白蠟窄吉丁氣味結(jié)合蛋白AplaOBP2的定位、配體結(jié)合特性及配體活性*

宋 玄 王澤華 虞國躍 王 凡,4 單 雙 張永軍 王山寧

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所 北京 100097; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193; 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 北京 100193; 4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第三師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 圖木舒克 843900)

嗅覺在昆蟲尋求寄主、配偶、產(chǎn)卵場和躲避天敵等行為中發(fā)揮重要功能(Bruceetal., 2005; Takken, 1991; Vetetal., 1992; Visser, 1986 )。觸角作為昆蟲主要的嗅覺器官，其表面分布多種形態(tài)的嗅覺感器。嗅覺感器腔內(nèi)的嗅覺受體神經(jīng)元(olfactory receptor neurons, ORNs)樹突，能夠特異地感受外界的化學(xué)信號(hào)(Binyameenetal., 2012; Steinbrecht, 1997; Zacharuk, 1980)。氣味分子由嗅覺感器壁上的微孔進(jìn)入感器腔，穿過感器淋巴液，到達(dá)ORNs樹突，激活樹突上的受體蛋白，最終引起昆蟲的不同行為反應(yīng)(Hanssonetal., 2011; Pelosi, 1996; Kriegeretal., 1999; Wilsonetal., 2006)。研究表明多種功能蛋白參與這一過程，其中氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)是主要的外周嗅覺蛋白，在昆蟲嗅覺系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能(Leal, 2013; Pelletieretal., 2010; Vogtetal., 1981; Xuetal., 2005； Yeetal., 2017)。

昆蟲OBPs是一類小分子量的水溶性蛋白，最早是從鱗翅目昆蟲觸角中分離鑒定，目前認(rèn)為OBPs幾乎在所有的昆蟲中都有表達(dá)(Hekmat-Scafeetal., 2002; Pelosietal., 2014; Vieiraetal., 2011; Vogtetal., 1981)。在昆蟲觸角中，OBP蛋白由位于感器下方的輔助細(xì)胞合成，隨后被大量分泌到感器腔的淋巴液中(Laueetal., 1994; Steinbrechtetal., 1995; Vogtetal., 1981)。盡管OBPs在嗅覺感知中的特定生理作用尚不完全清楚，但人們普遍認(rèn)為它們?cè)诮Y(jié)合、運(yùn)輸疏水性氣味通過水溶性淋巴液到達(dá)ORNs樹突上的嗅覺受體中起著重要作用(Leal, 2013; Pelosietal., 2014)。隨著OBPs在越來越多的昆蟲中被鑒定，不同昆蟲OBPs的表達(dá)分析表明，僅有部分OBP基因特異表達(dá)在化學(xué)感覺器官，OBP基因在其他非化學(xué)感覺器官也有表達(dá)，可能參與多種生理功能(Dippeletal., 2014; Forêtetal., 2006; Mckenzieetal., 2014; Pelosietal., 2017; 楊葉青等, 2017)。觸角表達(dá)的OBPs選擇性地表達(dá)在不同類型的嗅覺感器中，參與不同化合物的結(jié)合運(yùn)輸，但是并不是所有嗅覺感器都需要OBP蛋白參與運(yùn)輸氣味分子到嗅覺受體(Huangetal., 2018; Jiangetal., 2018; Larteretal., 2016; Pikielnyetal., 1994; Wangetal., 2018 )

白蠟窄吉丁(Agrilusplanipennis)，是近年來發(fā)生和危害比較嚴(yán)重的國際性檢疫害蟲，主要為害木犀科(Oleaceae)白蠟樹屬(Fraxinus)樹木。該蟲是東北亞地區(qū)的本土昆蟲， 2002年傳入北美，迄今已造成北美地區(qū)數(shù)百萬白蠟樹死亡(Hermsetal., 2014; Morinetal., 2017)。同其他昆蟲一樣，白蠟窄吉丁成蟲通過感受不同類型的信息化合物來尋找配偶以及適宜寄主。近年來，國外研究者對(duì)該蟲的化學(xué)生態(tài)學(xué)做了大量的研究： 明確了白蠟窄吉丁寄主識(shí)別相關(guān)的信息化合物主要種類，鑒定了參與雌雄蟲交配的性信息素組分，并挖掘了12個(gè)OBPs基因和47個(gè)氣味受體基因(odorant receptors, ORs)等多種可能參與嗅覺識(shí)別的基因(Anderssonetal., 2019; Crooketal., 2008a; de Grootetal., 2008; Mamidalaetal., 2013; Rodriguez-Saonaetal.， 2006； Silketal., 2009)，然而各種嗅覺基因的功能尚未展開研究。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)白蠟窄吉丁基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定了11個(gè)氣味結(jié)合蛋白(AplaOBP1-11)序列，組織表達(dá)譜結(jié)果表明3個(gè)OBP基因(AplaOBP1-3)在雌雄觸角特異表達(dá)，其中AplaOBP1可以識(shí)別月桂烯、檸檬烯、橙花叔醇等多種寄主揮發(fā)物(Wangetal., 2020)，推測其他觸角特異表達(dá)的OBPs在白蠟窄吉丁嗅覺識(shí)別中同樣發(fā)揮重要功能。

