無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展

覃茜

（百色市婦幼保健院，廣西 百色，533000）

出生缺陷的發(fā)生已受到我國重點(diǎn)關(guān)注，主要是指胚胎或胎兒在發(fā)育期間，所出生結(jié)構(gòu)或功能代謝異常，主要包括染色體異常、先天畸形、遺傳代謝性疾病以及功能異常。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國出生缺陷發(fā)生率可達(dá)到4%—6%，已被歸納為高發(fā)國家[1]。目前，臨床針對該類疾病我國醫(yī)學(xué)界尚無最佳治療措施，一般通過染色體疾病的產(chǎn)前篩查及診斷，盡早判斷出生缺陷疾病，同時利用早期干預(yù)或終止妊娠，來規(guī)避出生缺陷發(fā)生率[2]。既往，臨床以血清學(xué)篩查、超聲產(chǎn)前診斷以及侵入性產(chǎn)前診斷為胎兒染色體疾病常用手段，其中超聲診斷項(xiàng)目包括多類，如三級彩超篩查、胎兒頸項(xiàng)透明層（NT）檢查[3]。而血清學(xué)主要于孕早期或孕中期，利用檢測孕婦血清學(xué)生化標(biāo)志物+NT，并依據(jù)孕周、體重、糖尿病史、吸煙史等因素，綜合性判斷胎兒染色體疾病[4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，血清篩查檢出率為60%—70%，但其漏檢率普遍較高，進(jìn)而增加唐氏綜合征患兒出生風(fēng)險[5]。侵入性產(chǎn)前診斷可歸納為絨毛活檢、羊膜腔穿刺以及臍靜脈穿刺，均屬于創(chuàng)傷性診斷，且伴有實(shí)驗(yàn)周期長等特點(diǎn)，且具有0.5%—1%的流產(chǎn)風(fēng)險[6]。因此提供一類檢出率高、無創(chuàng)的診斷措施，已成為臨床醫(yī)師探究的熱點(diǎn)。而染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（NIPT）屬于一類新型技術(shù)，也是基于孕婦外周血中胎兒游離DNA 新型產(chǎn)前篩查技術(shù)，通過采集孕婦靜脈血，分離血漿，并提取血漿內(nèi)游離DNA，通過高通量基因測序措施，實(shí)施深度測序，同時依據(jù)生物信息學(xué)探究技術(shù)，判斷胎兒患染色體異常疾病風(fēng)險。本文對NIPT 原理、優(yōu)勢依據(jù)局限性進(jìn)行綜述如下：

1 NIPT 原理

相關(guān)學(xué)者于1997 年發(fā)現(xiàn)，通過常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），母體外周血血漿內(nèi)Y 染色體特異DNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增，證實(shí)母血漿內(nèi)伴有胎兒游離DNA，進(jìn)而開展了通過母血中胎兒游離DNA（cell－free fetal DNA，cffDNA）實(shí)施無創(chuàng)產(chǎn)前診斷新途徑[7]。另學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，以孕婦血中胎兒游離DNA 為模板，通過全基因組，大規(guī)模平行基因檢測測序技術(shù)對胎兒21 染色體非整倍體實(shí)施研究，為NIPT 開辟重要途徑[8]。孕婦外周血血漿內(nèi)游離NDA屬于胎兒及母體游離DNA 的混合物，該指標(biāo)的來源，以母體自身細(xì)胞降解為主，極少部分屬于凋亡胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，該類細(xì)胞釋放NDA，能夠?yàn)樘哼z傳物質(zhì)游離DNA 片段扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，于妊娠7 周胎盤循環(huán)建立后，即可于孕婦外周中判斷穩(wěn)定cffDNA，其濃度可依據(jù)孕周增大，而隨著上升，且平均半衰期為16min，于正常分娩2h 后，于母體外周血中尚未檢出，故本次妊娠實(shí)施產(chǎn)前檢測結(jié)果，未受到上次妊娠干擾[9]。同時胎兒游離DNA 均以小片段形成存在，平均為166bp。結(jié)合胎兒游離NDA 以上特點(diǎn)，使孕婦外周胎兒游離DNA 實(shí)施產(chǎn)前篩查，成為可能。

