Skp2在年齡相關(guān)性聽力損失小鼠耳蝸中的表達△

羅中業(yè) 梁瑞 劉戴瑤 周凡 劉雙月 劉永新

年齡相關(guān)性聽力損失(age-related hearing loss，ARHL)是隨年齡增長雙耳高頻聽力下降的感音神經(jīng)性聽力損失。S期激酶相關(guān)蛋白-2(S-phase kinase-associated protein-2，Skp2)是細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控細胞衰老。與年輕內(nèi)皮祖細胞相比，Skp2水平在復(fù)制性衰老的內(nèi)皮祖細胞中顯著降低[1]。Dong等[2]研究發(fā)現(xiàn)，Skp2在初生小鼠耳蝸中的聽覺上皮和螺旋神經(jīng)元細胞中表達，且其在聽覺系統(tǒng)的發(fā)育中扮演重要角色; Minoda等[3]在成年豚鼠的聽覺上皮細胞中誘導(dǎo)Skp2的高表達，發(fā)現(xiàn)其表達水平與聽覺功能密切相關(guān)。然而，耳蝸中Skp2的水平是否隨著年齡增長發(fā)生顯著變化，此變化是否與ARHL有關(guān)，目前尚無報道。本研究旨在通過觀察不同月齡小鼠耳蝸中Skp2的表達水平，探討Skp2在小鼠ARHL發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 63只健康1月齡 C57 BL/6J雄鼠，體重 15～16 g，由北京維通利華實驗動物公司提供，動物許可證編號：SCXK(京)2016-0006；將小鼠隨機分為2月齡組、8月齡組和12月齡組，每組21只,正常飼養(yǎng)至相應(yīng)月齡。

1.2實驗材料 兔Skp2單克隆抗體購自中國北京博奧森生物技術(shù)有限公司，Alexa Fluor?488標記山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購買自美國Earthox公司；GAPDH購買自美國Affinity 公司；FITC-鬼筆環(huán)肽購自中國上海翊圣生物科技有限公司，抗熒光淬滅劑、MDA試劑盒及SOD試劑盒購自中國北京索萊寶科技有限公司；Smart EP&OAE聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)由美國IHS公司生產(chǎn)。

1.3聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測 各組小鼠噻拉嗪(100 mg/kg)和氯胺酮(10 mg/kg)混合麻醉后，分別將電極正極置于顱頂正中皮下，負極連接被測耳，接地電極連接對側(cè)耳。SmartEP&OAE聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)給予短純音(tone burst)刺激，選取8、12、16、24和32 kHz 5個頻率分別進行測試并記錄ABR閾值；重復(fù)率為39.1次/秒，帶通濾波100～3 000 Hz，疊加1 024次,掃描時程16.0 ms；聲刺激強度從100 dB SPL開始，以5 dB逐次遞減，以最后一次出現(xiàn)ABR波Ⅰ并與上一波形有延續(xù)性的聲強定為ABR閾值。

1.4小鼠耳蝸氧化應(yīng)激水平測試 小鼠行ABR檢測后各組取10只處死，并于體式顯微鏡下分離耳蝸；4個耳蝸合成一份樣本，加入200 μL裂解液(強)及2 μL蛋白酶抑制劑，耳蝸組織勻漿破碎；低溫高速離心機 4 ℃下，12 000 rpm/min離心 10 min，取上清液，根據(jù)試劑盒說明書，通過紫外分光光度儀分別檢測小鼠耳蝸丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平和總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)活力。

1.5耳蝸標本處理 各組5只小鼠耳蝸以4% 多聚甲醛溶液(PH 7.4)4 ℃下固定24 h，隨后標本經(jīng)PBS潤洗后置于4% EDTA溶液中脫鈣備用。

1.5.1小鼠耳蝸基底膜毛細胞計數(shù) 每組5個左側(cè)耳蝸脫鈣后，體式顯微鏡下完整分離基底膜，并平鋪于載玻片。室溫下，組織在鬼筆環(huán)肽(1∶200)溶液中避光染色1 h，封片后熒光顯微鏡下觀察。選取每0.18 mm標尺為一個視野，從基底膜頂部向底部連續(xù)觀察內(nèi)毛細胞(inner hair cell，IHC)、外毛細胞(outer hair cell，OHC)，利用耳蝸毛細胞定量軟件進行毛細胞計數(shù)。

