利用 Fhb1基因分子標記輔助回交育種法改良黃淮冬小麥赤霉病抗性

代旭冉，黃義文，李 騰，鄧 云，蘇 研，買春艷，于立強，于廣軍，李輝利，劉宏偉，楊 麗，周 陽，張宏軍，李洪杰

(1.河北科技師范學院，農學與生物技術學院，河北秦皇島 066004；2.中國農業(yè)科學院作物科學研究所/作物分子育種工程實驗室，北京 100081；3.福建省南平市農業(yè)科學研究所，福建建陽 354200；4.新鄉(xiāng)矮敗小麥育種技術創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng)453731；5.石家莊市農林科學研究院趙縣試驗基地，河北趙縣 051530)

赤霉病(Fusarium head blight,FHB)主要是由禾谷鐮孢菌[GibberellazeaeSchw.(Petch)]引起的一種嚴重影響禾谷類作物產量和品質的毀滅性病害[1]。據統計，1993-2001年，赤霉病給美國小麥(TriticumaestivumL.)和大麥(HordeumvulgareL.)生產造成的直接經濟損失高達76.7億美元[2]。此外，赤霉病病菌產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)等毒素，食用被DON污染的籽粒后會嚴重危害人類和牲畜的健康[3-4]。赤霉病一直以來是限制我國南方麥區(qū)小麥生產的主要病害，尤其在長江中下游地區(qū)[5]。近年來由于耕作制度和氣候的變化，赤霉病已經向北方麥區(qū)擴展，目前已成為黃淮冬麥區(qū)的主要病害之一，如2012年僅河南省發(fā)病面積就超過339.69萬hm2[6]。因此，快速提高小麥品種的赤霉病抗性已經成為黃淮冬麥區(qū)最重要的育種目標之一。

赤霉病抗性是受多基因控制的復雜數量性狀。在小麥中已經定位到250多個與赤霉病抗性相關的QTL[7-8]。其中，Fhb1被認為是抗擴展效應最大、抗性最穩(wěn)定的位點，在不同定位群體中可解釋20%～50%的表型變異[7,9-10]。目前，Fhb1的候選基因TaHRC已經被克隆并已開發(fā)了功能標記，這為利用該基因的分子標記進行輔助選擇提供了便利[11]。世界上很多國家利用Fhb1分子標記輔助選擇技術開展小麥抗赤霉病育種，并取得了顯著進展[12-15]。據報道，將Fhb1基因導入美國硬紅春小麥，已經培育出一系列抗赤霉病品種并商業(yè)化推廣[16-17]。Xie等[12]將來自蘇麥3號的Fhb1導入到5個澳大利亞小麥品種，發(fā)現攜帶Fhb1的后代發(fā)病嚴重度降低了42%～53%。Randhawa等[13]通過把Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5基因導入加拿大感病品種，成功培育出抗病品種Waskada、Carberry和Cardale，并已投入商業(yè)化生產。

Fhb1基因主要分布在東亞地區(qū)，特別是中國南方和日本[11]，推測我國長江中下游麥區(qū)小麥品種Fhb1感病等位基因發(fā)生突變是其抗病等位基因的起源[18]。抗赤霉病育種一直是長江中下游麥區(qū)的主要育種目標，這一麥區(qū)生產上大面積種植的品種對赤霉病均具有較好的抗性[19-20]。歷史上赤霉病在我國黃淮冬麥區(qū)發(fā)病很輕，很少引起育種家重視，導致目前該麥區(qū)生產上種植的絕大部分品種都高感赤霉病。由于生態(tài)類型的差異，南方麥區(qū)抗赤霉病的春性品種很難直接應用于黃淮冬麥區(qū)，也很難通過單交的方式直接選育出適合該麥區(qū)種植的品種。黃淮冬麥區(qū)開展抗赤霉病育種的另一個困難是年際間赤霉病發(fā)病嚴重程度變化很大，在不發(fā)病或發(fā)病很輕的年份，很難進行田間抗病性選擇。

