圍內(nèi)感染相關(guān)性疾病死亡的主要原因[1]。尤其隨著臨床上癌癥治療、器官移植中免疫抑制劑的使用以及艾滋病等疾病導(dǎo)致的免疫受損患者增多，肺部感染有增加趨勢，早期針對性的抗病原學(xué)治療，是患者獲得有效治療的前提。但常規(guī)檢測方法的陽性率不高，加上臨床上經(jīng)驗性抗感染治療，使得其陽性率進一步降低，顯然不能滿足臨床的需求，從而為肺部感染的診斷及治療帶來了難題[2-3]。宏基因組二代測序(Metagenomic next-generation sequencing, mNGS)是新興的一種病原體檢測方法，通過對標(biāo)本中的所有微生物進行測序，根據(jù)不同微生物的序列數(shù)，進行結(jié)果判讀，有效識別致病病原體，具有覆蓋面廣、周期相對短等優(yōu)點，因此近年來吸引了眾多研究者的目光[4]。本研究以住院期間完善了mNGS檢查的肺部感染患者為研究對象，回顧性分析患者的臨床資料，從不同患病人群、不同病原體等層面出發(fā)，旨在探究mNGS在肺部感染病原學(xué)診斷的臨床應(yīng)用價值。

資料與方法

一、臨床資料

本研究收集2018年1月至2020年7月在株洲市中心醫(yī)院住院期間行mNGS檢查的59例肺部感染患者的臨床資料。其中男43例(72.88%)，女16例(27.12%)，年齡15～91歲，平均年齡61.90±18.44歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床診斷為肺部感染，診斷標(biāo)準(zhǔn)：1.肺炎相關(guān)臨床表現(xiàn)：1)新近出現(xiàn)的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；2)發(fā)熱；3)肺實變體征和/或聞及濕性啰音；4)外周血白細胞計數(shù)>10×109/L或<4 ×109/L，伴或不伴細胞核左移。2.胸部影像學(xué)檢查顯示新出現(xiàn)的斑片狀浸潤影、葉或段實變影、磨玻璃影或間質(zhì)性改變，伴或不伴胸腔積液。符合第1條中任何1項及第2條[5]。(2)住院期間完善BALF-mNGS，送檢標(biāo)本符合mNGS要求，同時還使用了常規(guī)方法進行檢測。排除標(biāo)準(zhǔn):臨床資料不完整。

二、研究方法

1 臨床資料收集：通過我院電子病歷系統(tǒng)收集入選患者的一般信息(姓名、性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、既往用藥史)、住院期間BALF-mNGS及其他病原學(xué)檢測方法的結(jié)果(如：培養(yǎng)、涂片、G實驗、GM實驗、免疫學(xué)檢測等)，治療前后的臨床癥狀、影像學(xué)檢查及炎癥指標(biāo)(血常規(guī)、血沉、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原)。

2 mNGS檢測方法：臨床采集的標(biāo)本，均送至華大基因公司進行檢測，基于宏基因二代測序技術(shù)，對樣本中微生物核酸序列進行分析，通過與數(shù)據(jù)庫中已有微生物的核酸序列進行比對，從而對微生物進行鑒定。檢測過程包括：核酸提取、文庫構(gòu)建、測序、信息分析、報告解讀等。

3 致病原確定方法：(1)常規(guī)方法致病原確定方法：細菌、真菌、結(jié)核等菌體的致病原檢查診斷金標(biāo)準(zhǔn)為培養(yǎng)；病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)：核酸檢測陽性。(2)mNGS致病原確定方法：mNGS的致病原確定方法：① 對于細菌(不包括分枝桿菌)、病毒和寄生蟲：mNGS鑒定出物種水平的覆蓋率比其他任何微生物高出10倍；② 真菌：mNGS鑒定出的微生物其覆蓋率比其他任何真菌高5倍，對于曲霉菌，以屬嚴格序列數(shù) (SMRNG)或種嚴格序列數(shù)(SMRN)≥2 為陽性；③ 結(jié)核分枝桿菌當(dāng)至少1個序列被映射到物種或?qū)偎綍r被認為是陽性的[6-7]。

