唾液檢測和唾液組學(xué)在唾液腺疾病研究中的應(yīng)用

朱 慧 俞光巖

作者單位：100081北京大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科（俞光巖為通訊作者）

唾液是人體三大體液（血液、尿液和唾液）之一，唾液腺疾病直接影響唾液腺的功能，從而影響唾液的流率和成分。唾液的分泌量和成分的變化，以及唾液中所含的多種生物標(biāo)志物，可以反映患者相關(guān)組織器官的病理狀態(tài)和疾病進(jìn)程。唾液活檢是在患者靜止?fàn)顟B(tài)下取其自然分泌唾液，檢測其中與疾病相關(guān)的分子標(biāo)志物，從而指示疾病的診斷和預(yù)后的方法。近些年來，唾液活檢及唾液組學(xué)逐漸應(yīng)用于唾液腺疾病的診斷、病情監(jiān)測及預(yù)后判斷。本文將近期反映唾液活檢及唾液組學(xué)在唾液腺疾病研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀及進(jìn)展的相關(guān)文獻(xiàn)做一綜述，并就相關(guān)問題進(jìn)行討論。

一、唾液活檢和唾液組學(xué)與唾液腺腫瘤

唾液腺腫瘤大多數(shù)系上皮性腫瘤，因其具有易于造成瘤細(xì)胞種植的特點(diǎn)，術(shù)前一般不做活檢。因此長期以來學(xué)者們探索切取活檢以外的診斷方法，包括影像學(xué)診斷、細(xì)針吸活檢等。也有一些學(xué)者嘗試采用唾液檢測來幫助診斷唾液腺腫瘤。

在出現(xiàn)臨床癥狀之前，唾液腺腫瘤患者的組織、血漿、唾液中的miRNA、蛋白質(zhì)及其他代謝物有可能已經(jīng)發(fā)生改變。Grimaldi等[1]報告，腮腺腫瘤患者的唾液中L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、肌醇、L-纈氨酸、甲酸鹽、琥珀酸鹽含量明顯異常，可能與腫瘤細(xì)胞糖代謝途徑改變有關(guān)。

有學(xué)者將唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)用于唾液腺良惡性腫瘤的鑒別。Matse等[2]提取29例良性、38例惡性腮腺腫瘤患者全唾液中的miRNA進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與良性腫瘤相比，惡性腫瘤患者唾液中miRNA表達(dá)量更多；57種miRNA的表達(dá)在良惡性腫瘤之間存在差異，其中54種系惡性腫瘤患者的表達(dá)高于良性腫瘤，僅3種miRNA的表達(dá)良性腫瘤高于惡性腫瘤。選取差異表達(dá)最顯著的9個miRNA做進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示惡性腫瘤的hsa-miR-374，hsa-miR-222，hsa-miR-15b，hsa-let-7g，hsa-miR-132和mmu-miR-140-5p表達(dá)顯著增高（P＜0.05）。采用hsa-miR-132，hsa-miR-15b，mmu-miR-140和hsamiR-223聯(lián)合檢測，區(qū)分良惡性唾液腺腫瘤的敏感性和特異性分別為69%和95%（AUC＝0.90）[2]。以上研究結(jié)果提示，唾液miRNA檢測可能成為鑒別唾液腺良惡性腫瘤手段之一，但是不同類型的唾液腺腫瘤是否具有特異性較強(qiáng)的唾液miRNA，能否作為評估唾液腺良惡性腫瘤的生物學(xué)指標(biāo)尚需深入研究。

唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic adenocarcinoma，SACC）是唾液腺最常見的惡性腫瘤之一，具有生長緩慢、浸潤性強(qiáng)、血行性轉(zhuǎn)移率高、手術(shù)切除后易于復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。手術(shù)治療后發(fā)生血行性轉(zhuǎn)移的時間長短不等，難以預(yù)測。因此，一些學(xué)者試圖探索能夠預(yù)測轉(zhuǎn)移風(fēng)險和患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。MYB易位是目前研究較深入的影響SACC預(yù)后的分子機(jī)制。在SACC中，約50%患者存在MYB/NFIB基因融合，而MYB的過表達(dá)率高達(dá)80%[3]。Wang等[4]的研究結(jié)果顯示，MYB是SACC中上調(diào)miR-130a表達(dá)的關(guān)鍵因子，miR-130a可以靶向NDRG2基因的3’UTR區(qū)，使NDRG2表達(dá)降低，從而促進(jìn)SACC的增殖和轉(zhuǎn)移。MYB過表達(dá)后，CDH1表達(dá)下調(diào)，CDH2、VIM、ACTA2表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，促進(jìn)腫瘤肺轉(zhuǎn)移[5]。目前未見唾液中MYB表達(dá)的研究。