因此，本研究重組表達(dá)了AplaOBP2蛋白，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)從蛋白水平進(jìn)一步對(duì)AplaOBP2在觸角感器中進(jìn)行定位，通過熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)研究AplaOBP2重組蛋白的配體結(jié)合特性，并通過昆蟲電生理和行為學(xué)試驗(yàn)研究配體的生物活性，以期為闡明白蠟窄吉丁嗅覺識(shí)別機(jī)制和通過氣味結(jié)合蛋白篩選該蟲信息化合物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試?yán)ハx 分別于2018年和2019年4月中旬，于北京郊區(qū)(延慶、平谷、通州和昌平)白蠟樹林地，將受害美國紅梣(F.pennsylvanica)砍伐(10棵)，主干截成約50 cm的木段，帶回北京市農(nóng)林科學(xué)院。將木段置于戶外背陰處，用100目的尼龍網(wǎng)罩住，待白蠟窄吉丁成蟲自然羽化。5月上旬觀察到羽化成蟲，將成蟲轉(zhuǎn)移至養(yǎng)蟲盒內(nèi)，飼喂白蠟樹葉片，用于試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3) 及測定蛋白濃度試劑購自天根生化科技(北京)有限公司； 柱填料購自北京信諾晶科生物技術(shù)有限公司； 重組腸激酶Ecombinant Entherokinase 購自安諾倫(北京)生物科技有限公司； 組織蛋白抽提試劑盒、Western Blot Kit和eECL Western Blot試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司； 熒光探針N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN)和氣味標(biāo)樣分別購自美國Sigma 公司、日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社(TCI) 、上海麥克林生化科技有限公司和化學(xué)慧； 南京金斯瑞公司提供基因合成和表達(dá)載體構(gòu)建； 北京信諾晶科生物技術(shù)有限公司提供抗體制備服務(wù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 AplaOBP2重組表達(dá) 白蠟窄吉丁AplaOBP2基因(GenBank登錄號(hào): KU342581)序列從白蠟窄吉丁基因組數(shù)據(jù)中獲得。去信號(hào)肽后的AplaOBP2基因序列由南京金斯瑞進(jìn)行合成并克隆到表達(dá)載體pET30a(+)。重組質(zhì)粒測序正確后轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。單克隆菌株在含有100 mg·mL-1卡那霉素的培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，待OD600值為0.6～0.8時(shí)，向培養(yǎng)基中加入IPTG 至終濃度為1 mmol·L-1，在18 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)16 h。超聲破碎后，離心收集包涵體，用于蛋白純化。包涵體處理步驟如下： 用溶液Ⅰ(50 mmol·L-1Tris, 0.2%Triton X-100, pH6.8) 洗包涵體沉淀，離心后將沉淀溶于10 mL 6 mol·L-1鹽酸胍，加入10 mL 溶液Ⅱ(10 mmol·L-1DTT, 200 mmol·L-1Tris, pH8.0)，室溫100 r·min-1孵育60 min； 加入4 mL 溶液Ⅲ( 0.5 mol·L-1NaOH, 5 mmol·L-1Cystine)，室溫孵育10 min； 加入10倍體積的溶液Ⅳ(5 mmol·L-1Cysteine, 100 mmol·L-1Tris, pH 8.0)，室溫100 r·min-1孵育過夜； 離心收集上清并用透析袋在PBS蛋白緩沖液中透析過夜。利用HisTrap親和層析柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化，純化蛋白用重組腸激酶30 ℃孵育12 h。再次用HisTrap親和層析柱純化，經(jīng)超濾濃縮后得到無His-tag的AplaOBP2重組蛋白。采用Bradford法對(duì)AplaOBP2蛋白濃度進(jìn)行測定(Bradford, 1976)，通過4%～20% SDS-PAGE電泳檢測各階段目的蛋白的表達(dá)情況。純化的無His標(biāo)簽AplaOBP2重組蛋白送北京信諾晶科生物技術(shù)有限公司制備多克隆抗體。