1.5.2免疫熒光染色 每組5個右側(cè)耳蝸，進行石蠟常規(guī)包埋。將蠟塊沿蝸軸正中行5 μm連續(xù)切片，切片脫蠟至水后，用檸檬酸鈉修復(fù)液(PH 6.0)微波爐修復(fù)，山羊血清封閉1 h后，滴加抗Skp2單克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜；滴加熒光二抗(1∶200)避光孵育1 h后，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡下拍照。每組隨機選取10個視野，應(yīng)用Image.J軟件在相同條件下測量小鼠耳蝸中的柯蒂器、螺旋神經(jīng)節(jié)和血管紋三個部位的Skp2陽性產(chǎn)物的光密度值，值越大，陽性反應(yīng)越強烈。

1.6蛋白印跡檢測 小鼠(6只)處死后，迅速取耳蝸組織，4只耳蝸為一份樣本，加入裂解液RIPA，在低溫制備耳蝸蛋白樣本。SDS-聚丙烯凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，Skp2抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。加辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1.5 h，以ECL法發(fā)光顯影，全自動凝膠成像系統(tǒng)進行半定量分析，內(nèi)參照物為 GAPDH，Skp2/GAPDH 比值代表 Skp2的蛋白表達水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用Prism 8.0統(tǒng)計軟件，以單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠ABR閾值比較 各組ABR檢測結(jié)果如表1所示，與2月齡組比較，8月齡組、12月齡組小鼠各頻率 ABR閾值均升高(P<0.01)。與8月齡組相比，12月齡組小鼠各頻率ABR閾值顯著升高(P<0.01)。

表1 各組小鼠8～32 kHz各頻率ABR閾值

2.2各組小鼠耳蝸內(nèi)MDA水平和T-SOD活力比較 2月齡小鼠耳蝸中MDA水平最低，12月齡組MDA水平最高；2月齡小鼠耳蝸中T-SOD活力最高，12月齡組耳蝸中T-SOD活力最低。與2月齡組比較，8、12月齡組耳蝸中MDA水平增高(P<0.01)，T-SOD活力降低(P<0.01)；與8月齡組相比較，12月齡組耳蝸中MDA水平升高(P<0.01)，T-SOD活力降低(P<0.01)(表2)。

表2 各組小鼠耳蝸中MDA水平和T-SOD活力(n=5只)

2.3各組小鼠耳蝸毛細胞缺失率比較 如圖1所示，2月齡組小鼠耳蝸毛細胞在全回缺失最少，而12月齡組小鼠耳蝸毛細胞在全回的缺失則明顯增多；與2月齡組比較，8月齡組小鼠耳蝸頂回毛細胞與2月齡組相差不明顯，越接近底回毛細胞缺失越多(P<0.01)，底回外毛細胞缺失最多(P<0.01)，約80%，而內(nèi)毛細胞損失約20%；而12月齡組小鼠全回內(nèi)、外毛細胞缺失均明顯升高(P<0.01)，與8月齡組相比較，12月齡組小鼠耳蝸毛細胞缺失率均明顯增加(P<0.01)，僅底回外毛細胞缺失相差不明顯。

2.4各組小鼠耳蝸Skp2蛋白的表達 Skp2蛋白在小鼠耳蝸中的毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)及血管紋均有表達，2月齡組Skp2蛋白表達水平最高，尤其在螺旋神經(jīng)節(jié)中；8月齡和12月齡組小鼠上述部位Skp2表達水平均降低(P<0.01)(圖2)。

圖1 各組小鼠耳蝸外毛細胞缺失率(a)和內(nèi)毛細胞缺失率(b)(n=5耳) 注:*與2月齡組比較P<0.01,#與8月齡組比較,P<0.01

圖2 各組小鼠耳蝸Skp2的表達(免疫熒光染色,標尺=50μm) 注:箭頭所示為Skp2陽性表達

2.5各組小鼠耳蝸Skp2蛋白印跡檢測 12月齡小鼠耳蝸Skp2電泳條帶顯色最淺，半定量分析結(jié)果顯示，隨著年齡增加，小鼠Skp2 蛋白含量逐漸減少(P<0.01)，12月齡組較2月齡組減少將近50%(圖3、表3)。