目前黃淮冬麥區(qū)抗赤霉病育種在材料和技術方面缺乏必要的積累，因此，提高品種抗性由高感到中感水平是黃淮冬麥區(qū)抗赤霉病育種的重要一步。本課題組前期通過嘗試有限回交的方法，利用Fhb1功能標記將來自長江中下游麥區(qū)抗赤霉病品種的Fhb1基因導入黃淮冬麥區(qū)小麥品種周麥16中，發(fā)現回交一代的赤霉病抗性比周麥16顯著提高[21]。隨后，利用周麥16衍生系輪選136和輪選13進行第二輪回交，發(fā)現輪選136遺傳背景下BC2F2群體赤霉病抗性水平明顯優(yōu)于輪選13背景[22]。在此基礎上，本研究對輪選136背景下6個BC2F3群體161個純合Fhb1-R株系進行三個環(huán)境下的赤霉病抗性表型評價，進而對入選的BC2F4品系進一步評價，明確Fhb1在輪選136背景下對赤霉病抗性的影響，以期為黃淮冬麥區(qū)赤霉病抗性分子育種提供技術支撐和育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用周麥16矮敗小麥近等基因系(簡稱矮敗周麥16)分別與6個赤霉病抗性達到中抗以上水平且攜帶Fhb1基因的供體(蘇麥3號、寧麥9號、寧麥13、建陽84-1、建陽84-2和建陽798-2)雜交，獲得F1，F1與周麥16回交，然后將攜帶Fhb1基因的BC1F1植株與周麥16衍生系輪選136進行第二次回交，獲得6個BC2F1群體，然后自交產生6個BC2F2回交群體，即群體1(矮敗周麥16/蘇麥3號//周麥16/3/輪選136)、群體2(矮敗周麥16/寧麥9號//周麥16/3/輪選136)、群體3(矮敗周麥16/寧麥13//周麥16/3/輪選136)、群體4(矮敗周麥16/建陽84-1//周麥16/3/輪選136)、群體5(矮敗周麥16/建陽84-2/周麥16/3/輪選136)和群體6(矮敗周麥16/建陽798-2//周麥16/3/輪選136)。在BC2F3群體中，通過對Fhb1不同等位基因檢測，將攜帶純合Fhb1抗性等位基因(Fhb1-R)的BC2F3株系在三個環(huán)境(2019年福建南平、河南新鄉(xiāng)和北京)下進行赤霉病抗性評價。2020年將入選的BC2F4品系繼續(xù)在河南新鄉(xiāng)進行赤霉病抗性接種鑒定。蘇麥3號、揚麥158、淮麥20和周麥16分別作為赤霉病抗性鑒定的高抗、中抗、中感和高感對照。

1.2 基因型分析

隨機剪取每個BC2F2單株的新鮮葉片，利用快捷型植物基因組DNA提取系統(北京天根生物技術有限公司)提取基因組DNA；采用相同方法，每個BC2F4品系隨機剪取10個新鮮葉片，混合后提取基因組DNA。應用STS功能標記TaHRC-GSM(TaHRC-GSM-F:5′-ATTCCTAC TAGCCGCCTGGT-3′;TaHRC-GSM-R:5′-ACT GGGGCAAGCAAACATTG-3′)檢測BC2F2單株Fhb1的等位基因[23]。PCR擴增體系和擴增結果檢測參考Li等[22]的方法。利用KASP標記GBS20328檢測輪選136和BC2F4品系中是否存在鄭麥9023赤霉病抗性位點Qfhb.7D。KASP標記GBS20328引物序列、PCR反應體系和擴增程序參照Zhang等[24]的方法。

1.3 赤霉病抗性評價

2019年，在福建省南平市農業(yè)科學院試驗基地(27°33′N，118°12′E)進行赤霉病田間自然發(fā)病抗性鑒定。于小麥開花后25 d調查病小穗數和總小穗數，每個材料每個重復調查10個穗子[22]。嚴重度計算采用下面公式：嚴重度(%)=病小穗數/總小穗×100%[25]。2019年和2020年在河南省中國農業(yè)科學院新鄉(xiāng)試驗基地(35°31′N，113°85′E)以及2019年在北京中國農業(yè)科學院作物科學研究所溫室(39°91′N，116°27′E)采用單花滴注法進行人工接種鑒定。孢子液制備參考Bai等[26]的方法，在開花初期，用聯動移液器將10 μL(約 1 000個孢子)禾谷鐮孢菌分生孢子懸浮液注入中間小穗，接種麥穗套袋保濕48 h，然后去掉袋子，用彌霧裝置定時噴水保濕至接種后15 d。接種21 d后，調查病小穗數并計算嚴重度[19]。