1.2.2 Western blot檢測 取羽化1～3天的白蠟窄吉丁觸角30對(duì)，參照組織蛋白抽提試劑盒說明書提取觸角粗蛋白。具體操作步驟如下： 將提取試劑置于冰上預(yù)冷2～3 min，按照1∶99的比例加入蛋白酶抑制劑，配成1×工作液。向1.5 mL 離心管中加入400 μL工作液，碾磨觸角樣品，置于冰中孵育20 min，然后在4 ℃、12 000 r·min-1下離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，獲得觸角組織粗蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

AplaOBP2重組蛋白和觸角粗蛋白通過4%～20% SDS-PAGE電泳分離，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。參照Western Blot Kit說明書進(jìn)行Western blot操作。參照eECL Western Blot試劑盒說明書，將增強(qiáng)型發(fā)光劑和穩(wěn)定劑等體積混合，配成化學(xué)發(fā)光檢測底物工作液，使用化學(xué)發(fā)光成像分析儀(AI680, GE, USA) 進(jìn)行檢測。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測 將白蠟窄吉丁雌、雄成蟲觸角浸入含4%多聚甲醛和2%戊二醛的0.1 mol·L-1PBS(pH7.4)溶液中4 ℃固定過夜； 樣品經(jīng)乙醇梯度脫水后，置于LR白色樹脂(Taab, Aldermaston, Berks, UK)中60 ℃聚合。使用Reichert Ultracut超薄切片機(jī)(Reichert Company, Vienna, Austria)進(jìn)行切片，厚度為60～80 nm，切片用銅網(wǎng)收集。將含有切片的銅網(wǎng)用雙蒸水沖洗后，置于20 μL PBSG(PBS含有50 mmol·L-1甘氨酸)中孵育5 min，重復(fù)該步驟1 次； 銅網(wǎng)用重蒸水沖洗6 次，轉(zhuǎn)移到20 μL PBST(PBS含0.01%的明膠、1%牛血清白蛋白和0.02%Tween-20)孵育5 min，重復(fù)該步驟1次。雙蒸水沖洗后，銅網(wǎng)置于20 μL一抗(PBST稀釋，1∶5 000)，室溫孵育1 h后，4 ℃過夜。雙蒸水沖洗后，將銅網(wǎng)移至膠體金顆粒偶聯(lián)的羊抗兔二抗(PBST稀釋，1∶20)室溫避光孵育90 min； 經(jīng)PBST、PBSG和雙蒸水清洗后，加增感液避光20 min進(jìn)行銀增感； 雙蒸水清洗后，用2%醋酸雙氧鈾染色10 min； 再用雙蒸水清洗，干燥后用Hitachi H-7500 TEM(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)透射電鏡進(jìn)行觀察； 用免疫前的兔血清代替一抗作為陰性對(duì)照。雌蟲和雄蟲縱切和橫切樣品，各3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 熒光競爭結(jié)合試驗(yàn) 以58種氣味物質(zhì)為候選配體，其中包括27種寄主植物揮發(fā)物(表1)，利用F-380熒光分光光度計(jì)(天津港東科技發(fā)展股份有限公司，天津)進(jìn)行熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)，掃描發(fā)射波長范圍370～550 nm，激發(fā)波長337 nm。使用色譜級(jí)甲醇溶解熒光探針1-NPN，母液使用濃度為1 mmol·L-1。在測定AplaOBP2與探針的結(jié)合能力曲線時(shí)，比色杯中加入溶解在pH7.4的PBS緩沖液中的重組蛋白AplaOBP2溶液，終濃度為2 μmol·L-1，在337 nm的激發(fā)波下，加入探針的濃度從2 μmol·L-1梯度遞增至12 μmol·L-1，記錄與蛋白的結(jié)合值，重復(fù)3 次。篩選配體時(shí)，加入配體的濃度從2 μmol·L-1梯度遞增至20 μmol·L-1，通過Scatchard 方程計(jì)算競爭解離常數(shù)KD：KD=[IC50]/(1 +[1-NPN]/K1-NPN) 。式中，IC50是配體置換50%探針1-NPN時(shí)的濃度，[1-NPN]是未結(jié)合的1-NPN的濃度，K1-NPN為AplaOBP2與1-NPN的解離常數(shù)(Guetal., 2011)。