表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)也用于SACC侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。Feng等[6]的研究結(jié)果顯示，miR-205在原發(fā)性SACC組織中高表達(dá)，而miR-155和miR-342在復(fù)發(fā)性SACC組織中高表達(dá)。也有研究顯示，miR-181a、miR-582-5p、miR-140-5p、miR-125-5p等小分子RNA可以抑制SACC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，在SACC組織中表達(dá)下調(diào)[7~9]。miR-155可以加快細(xì)胞周期進(jìn)程，在SACC組織中表達(dá)上調(diào)，miR-17、miR-20a等miRNA表達(dá)升高常提示預(yù)后不良[10]。miR-21在多種腫瘤中過表達(dá)，Yan等[11]的研究結(jié)果顯示，miR-21可能通過靶向PDCD4、PTEN、Bcl-2基因促進(jìn)SACC的進(jìn)展。Fu等[12]報告，miR-103a-3p的過表達(dá)通過靶向TPD52促進(jìn)SACC細(xì)胞遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Sun等[13]認(rèn)為，miR-320a通過靶向ITGB3基因抑制SACC轉(zhuǎn)移，與低肺轉(zhuǎn)移性ACC2和SACC-83細(xì)胞相比，高肺轉(zhuǎn)移性ACCM和SACC-LM細(xì)胞中的miR-320a表達(dá)下調(diào)，且miR-320的低表達(dá)預(yù)示了患者的低生存率。Brown等[14]通過定量PCR研究了miR-150，miR-455-3p和miR-375的表達(dá)，探討SACC和多形性腺癌（polygonal adenocarcinoma，PAC）之間可能存在的分子差異。結(jié)果顯示，與正常唾液腺組織相比，SACC和PAC中miRNA-150和miRNA-375的表達(dá)顯著降低，而與PAC相比，SACC中的miRNA-455-3p表達(dá)顯著增加，可通過miRNA-455-3p檢測與免疫組化相結(jié)合，來鑒別診斷SACC與PAC。但以上研究主要基于SACC患者的腫瘤組織中miRNA的改變，唾液中的miRNA是否能用于SACC的鑒別診斷和預(yù)后判斷尚未見報道。

SACC-83細(xì)胞系是國內(nèi)最常用的腺樣囊性癌細(xì)胞系之一。有研究表明，SACC-83細(xì)胞來源的外泌體具有細(xì)胞間交流通訊與調(diào)節(jié)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的功能，腫瘤細(xì)胞攝取SACC-83細(xì)胞來源的外泌體后，細(xì)胞的增殖能力顯著提高，這可能與細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶的活化以及絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路的激活相關(guān)[15]。宋夢陽等[16]的研究顯示，宿主細(xì)胞吸收SACC-83細(xì)胞來源的外泌體后，細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白claudin5和ZO-1的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞間連接松解，從而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，同時血管內(nèi)皮屏障被破壞，內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增強(qiáng)，腫瘤的侵襲能力增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤的血行性轉(zhuǎn)移。MRPL23-AS1是一種長非編碼RNA，在SACC組織中高表達(dá)，并與肺轉(zhuǎn)移和患者總生存期相關(guān)，是EREG基因的下游lncRNA。MRPL23-AS1通過與ZEST同源增強(qiáng)子2（EZH2）形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，正向調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。此外，SACC患者血漿外泌體中的MRPL23-AS1水平較高，外泌體中MRPL23-AS1通過“外分泌”的方式作用于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加其通透性，促進(jìn)SACC的體內(nèi)轉(zhuǎn)移[17]。腺樣囊性癌患者唾液中的外泌體是否具有調(diào)節(jié)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的功能，尚需進(jìn)一步研究。