試驗采用完全隨機區(qū)組設計，設2次重復。2019年南平和2019年新鄉(xiāng)兩個環(huán)境采用田間種植，1 m行長，行距30 cm，每行播種20粒種子；2019年新鄉(xiāng)環(huán)境采用溫室花盆種植，每盆(直徑25 cm)種15粒種子，出苗后保證每盆10株苗，每個材料種2盆。2020年新鄉(xiāng)環(huán)境BC2F4品系種植方式同2019年新鄉(xiāng)環(huán)境。

1.4 數據分析

使用Microsoft Excel 2019數據分析工具進行描述性統計。利用IBM SPSS Statistics 22軟件通過LSD方法進行多重比較分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 BC2F2群體 Fhb1等位基因檢測結果

利用STS功能標記TaHRC-GSM對BC2F26個群體的Fhb1等位基因進行檢測，部分后代單株的檢測結果如圖1所示。在BC2F2群體1(158株)、群體2(161株)、群體3(152株)、群體4(43株)、群體5(181株)和群體6(177株)中，分別有29株、40株、42株、19株、60株和43株攜帶純合Fhb1抗病等位基因(Fhb1-R)。淘汰農藝性狀表現較差的單株后，BC2F2群體1、群體2、群體3、群體4、群體5、群體6分獲得純合Fhb1-R基因型27株、17株、24株、19株、41株和33株，衍生后代將用于赤霉病抗性評價。

2.2 BC2F3群體赤霉病抗性表現

從表1和表2可以看出，部分對照品種間的病小穗數和嚴重度在每個環(huán)境下均存在顯著差異(表1和2)。在南平和北京環(huán)境下，蘇麥3號和揚麥158的病小穗數和嚴重度均顯著低于淮麥20和周麥16(P<0.05)。與周麥16比較，淮麥20表現出較好的赤霉病抗性，在南平、新鄉(xiāng)和北京三個環(huán)境下病小穗數比周麥16分別少7.5個、5.4個和8.8個；平均嚴重度分別降低8.8%、23.3%和36.1%，差異均顯著(P<0.05)。從對照品種赤霉病抗性表現看，各環(huán)境下發(fā)病充分，適合進行赤霉病抗性表型評價。

6個BC2F3群體在南平、新鄉(xiāng)和北京三個環(huán)境的赤霉病抗性表現見表1和表2。三個環(huán)境下來自6個群體161個純合Fhb1-R株系的總平均病小穗數比周麥16分別減少8.1個、6.1個和9.6個，比淮麥20分別減少0.6個、0.7個和0.8個，比輪選136分別減少0.2個、1.0個和1.4個；總平均嚴重度比周麥16分別降低15.1%、26.1%和42.1%，比淮麥20分別降低6.3%、2.8%和6.0%，比輪選136分別降低2.6%、4.8%和5.8%。輪選136與淮麥20之間的病小穗數和嚴重度差異均不顯著。

表2 2019年三個環(huán)境6個BC2F3群體的赤霉病嚴重度比較Table 2 Comparison of FHB severity of the six BC2F3 populations under three environments in 2019 %

來自不同供體的部分回交群體的病小穗數和嚴重度存在顯著差異(表1和2)。南平環(huán)境下不同群體間的病小穗數無顯著差異，但南平環(huán)境下部分群體間的嚴重度以及新鄉(xiāng)和北京環(huán)境下部分群體間的病小穗數和嚴重度均差異顯著。總的來說，建陽84-2的回交后代(群體5)赤霉病抗性表現較好，抗性較為穩(wěn)定。