1.2.5 EAG反應(yīng) 將待測試化合物溶于石蠟油配成10 mg·mL-1的溶液，取20 μL滴加于濾紙條上(5 cm×1 cm)，置于1 mL移液槍頭內(nèi)作為給藥筒。用刀片將白蠟窄吉丁雌雄成蟲觸角從基部切下，去除尖端后插入?yún)⒖茧姌O(毛細(xì)管中浸3 mol·L-1的KCl溶液)，連接至EAG微操作臺(tái)，觸角另一端插入記錄電極。EAG儀器通過IDAC-2信號(hào)采集器與計(jì)算機(jī)相連。觸角距離氣味混合管1 cm。以30 s的間隔產(chǎn)生0.5 s的刺激，恒定流量為10 mL·s-1。觸角產(chǎn)生的信號(hào)用EAG Pro軟件(Syntech)記錄。以乙酸順-3-己烯酯作為標(biāo)準(zhǔn)參照刺激對(duì)各測試樣品的刺激反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。每次進(jìn)行樣品刺激前先進(jìn)行1次對(duì)照(石蠟油)和標(biāo)準(zhǔn)參照刺激，然后隨機(jī)測試待測樣品，再進(jìn)行對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)參照刺激，每根觸角測試1個(gè)循環(huán)。對(duì)每個(gè)待測樣品，分別記錄雌蟲和雄蟲不同個(gè)體的8根觸角電位反應(yīng)。將2次鄰近的標(biāo)準(zhǔn)參照刺激的EAG平均值減去2次鄰近的對(duì)照刺激的EAG平均值作為標(biāo)準(zhǔn)參照值，其他樣品的EAG值減去對(duì)照的EAG平均值后再除以標(biāo)準(zhǔn)參照值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。

1.2.6 嗅覺行為反應(yīng) “Y”型嗅覺儀內(nèi)徑2.5 cm，主臂長25 cm，兩側(cè)臂長均為20 cm，兩者夾角為60°。載氣由大氣采樣儀泵入，流量設(shè)為1.0 L·min-1，空氣經(jīng)過活性炭過濾和空氣加濕后進(jìn)入“Y”型管，各部件之間用硅膠管連接?！癥”型管兩臂端部分別與含有20 μL測試樣品(濃度10 mg·mL-1，用石蠟油稀釋)和對(duì)照石蠟油濾紙條的樣品瓶連接。白蠟窄吉丁雌、雄成蟲饑餓24 h 后用于測量，試驗(yàn)測定在成蟲活躍的10:30—15:30進(jìn)行。將試蟲放在主臂入口，使其頭部朝向兩側(cè)臂，觀察成蟲的選擇反應(yīng)。若試蟲在5 min內(nèi)沿主臂進(jìn)入任一側(cè)臂內(nèi)超過2 cm，并停留30 s以上，則視為有選擇； 若停留在主臂則視為無反應(yīng)。每測試5頭成蟲即交換左右臂位置，并更換濾紙條，測試10頭后更換干凈的“Y”型管。每種測試樣品至少記錄30頭有反應(yīng)成蟲。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件(SPSS 7.0, SPSS Inc., USA)，采用Tukey’s HSD多重比較方法對(duì)白蠟窄吉丁雌、雄成蟲對(duì)不同揮發(fā)物的EAG反應(yīng)進(jìn)行差異顯著性分析； 雌、雄成蟲間對(duì)同一化合物的EAG反應(yīng)采用t-檢驗(yàn)檢測差異顯著性； 嗅覺行為反應(yīng)的數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣味結(jié)合蛋白AplaOBP2的重組表達(dá)

AplaOBP2重組蛋白在上清中不表達(dá)，而在包涵體中大量表達(dá)(圖 1)，因此選擇包涵體進(jìn)行蛋白純化。重組蛋白經(jīng)過親和層析純化及腸激酶切后得到分子質(zhì)量約為14 kDa的目的蛋白(預(yù)測的分子量13.8 kDa)。超濾后得到濃度為1 mg·mL-1純化蛋白，用于抗體制備及競爭性結(jié)合試驗(yàn)。