二、唾液活檢和唾液組學(xué)與IgG4相關(guān)唾液腺炎

IgG4相關(guān)唾液腺炎（IgG4-related sialadenitis，IgG4-RS）是近年來被認(rèn)識的一種自身免疫性疾病，主要累及下頜下腺、腮腺、舌下腺和淚腺，表現(xiàn)為多發(fā)性外分泌腺腫大，常為雙側(cè)，患者唾液流率常降低，部分患者伴鼻竇炎、聽力下降、頸淋巴結(jié)腫大等表現(xiàn)[18]。系統(tǒng)性IgG4-RS常伴有內(nèi)臟器官受累，其中以肺部和胰腺病變較多見[19]。多數(shù)患者血清IgG4及IgE水平升高，但自身抗體常為陰性。下頜下腺或腮腺組織病理學(xué)和免疫病理學(xué)是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[20]。組織病理學(xué)顯示腺泡萎縮，彌漫性淋巴漿細(xì)胞浸潤，淋巴濾泡形成，可見地圖樣生發(fā)中心；腺體內(nèi)廣泛席紋狀纖維化，導(dǎo)管周圍可見膠原鞘，合并血栓性靜脈炎。免疫組化表現(xiàn)為大量IgG、IgG4陽性漿細(xì)胞浸潤，IgG4+漿細(xì)胞計數(shù)>50/高倍視野，IgG4+/IgG+細(xì)胞比例＞40%。臨床上綜合臨床表現(xiàn)、組織學(xué)和免疫病理學(xué)特征、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查結(jié)果做出IgG4-RS的診斷。

IgG4-RS是免疫介導(dǎo)的系統(tǒng)性疾病，其治療采取以糖皮質(zhì)激素為主的免疫調(diào)節(jié)治療，療效顯著，療程較長。Hong等[21]報告43例經(jīng)免疫調(diào)節(jié)治療的患者，治療后所有患者腫大的唾液腺和淚腺明顯縮小，唾液分泌增加，血清學(xué)IgG4水平明顯下降。長期維持治療過程中，血清IgG4水平與病變復(fù)發(fā)密切相關(guān)。因此，血清學(xué)IgG4和IgE水平不僅是IgG4-RS診斷的重要指標(biāo)，而且是患者隨訪觀察過程中病情監(jiān)測、藥物劑量調(diào)整的重要依據(jù)。患者需3~6個月復(fù)查IgG4及IgE水平，目前采取血清學(xué)檢測。唾液直接來源于受損傷的唾液腺，唾液組學(xué)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡及干燥綜合征等自身免疫性疾病中已有應(yīng)用的報道。而IgG4-RS患者唾液中的IgG4和IgE水平是否與血清水平相平行，唾液檢測能否替代血清檢測，從而提高病情監(jiān)測的無創(chuàng)性和方便性，是非常值得研究的課題。

三、唾液活檢和唾液組學(xué)與干燥綜合征

干燥綜合征（Sj?gren's syndrome，SS）是一種以淋巴細(xì)胞浸潤外分泌腺，尤其是唾液腺和淚腺為特征的自身免疫性疾病，患者常出現(xiàn)口干、眼干等癥狀。約1/3的SS患者會出現(xiàn)肺、肝、腎、神經(jīng)、關(guān)節(jié)等多系統(tǒng)損害。目前對SS的發(fā)病機(jī)制尚無定論。從免疫角度來看，SS患者異常的B細(xì)胞過度活躍，產(chǎn)生自身抗體，并通過T細(xì)胞和干擾素途徑的激活，來增強(qiáng)免疫反應(yīng)，SS患者血清中干擾素-α水平明顯升高。

唾液活檢在SS的診斷中顯示出應(yīng)用前景。目前在臨床上常用的生物標(biāo)志物，如抗Ro/SS-A、La/SS-B抗體，類風(fēng)濕因子和抗核抗體，有一定的局限性，在疾病早期，敏感性和特異性相對較低。SS患者的唾液中也存在這些自身抗體。有的自身抗體可能在患者出現(xiàn)癥狀之前即已出現(xiàn)，具有早期診斷價值[22]。組織特異性抗體陽性可以幫助識別抗Ro/SSA抗體陰性的SS患者，SS患者的唾液中抗CA-6、SPI及PSP抗體的含量均顯著增加，這也提示組織特異性抗體在唾液腺損傷中發(fā)揮作用[23]。

唾液代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、微生物組學(xué)在SS診斷中均顯示出有意義的變化。SS患者唾液中酪氨酸、尿酸、海藻糖的含量低于健康對照組[24]。miR-146a在SS患者的唾液中的表達(dá)高于健康對照組，miR-17、18a、146b的表達(dá)可能發(fā)生改變，并 且 與 超 聲 表 現(xiàn) 和ESSPRI（EULAR Sj?gren’s syndrome patients reported index）評分以及抗La/SS-B抗體陽性有關(guān)[25]。在蛋白質(zhì)組學(xué)方面，胱抑素S、α-烯醇化酶、β2-微球蛋白等可能是SS的唾液標(biāo)志物，但未被臨床證實(shí)。Lee等[26]的研究結(jié)果顯示，可溶性唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素（siglec）-5在SS患者的唾液中高表達(dá)，siglec-5可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能。Moreno-Quispe等[23]測定36例SS患者和35例健康對照者唾液中的細(xì)胞因子，結(jié)果顯示，白介素-6在SS患者中顯著升高。Sembler-M?ller等[27]對24例SS患者和16例有口眼干燥癥狀但不符合SS診斷的對照者的唾液進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示，唾液中存在40種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、包含三重基序的蛋白質(zhì)29和鈣網(wǎng)蛋白三種蛋白質(zhì)組合后，區(qū)分SS和非SS患者的準(zhǔn)確率達(dá)到97%。Selifanova等[28]的研究結(jié)果顯示，檢測腮腺分泌的唾液中的淋巴細(xì)胞分型可以區(qū)分SS患者和健康對照者，其敏感性為77.5%，特異性為100%，陽性預(yù)測值為100%，陰性預(yù)測值為69%。