本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院倫理委員會審查同意(批號：(2019)倫審(科)第(08045)號)。

三、 統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、一般資料

符合入組標(biāo)準(zhǔn)的肺部感染患者共計59例，其中男43例，女16例，平均年齡61.90±18.44歲。無基礎(chǔ)疾病組的男性16例，女性9例，有基礎(chǔ)疾病的男性27例，女性7例，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.188)。無基礎(chǔ)疾病組的年齡58.40±21.79歲，有基礎(chǔ)疾病組的年齡64.47±15.36歲，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.240)(見表1)。

表1 入選患者基礎(chǔ)疾病情況

二、mNGS與常規(guī)方法陽性率比較

在59個病例中，BALF-mNGS檢測陽性59例(100%)，常規(guī)方法檢測陽性43例(72.88%)，BALF-mNGS的陽性率明顯較常規(guī)方法高(P<0.001)。并且無論是有基礎(chǔ)疾病，還是無基礎(chǔ)疾病，mNGS均較多種常規(guī)方法聯(lián)合(如痰涂片、痰培養(yǎng)、BALF培養(yǎng)、G實驗、GM實驗以及一些抗原、抗體檢測)的檢出陽性率高(P<0.05)(見表2)。

表2 BALF-mNGS和常規(guī)方法的檢出總陽性率比較[n(%)]

進一步我們對比了BALF-mNGS和BALF培養(yǎng)陽性率差別，BALF-mNGS的陽性率顯著高于BALF培養(yǎng)(P<0.001)，進一步分析無基礎(chǔ)疾病與有基礎(chǔ)疾病組的差別，發(fā)現(xiàn)兩組BALF-mNGS的陽性率均顯著高于BALF培養(yǎng)(P<0.001)(見表3)。

表3 BALF-mNGS和BALF培養(yǎng)陽性率比較[n(%)]

三、mNGS及常規(guī)方法的臨床采信率比較

在BALF-mNGS檢測陽性的59例中，其中采信的42例，mNGS結(jié)果未被采納的：其中11例病原體檢出序列數(shù)少，無法充分支持其為致病原；6例因病原種類多且分散，再結(jié)合臨床(病史、影像、癥狀等)，無法分辨致病菌、定植菌、污染菌。常規(guī)檢測方法陽性43例，臨床采信的21例；BALF-mNGS的臨床采信率高于常規(guī)方法(P<0.05)。聯(lián)合兩種方法采信的有47例，與單用常規(guī)方法檢測，采信率顯著高(P<0.01)，但與單用BALF-mNGS相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

表4 BALF-mNGS和常規(guī)方法的采信率比較

隨后，我們對比了無基礎(chǔ)疾病及有基礎(chǔ)疾病組的BALF-mNGS的采信率，有基礎(chǔ)疾病組陽性例數(shù)有34例，其中采信的占25例，無基礎(chǔ)疾病的陽性例數(shù)25例，其中采信的17例，兩組之間采信率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

四、mNGS對不同病原體的診斷價值

在59例肺部感染患者中，聯(lián)合BALF-mNGS和常規(guī)方法最后明確病原的有47例，其中診斷為細菌性肺炎的24例，病毒性肺炎0例，非典型病原體感染1例(肺炎支原體)；肺結(jié)核13例；真菌性肺炎3例(念珠菌2例，曲霉菌1例)；混合性肺部感染6例(細菌+真菌感染5例，病毒+真菌1例)。BALF-mNGS對細菌性肺炎的檢出率顯著高于常規(guī)方法(P<0.05)，但真菌、結(jié)核菌及混合性感染檢出率兩者間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。此外，在混合性肺部感染中，聯(lián)合mNGS和常規(guī)方法的檢測完整率較單用常規(guī)方法顯著高(P<0.05)(見表5)。