圖1 白蠟窄吉丁AplaOBP2重組蛋白SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant AplaOBP2 of A. planipennisM: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; 1: 未誘導(dǎo)的大腸桿菌菌體Non-induced Escherichia coli; 2: 誘導(dǎo)的大腸桿菌菌體Induced E. coli; 3: 上清液Supernatant; 4: 包涵體蛋白Inclusion body protein; 5: 帶His 標(biāo)簽AplaOBP2 蛋白R(shí)ecombinant AplaOBP2 with His-tag; 6: 無His 標(biāo)簽AplaOBP2蛋白R(shí)ecombinant AplaOBP2 without His-tag.

2.2 Western blot檢測

AplaOBP2重組蛋白和觸角粗蛋白分別能夠與AplaOBP2抗體特異性結(jié)合(圖2)，均出現(xiàn)一條特異性條帶，表明AplaOBP2抗體的特異性能夠滿足后續(xù)的免疫組織化學(xué)檢測。

圖2 AplaOBP2蛋白Western blot檢測Fig.2 Western blot analysis of AplaOBP21: AplaOBP2重組蛋白R(shí)ecombinant AplaOBP2; 2: 提取自白蠟窄吉丁的觸角粗蛋白Crude protein extracted from antennae of A. planipennis.

2.3 氣味結(jié)合蛋白AplaOBP2在觸角中的表達(dá)定位

免疫組化試驗(yàn)結(jié)果表明，黑色顆粒標(biāo)記的AplaOBP2蛋白分布在錐形感器類型Ⅰ的感器腔中，在錐形感器類型Ⅱ、 類型Ⅲ和單孔化學(xué)感器的感器腔中均未檢測到特異的黑色標(biāo)記顆粒(圖3) 。

圖3 AplaOBP2蛋白在白蠟窄吉丁觸角的免疫定位Fig.3 Immunocytochemical localization of AplaOBP2 protein in the antenna of A. planipennisA: 黑色顆粒標(biāo)記的AplaOBP2蛋白分布在錐形感器類型I的感器腔中 Black spots labeled AplaOBP2 proteins were distributed in the hair lumen of the sensilla basiconica type I； 橫切(B)和縱切(C)顯示AplaOBP2蛋白在錐形感器I基部表達(dá) A cross section(B) and longitudinal section(C) showed the expression of AplaOBP2 proteins at the base of s.basiconica type I； 錐形感器Ⅱ(D)、錐形感器Ⅲ(E)和單孔化學(xué)感器(F) 的感器腔未被標(biāo)記 The hair lumen of s.basiconica type Ⅱ(D), s.basiconica type Ⅲ (E) and uniporous chemoreceptors (F) was never labeled； 箭頭表示嗅覺感器上的壁孔Arrows indicate wall pores on the sensillum.

AplaOBP2蛋白在錐形感器的表達(dá)，推測其可能在嗅覺識(shí)別中發(fā)揮功能。

2.4 AplaOBP2重組蛋白配體結(jié)合特征

以1-NPN為熒光探針，利用競爭性結(jié)合試驗(yàn)測定了58種揮發(fā)性化合物與AplaOBP2重組蛋白的親和力，其中27種揮發(fā)物屬于白蠟樹揮發(fā)物。首先，測定了AplaOBP2對(duì)1-NPN的親和力常數(shù)。AplaOBP2與1-NPN可逆結(jié)合，解離常數(shù)KD為1.26 μmol·L-1，表明1-NPN是一種合適的熒光探針(圖4)。熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果表明，6種化合物與AplaOBP2重組蛋白有較強(qiáng)的結(jié)合能力，包括： 反-2-己烯醛、反-2-庚烯醛、苯甲醛、3′,4′-二甲氧基苯乙酮、4′-乙基苯乙酮和β-紫羅蘭酮(圖 5)。AplaOBP2重組蛋白與β-紫羅蘭酮結(jié)合能力最強(qiáng)，解離常數(shù)KD為0.63 μmol·L-1(表1)。

2.5 白蠟窄吉丁成蟲對(duì)AplaOBP2配體的EAG反應(yīng)