2.3 赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20的BC2F3株系

單個環(huán)境下，每個BC2F3群體中病小穗數和嚴重度均低于淮麥20的株系個數不同(表3)。在南平環(huán)境下，6個群體中共有70個株系 (43.5%)的赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20，分布頻率為30.3%～58.8%；新鄉(xiāng)環(huán)境下共有121個株系(75.2%)的赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20，分布頻率為51.9%～89.5%；北京環(huán)境下，同樣有121個株系(75.2%)的赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20，分布頻率為58.3%～90.9%。

表3 2019年單個環(huán)境下赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20的BC2F3株系數和頻率統計Table 3 Number and frequency of BC2F3 lines with FHB resistance superior to Huaimai 20 under single environment in 2019

有60個BC2F3株系(37.3%)在三個環(huán)境下抗性均低于淮麥20，且表現一致，因此，選擇這些抗性表現穩(wěn)定的株系進行進一步研究。在南平、新鄉(xiāng)和北京三個環(huán)境下，相比淮麥20，6個BC2F3群體的總平均病小穗數分別降低 2.2、1.8和2.1個(P<0.05)，平均嚴重度分別降低11.8%、8.1%和12.7%(P<0.05)(表4)。

表4 三個環(huán)境下赤霉病抗性一致優(yōu)于淮麥20的BC2F3株系表現Table 4 Performances of the selected BC2F3 lines with FHB resistance superior to Huaimai 20 under three environments

2.4 苗頭品系篩選

2020年在新鄉(xiāng)繼續(xù)對入選的60個BC2F3株系的122個BC2F4品系進行赤霉病抗性表型評價(表5)，其中93個品系(76.2%)赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20，36個品系(29.5%)赤霉病抗性達到中抗對照揚麥158的水平。

表5 赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20的BC2F4品系赤霉病抗性表現(2020，新鄉(xiāng))Table 5 Performances of selected BC2F4 lines with FHB resistance superior to Huaimai 20(2020,Xinxiang)

93個赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20的BC2F4品系平均病小穗數為5.5個，平均嚴重度為26.2%，比淮麥20分別降低2.8個和15.5%(P<0.05)。圖2為部分抗赤霉病品系單花滴柱接種后的表型。利用鄭麥9023抗性位點Qfhb.7D連鎖KASP標記GBS20328分析發(fā)現，輪回親本輪選136和93個BC2F4品系均攜帶該QTL。這些品系已經安排產量比較試驗，用于培育抗赤霉病新品種。

A：蘇麥3號；B：揚麥158；C：淮麥20；D：周麥16；E：抗赤霉病品系RS1612-6-8-2;F：抗赤霉病品系RS1610-26-3-4。A:Sumai 3;B:Yangmai 158;C:Huaimai 20;D:Zhoumai 16;E:Fusarium head blight-resistant line RS1612-6-8-2;F:Fusarium head blight-resistant line RS1610-26-3-4.圖2 單花滴注接種抗赤霉病株系的表型Fig.2 Performance of lines with the resistance to Fusarium head blight using the floret inoculation method

3 討 論

快速培育適合黃淮冬麥區(qū)生態(tài)類型的抗赤霉病小麥品種是小麥生產亟待解決的問題。黃淮冬麥區(qū)不同年份赤霉病發(fā)病程度差異較大，在自然發(fā)病條件下，尤其是在發(fā)病較輕的年份，很難在田間準確評價赤霉病抗性[15]，這也是制約黃淮冬麥區(qū)抗赤霉病育種的一個關鍵問題。因此，利用分子標記輔助選擇技術開展抗赤霉病育種顯得尤為重要。本研究利用Fhb1功能標記輔助選擇技術，結合骨干親本矮敗小麥近等基因系大群體有限回交，快速把長江中下游麥區(qū)的Fhb1抗性等位基因導入黃淮冬麥區(qū)品種，培育出多個赤霉病抗性較好、農藝性狀優(yōu)良的新品系。這些結果說明，利用有限回交和分子標記輔助選擇技術相結合的策略，不僅能提高抗赤霉病育種效率，還可以縮短育種周期，快速培育出適合黃淮冬麥區(qū)種植的抗赤霉病品種。