表3 各組小鼠Skp2表達的平均光密度值(n=5)及Skp2/GAPDH值

3 討論

目前認為ARHL的主要病理改變?yōu)槊毎?、血管紋、傳入螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元等細胞凋亡，從而使小鼠耳蝸功能異常導(dǎo)致其聽力損失，耳蝸內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致ARHL的可能機制之一[4]。ARHL發(fā)病率高，人口數(shù)量龐大，不僅給社會和經(jīng)濟造成極大的影響，而且會使患者產(chǎn)生被孤立感，極大地影響患者的生活質(zhì)量[5]。因此，尋找明確的發(fā)病機制成為防治ARHL的當務(wù)之急[6]。

圖3 各組小鼠耳蝸Skp2蛋白電泳條帶

聽功能的減退、耳蝸毛細胞損傷與耳蝸的氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，既往研究已經(jīng)表明氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致細胞衰老的主要因素[7,8]，隨著年齡的增長，耳蝸中氧化應(yīng)激損傷增強導(dǎo)致MDA蓄積，而SOD活力降低，抗氧化能力下降，最終導(dǎo)致毛細胞凋亡。本研究顯示，C57BL/6J小鼠隨著年齡的增長，聽力逐漸下降，是理想的ARHL模型；隨著月齡增長小鼠耳蝸MDA水平明顯升高，T-SOD活力明顯降低，而MDA反映耳蝸內(nèi)氧化應(yīng)激水平，SOD的活力反映耳蝸內(nèi)抗氧化能力，證實了在ARHL小鼠耳蝸存在氧化應(yīng)激損傷，與以往報道[9,10]一致。

細胞凋亡的過程涉及很多細胞因子。Skp2屬于F-box蛋白家族，相對分子量48 KD，是細胞周期的一個重要調(diào)控蛋白，可以通過降解細胞周期蛋白調(diào)節(jié)細胞周期[11]。Skp2具有誘導(dǎo)細胞增殖，抑制細胞凋亡的作用，在細胞衰老過程中，發(fā)揮重要作用[12～14]。研究發(fā)現(xiàn)，Skp2在小鼠胚胎內(nèi)耳的早期發(fā)育階段的聽覺上皮和神經(jīng)元中表達，其在小鼠聽覺系統(tǒng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[2]；此外，在豚鼠耳蝸中過表達Skp2，可以促進非感覺細胞分化、增殖，進而產(chǎn)生新的異位感覺毛細胞，改善豚鼠的聽功能[3]；以上研究均提示，Skp2在維持正常聽覺功能中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究通過免疫熒光及Western blot檢測，觀察到ARHL小鼠耳蝸Skp2表達隨著小鼠月齡的增長而減少，小鼠月齡越大，其表達水平越低；Skp2水平降低主要出現(xiàn)在耳蝸毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)以及血管紋等維持小鼠聽功能的關(guān)鍵部位。推測，耳蝸氧化應(yīng)激水平的加劇可能影響了Skp2表達水平下降，導(dǎo)致耳蝸內(nèi)外毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞功能障礙。

綜上，ARHL小鼠耳蝸Skp2水平降低可能與其耳蝸細胞的衰老和聽功能減退有關(guān)，這可能為臨床治療和預(yù)防ARHL提供新的研究方向。本研究僅觀察到了ARHL小鼠耳蝸Skp2減少及隨月齡增長T-SOD活力降低、MDA水平升高，尚沒有更多證據(jù)表明是ARHL小鼠耳蝸中的氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)Skp2表達水平降低；下一步可通過調(diào)節(jié)耳蝸中Skp2的表達水平來明確其對老齡小鼠聽力損失進展的影響，進一步明確Skp2減少與老化耳蝸氧化應(yīng)激水平增加的關(guān)系。