為明確AplaOBP2結(jié)合配體對(duì)白蠟窄吉丁成蟲是否具有活性，首先測定了白蠟窄吉丁雌雄成蟲對(duì)6 種配體在10 mg·mL-1濃度的觸角電位反應(yīng)(表2)。結(jié)果表明，所有配體均能引起雌蟲和雄蟲EAG反應(yīng)，并且雌雄蟲之間的差異不顯著。由表2可以看出，不同揮發(fā)物引起的白蠟窄吉丁觸角反應(yīng)不同，其中反-2-己烯醛和反-2-庚烯醛在雌雄觸角中能夠引起較大的EAG反應(yīng)，而β-紫羅蘭酮引起的雌雄觸角反應(yīng)最弱。

2.6 白蠟窄吉丁成蟲對(duì)AplaOBP2配體的“Y”型嗅覺行為反應(yīng)

進(jìn)一步采用“Y”型嗅覺儀檢測了雌蟲和雄蟲對(duì)AplaOBP2配體的行為反應(yīng)。在10 mg·mL-1測試濃度下，反-2-己烯醛對(duì)白蠟窄吉丁雌蟲具有顯著的引誘作用(P<0.05)，對(duì)雄蟲的引誘量略多于對(duì)照，但未達(dá)到顯著水平； β-紫羅蘭酮對(duì)白蠟窄吉丁雌蟲具有顯著的驅(qū)避作用(P<0.05)，對(duì)雄蟲驅(qū)避作用未達(dá)到顯著水平； 剩余的4種測試樣品對(duì)白蠟窄吉丁雌蟲和雄蟲沒有表現(xiàn)出顯著的引誘或者驅(qū)避作用(圖6)。

圖4 1-NPN和重組蛋白AplaOBP2的結(jié)合曲線Fig.4 Binding curve of 1-NPN to recombinant AplaOBP2

圖5 AplaOBP2與6種配體的競爭結(jié)合曲線Fig.5 Competitive binding curves of 6 kinds of ligands to AplaOBP2

3 討論

白蠟窄吉丁觸角共分布有4種化學(xué)感受器，其中錐形感器類型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ具有壁孔，是典型的嗅覺感受器，而沒有壁孔的單孔化學(xué)受器則屬于味覺感受器，每種化學(xué)感器可能參與不同類型化學(xué)信號(hào)的識(shí)別(Crooketal., 2008b)。本研究免疫組化結(jié)果表明，氣味結(jié)合蛋白AplaOBP2在白蠟窄吉丁錐形感器Ⅰ中特異表達(dá)，表明它可能選擇性結(jié)合運(yùn)輸特定類型的氣味分子，以滿足該類型嗅覺感器的生理功能。熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)顯示AplaOBP2重組蛋白選擇性結(jié)合醛類和酮類化合物，并表現(xiàn)出強(qiáng)的結(jié)合能力，表明AplaOBP2可能參與白蠟窄吉丁的嗅覺識(shí)別行為，這與其在嗅覺感器的表達(dá)具有一致性。AplaOBP2與AplaOBP1表現(xiàn)出不同的表達(dá)及配體結(jié)合特征。盡管AplaOBP1同樣在錐形感器中表達(dá)，但其在類型Ⅰ和類型Ⅲ中均有表達(dá)，并且其識(shí)別物質(zhì)主要為萜類物質(zhì)(Wangetal., 2020)。與AplaOBP2結(jié)合的配體化合物中，反-2-己烯醛和4′-乙基苯乙酮屬于寄主植物揮發(fā)物組分(Rigsbyetal., 2017)，因此進(jìn)一步推測AplaOBP2可能在白蠟窄吉丁寄主識(shí)別中發(fā)揮功能。