表5 BALF-mNGS和常規(guī)方法的不同病原體檢出率比較[n(%)]

討 論

肺部感染是好發(fā)于各年齡階段的呼吸道疾病，據(jù)統(tǒng)計分析，近年來呼吸道感染性疾病病原學(xué)的流行病學(xué)也發(fā)生了變遷，主要表現(xiàn)為：1)發(fā)病率增加2)主要菌種分布改變3)新型病原體出現(xiàn)4)耐藥率的增加；有些甚至出現(xiàn)混合性肺部感染，因此針對性的抗病原學(xué)治療，無疑是獲得有效治療的前提[8]。近年來關(guān)于mNGS的研究有許多，但作為一種新技術(shù)，其是否能替代常規(guī)病原學(xué)檢測方法，仍具有爭議[9]。

首先，我們初步評估了BALF-mNGS在肺部感染中的檢測陽性率及臨床采信率。目前國內(nèi)外有研究證實了mNGS較培養(yǎng)、PCR等檢測方法的敏感性及特異性高[10-13]。我們的研究數(shù)據(jù)表明，BALF-mNGS陽性率高于BALF培養(yǎng)，并且其陽性率及采信率均較多種常規(guī)方法聯(lián)合高。此外，mNGS在有基礎(chǔ)疾病組及無基礎(chǔ)疾病組間的陽性率及采信率差別不大。實際上，mNGS往往多被用于有基礎(chǔ)疾病人群，尤其是合并免疫致?lián)p疾病的，因為往往免疫力低下患者肺部感染致病原更復(fù)雜、合并罕見病原體的幾率相對更大，治療難度也大。而mNGS能通過比較不同病原的相對序列數(shù)，幫助盡早篩選出可能的致病菌，早期識別混合性感染、罕見病原體以及新型病原體[6,14-15]。對于無基礎(chǔ)疾病組，盡管我們的數(shù)據(jù)顯示常規(guī)方法的陽性率不及mNGS，但該類患者大多為常見病原體、或者對經(jīng)驗性治療佳，mNGS對于常見病原體的優(yōu)勢并不顯著，并且不及常規(guī)檢測方法經(jīng)濟。

其次，我們探討了mNGS對不同病原的診斷價值，綜合多項研究，mNGS對于常見菌的檢測效果較培養(yǎng)相比無明顯優(yōu)勢，但對于少見病原體、病毒、結(jié)核菌、真菌、混合性肺部感染的作用更可觀[4,16-17]。我們的數(shù)據(jù)表明：mNGS檢出細菌的陽性率較常規(guī)方法高，對于真菌、結(jié)核分枝桿菌及混合性感染兩種方法檢出率相當(dāng)，但對于混合性肺部感染，mNGS與常規(guī)方法聯(lián)合檢測更全面。這與他人的研究存在差異，綜合多因素考慮：1) 真菌及結(jié)核分枝桿菌在經(jīng)試劑處理后，核酸的釋放量相對低，因此限制了mNGS的檢測效力；2) 結(jié)核分枝桿菌、真菌及混合性肺部感染檢出例數(shù)相對較少，不能全面的反映mNGS的檢測效率。綜合考慮，mNGS的病原體檢測能力較常規(guī)方法更可觀。但無論如何，mNGS對于真菌及結(jié)核分枝桿菌檢測的總體陽性率低，后期如何更進一步提高這種微生物的檢測陽性率，值得深入研究。

綜上所述，mNGS在肺部感染中能有效提高病原體的檢出陽性率及采信率，能早期較直觀的識別出致病原，對于混合性肺部感染，可將mNGS與常規(guī)檢測方法聯(lián)合，從而增加診斷的精準(zhǔn)度。

本研究的不足：該研究為回顧性研究，樣本量有限，各組的樣本量相對不均衡，需擴大樣本量，同時盡量保持組間樣本量均衡，增加結(jié)果的準(zhǔn)確性。