2 NIPT 檢測平臺

NIPT 的建立，與高通量測序技術(shù)存在密切聯(lián)系?，F(xiàn)階段，應(yīng)用于NIPT 檢測項(xiàng)目高通量測序技術(shù)已逐漸完善，以Illumina、Ion Torrent 以及BGI 三大平臺為核心，其中Illumina 通過邊和成邊測序方式，利用橋式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和可逆性末端總結(jié)作為關(guān)鍵技術(shù)，測序期間需將基因組DNA 隨機(jī)片段合理放置光學(xué)透明玻璃表面，該類DNA 片段可經(jīng)過延伸和橋式PCR 擴(kuò)張后，于Flow cell 上形成數(shù)以億計(jì)的DNA簇，且具有數(shù)千份一致模板單分子簇[10]。同時能夠通過帶熒光基團(tuán)的4 類特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止SBS 技術(shù)，對待測模式DNA 實(shí)施側(cè)訊，以文庫構(gòu)建簡單為主要特點(diǎn)，且無需實(shí)施PCR 環(huán)節(jié)，錯誤率較低，測通量大，以測序讀長較短[11]。而Ion Torrent 屬于一類尚無光學(xué)感應(yīng)的測序項(xiàng)目，通過半導(dǎo)體測序?yàn)楹诵?，選擇一類布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片，每個小孔就有一個測序反應(yīng)池，若一個受到單克隆序列，覆蓋磁珠而進(jìn)入小孔后，開始測序反應(yīng)，可依據(jù)順序一次流經(jīng)4 種堿基[12]。若產(chǎn)生堿基插入時，PH 變化，可受到反應(yīng)池感應(yīng)器所感應(yīng)，將化學(xué)信號逐漸轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，進(jìn)而讀取DNA 序列，其以測序速度快為優(yōu)勢，以單個堿基重復(fù)問題為缺陷。BGI 通過DNA納米球（DNA Nanoball，DNB）配合探針錨定聚合測序（cPAS）技術(shù)，通過一類經(jīng)特殊表面修飾規(guī)則陣列芯片，每個修飾位點(diǎn)固定于一個DNA 納米球，陣列芯片修飾位點(diǎn)距離一致，能夠確保不同納米球光信號未互相影響，進(jìn)而強(qiáng)化信號處理的合理性，以準(zhǔn)確性高、測序通量大為優(yōu)勢[13]。

3 NIPT 應(yīng)用狀況及局限性

3.1 應(yīng)用指征(1)孕早期、孕中期血清學(xué)篩查，反映胎兒染色體非整倍體風(fēng)險，進(jìn)而被歸納為臨界高風(fēng)險孕婦。（2）屬于感染性疾病活動期，介入性產(chǎn)前診斷禁忌者[14]。（3）伴有習(xí)慣性流產(chǎn)、試管嬰兒等孕婦，且在知曉同意下，可選擇無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測；（4）孕周過大，錯過現(xiàn)階段產(chǎn)前診斷最佳時間孕婦；（5）孕婦及家屬對介入性產(chǎn)前診斷存在一定恐懼，在知情同意狀況下，可實(shí)施NIPT[15]。

3.2 NIPT 應(yīng)用及問題近年來，NIPT 已在臨床得到廣泛應(yīng)用，該技術(shù)可有效規(guī)避孕婦，因侵入性產(chǎn)前診斷，而增加流產(chǎn)風(fēng)險，同時可強(qiáng)化胎兒染色體非整倍體疾病的檢出率，規(guī)避佳陽性率。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，傳統(tǒng)血清學(xué)篩查檢出率為60%—70%，具有較高的漏檢率，且伴有5%假陽性率[16]。另研究證實(shí)，NIPT 對21、18、13－ 三體綜合征檢測的準(zhǔn)確率分別可達(dá)到99.4%、97.4%以及92.5%，而假陽性率分別為0.2%、0.5%以及0.8%。NIPT 對21 三體、18 三體與13 三體綜合征，均具備較高準(zhǔn)確率，且伴有假陽性率低等特點(diǎn)，已被歸納為臨床產(chǎn)前篩查的首選，有效彌補(bǔ)血清篩查的不足[17]。但臨床研究發(fā)現(xiàn)，由于該技術(shù)的發(fā)展的限制，使其檢測結(jié)果尚無定位金標(biāo)準(zhǔn)，仍無法替代有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)[18]。而NIPT 檢測性染色體非整倍體敏感度及特異性較21、18 以及13 一三體綜合征低，導(dǎo)致該類檢測差異原因具有多類，如（1）測序自身因素，受到X 染色體GC 堿基含量便移，加之X 和Y 染色體記序列較為一致。（2）限制性胎盤嵌合以及胎兒嵌合，進(jìn)而對胎兒染色體DNA 真實(shí)狀況掩蓋[19]。故上述因素，可對胎兒性染色體非整倍提示異常孕婦，后續(xù)需實(shí)施有創(chuàng)的羊水染色體核型分析，以規(guī)避染色體非整倍體假陽性的出現(xiàn)風(fēng)險[20]。

4 小結(jié)

隨著NIPT 技術(shù)已在臨床得到逐步普及，NIPT 臨床應(yīng)用技術(shù)規(guī)范的出臺，使其經(jīng)驗(yàn)得到進(jìn)一步積累，NIPT 能夠有效減少出生缺陷兒，規(guī)避侵入性產(chǎn)前診斷而誘發(fā)的不良風(fēng)險。我們相信，NIPT 技術(shù)能夠在我國產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷中起到關(guān)鍵作用，且具有廣闊臨床使用前景及價值。