過去育種上利用與Fhb1基因連鎖的SSR標記(Gwm533、Gwm493)和STS標記(Umn10)將Fhb1抗性等位基因導入感病材料來提高赤霉病抗性[9,12-14,27]。但這些連鎖標記具有一定的假陽性，為解決這個問題，Su等[23]根據候選基因TaHRC的缺失突變，開發(fā)了可用于育種后代大規(guī)模篩選的Fhb1基因功能標記。本研究利用這個功能標記對回交后代進行目標基因的跟蹤檢測，提高了抗病基因型選擇的準確性。

本研究發(fā)現，Fhb1基因可以有效提高赤霉病抗性，但并不是所有Fhb1-R株系都具有和Fhb1供體一樣的抗性，這與前人的研究結果一致[21-22,28]。很多供體除了攜帶Fhb1基因外，還攜帶其他抗赤霉病位點，比如蘇麥3號除了攜帶Fhb1外，還攜帶Fhb2和Fhb5[29]。本研究只針對Fhb1基因進行目標選擇，其他微效基因在Fhb1-R株系中隨機存在，后代中赤霉病抗性好的Fhb1-R株系可能聚合了這些微效位點，有待進一步研究。本研究對三個環(huán)境中赤霉病抗性均優(yōu)于淮麥20的60個BC2F3株系繼續(xù)進行選擇，發(fā)現122個BC2F4品系中有93個(76.2%)赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20，說明赤霉病抗性在多環(huán)境中鑒定的重要性，也表明所選BC2F3株系的赤霉病抗性可以穩(wěn)定地遺傳到下一代。由此可見，對于抗赤霉病這種復雜數量性狀，在利用Fhb1基因進行分子標記輔助選擇時，結合多環(huán)境下的表型評價，才能提高抗赤霉病育種成功的概率。

受體親本的遺傳背景對提高赤霉病抗性有很大影響[5]。劉宗鎮(zhèn)等[30]發(fā)現，赤霉病抗性的超親現象主要存在于赤霉病抗性為中感以上的親本雜種后代，而在高感親本后代中很難選出抗赤霉病品種。如被廣泛利用的抗赤霉病小麥品種蘇麥3號是由中感赤霉病的臺灣小麥與中感赤霉病的阿夫(Funo)雜交選育而成。本研究發(fā)現，在對赤霉病有一定抗性的輪選136的遺傳背景下，回交群體平均病小穗數和嚴重度均低于淮麥20或與之相當，但Li等[22]研究發(fā)現，在高感赤霉病的輪選13背景下，回交群體的赤霉病抗性水平明顯低于輪選136遺傳背景，表明遺傳背景對基因的抗性有重要影響，這與前人的研究結果[31-33]一致。

輪回親本輪選136是通過周麥16與鄭麥9023雜交再與周麥16回交選育而成，其赤霉病抗性明顯優(yōu)于周麥16[22]。Zhang等[24]報道，鄭麥9023攜帶赤霉病抗性位點Qfhb.7D，該位點在不同環(huán)境下可解釋6.15%～9.32%的表型變異。本研究發(fā)現，輪選136的Qfhb.7D基因型與鄭麥9023相同，在93個赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20的BC2F4品系中均含有Qfhb.7D，推測這些品系的赤霉病抗性可能歸因于輪選136抗性位點Qfhb.7D與Fhb1基因之間的累加效應。后續(xù)有必要利用遺傳群體進一步研究Fhb1基因和抗性QTLQfhb.7D的聚合效應。

綜上所述，通過把來源于長江流域小麥品種的Fhb1基因導入黃淮冬麥區(qū)品種，可有效提高黃淮冬麥區(qū)品種對赤霉病的抗性。有限回交結合Fhb1分子標記輔助選擇技術，配合田間自然發(fā)病和人工接種鑒定，是快速提高黃淮冬麥區(qū)品種赤霉病抗性的有效途徑。在抗赤霉病育種中，應注意遺傳背景的選擇和多個抗病基因的累加效應。