前人的研究發(fā)現(xiàn)，白蠟窄吉丁成蟲對(duì)包括反-2-己烯醛在內(nèi)的多種寄主綠葉揮發(fā)物、單萜和倍半單萜表現(xiàn)出觸角反應(yīng)(Crooketal., 2008a; de Grootetal., 2008; Rodriguez-Saonaetal., 2006)。在本研究中，除反-2-己烯醛以外的其他5種配體也能引起雄蟲和雌蟲的觸角反應(yīng)，推測它們同樣是白蠟窄吉丁潛在的信息化合物。不同配體化合物的EAG值在雌雄間差異均不顯著，此次試驗(yàn)僅測定了雌雄各8根觸角的EAG反應(yīng)，因此并不排除由于樣本數(shù)量少、標(biāo)準(zhǔn)偏差大引起的EAG值差異不顯著，其樣本量還需進(jìn)一步增加。反-2-己烯醛是一種常見的綠葉揮發(fā)物，盡管前人已經(jīng)報(bào)道了該化合物對(duì)白蠟窄吉丁成蟲的觸角電位活性(Rodriguez-Saonaetal., 2006)，但對(duì)其行為活性未見報(bào)道。本研究通過“Y”型嗅覺儀研究發(fā)現(xiàn)，反-2-己烯醛對(duì)白蠟窄吉丁雌蟲具有明顯的吸引活性，因此該化合物可以作為潛在的誘餌組分用于成蟲的監(jiān)測或誘殺。β-紫羅蘭酮對(duì)白蠟窄吉丁雌蟲具有顯著地驅(qū)避效果，前期研究發(fā)現(xiàn)β-紫羅蘭酮對(duì)跳甲(Phyllotretacruciferae)和稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)等均有顯著驅(qū)避作用(Cceresetal., 2016; Sunetal., 2016)，與本研究結(jié)果相類似。

表1 重組AplaOBP2 蛋白與候選配體結(jié)合能力①Tab.1 Binding capabilities of the recombinant AplaOBP2 to candidate ligands

續(xù)表1 Continued

圖6 白蠟窄吉丁雌雄蟲對(duì)AplaOBP2配體(10 mg·mL-1)的行為反應(yīng)Fig.6 Behavioral responses of male and female A. planipennis to the ligands(10 mg·mL-1) of the AplaOBP2數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用卡方檢驗(yàn)，星號(hào)表示在0.05水平下處理和對(duì)照(石蠟油)間存在顯著差異，ns表示不存在顯著性差異( P>0.05)。 The Chi-square test was used for data analysis.The asterisk indicate significant difference between the treatment and the control(paraffin oil) at the 0.05 level, while ns indicates no significant difference(P>0.05).

表2 白蠟窄吉丁雌雄成蟲對(duì)AplaOBP2配體(10 mg·mL-1) 的EAG反應(yīng)①Tab.2 EAG responses of male and female A. planipennis to the ligands(10 mg·mL-1) of the AplaOBP2

目前，寄主綠葉揮發(fā)物順-3-己烯醇作為白蠟窄吉丁誘餌的主要組分，已廣泛用于白蠟窄吉丁成蟲的監(jiān)測，田間誘集效果表明，順-3-己烯醇對(duì)雄蟲的誘集效果優(yōu)于雌蟲(Grantetal., 2010； 2011)。本研究發(fā)現(xiàn)反-2-己烯醛對(duì)白蠟窄吉丁雌蟲表現(xiàn)出顯著的引誘活性，因此可以考慮將其與順-3-己烯醇聯(lián)合使用，增強(qiáng)現(xiàn)有誘餌對(duì)白蠟窄吉丁雌蟲的誘集效果，但是其誘集活性還需進(jìn)一步通過田間試驗(yàn)驗(yàn)證。另外，本研究僅測定了單一劑量的單一組分化合物對(duì)白蠟窄吉丁成蟲的行為反應(yīng)，化合物不同濃度和混配可能對(duì)白蠟窄吉丁成蟲具有不同的行為活性，還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

免疫組織化學(xué)研究顯示AplaOBP2蛋白在白蠟窄吉丁嗅覺感受器——錐形感器Ⅰ中表達(dá)，熒光競爭結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)AplaOBP2重組蛋白能與反-2-己烯醛、反-2-庚烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮、3′,4′-二甲氧基苯乙酮和β-紫羅蘭酮6種化合物結(jié)合，并且6種配體均能引起成蟲觸角的電生理反應(yīng)，推測AplaOBP2在白蠟窄吉丁嗅覺識(shí)別中發(fā)揮功能。室內(nèi)行為學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反-2-己烯醛能顯著吸引白蠟窄吉丁雌成蟲，而β-紫羅蘭酮?jiǎng)t對(duì)雌蟲具有明顯的趨避作用，2種化合物可作為潛在的信息素組分用于白蠟窄吉丁行為調(diào)控。本研究為闡明白蠟窄吉丁的嗅覺識(shí)別機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為以O(shè)BP蛋白作為靶標(biāo)篩選白蠟窄吉丁嗅覺行為調(diào)控劑用于該蟲防治提供了依據(jù)。