唾液活檢和唾液組學(xué)有助于對SS發(fā)病機(jī)制的深入研究。Aqrawi等[29]使用液相色譜-質(zhì)譜法對27例SS患者和32例健康對照者的唾液和淚液進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，SS患者唾液中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂蛋白（LCN2）表達(dá)上調(diào)，LCN2是與先天免疫系統(tǒng)和中性粒細(xì)胞激活相關(guān)的鐵結(jié)合蛋白，該結(jié)果支持SS的發(fā)病可能與病毒感染相關(guān)的觀點(diǎn)[30]。唾液來源的細(xì)胞外囊泡中還存在激活先天免疫系統(tǒng)和脂肪細(xì)胞分化的生物標(biāo)志物，與SS患者唾液腺中淋巴細(xì)胞浸潤與脂肪細(xì)胞替代等病理機(jī)制相關(guān)[29]。

唾液活檢還可以用于SS的預(yù)后判斷。少數(shù)SS患者可能發(fā)展為黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤（mucosal-associated lymphoid tissue lymphoma，MALT）。由SS轉(zhuǎn)變?yōu)镸ALT患者的唾液中，抗cofilin-1和α-烯醇酶抗體，以及Rho GDP解離抑制劑2的表達(dá)水平顯著升高，由此可以預(yù)測SS向MALT淋巴瘤進(jìn)展的可能性[31]。抗黏液病毒蛋白1（anti myxovirus protein 1，MX1）是干擾素抗病毒反應(yīng)的主要介質(zhì)，受到Ⅰ型干擾素的強(qiáng)烈調(diào)節(jié)。MX1被認(rèn)為是評估SSⅠ型干擾素生物活性的最實(shí)用的生物標(biāo)記物。Maria等[32]的研究結(jié)果顯示，活躍的SS患者，其MX1水平高，高水平的MX1與歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟評分得分高及類風(fēng)濕因子水平等其他實(shí)驗(yàn)室參數(shù)具有相關(guān)性。而Aydemir等[33]未發(fā)現(xiàn)唾液與血清中MX1的水平與SS的活動性有關(guān)，其原因可能是受患者不同治療方式的影響。如果能夠發(fā)現(xiàn)反映SS疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志物，則對SS患者個性化治療策略的制定和實(shí)施，以及對疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)判發(fā)揮重要作用。

四、結(jié)語

綜上所述，唾液活檢和唾液組學(xué)對唾液腺疾病的診斷、疾病檢測和預(yù)后判斷具有良好的應(yīng)用前景。目前在唾液腺腫瘤的唾液活檢方面，已有一些研究報告，但研究目標(biāo)多為探索良惡性腫瘤間生物標(biāo)志物的差異，提出的分子標(biāo)志物數(shù)量多，結(jié)果分散，尚缺乏與腫瘤密切相關(guān)的確切的標(biāo)志物。在臨床應(yīng)用較為困難，尚不能取代組織病理活檢用于臨床診斷。對SACC的研究多集中在各類lncRNA、miRNA的差異比較及其與侵襲和轉(zhuǎn)移的可能關(guān)系，對于唾液外泌體尚缺乏研究。而唾液中尤其是唾液外泌體中含有蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、lncRNA、miRNA等多種生物標(biāo)志物，在口咽癌、肺癌等多種腫瘤中已有研究報道，現(xiàn)已開發(fā)通過檢測唾液進(jìn)行腫瘤診斷的裝置[34]。80%的HPV陽性口咽癌患者的唾液外泌體中可以檢測到HPV-DNA[35]。今后宜在原有基礎(chǔ)上進(jìn)行聚焦，集中若干個關(guān)鍵問題進(jìn)行深入研究，諸如影響多形性腺瘤惡變的關(guān)鍵因子以及唾液外泌體中可用于SACC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移預(yù)測的關(guān)鍵分子的探索等。

對于IgG4-RS和SS，目前臨床診斷和病情監(jiān)測中多參考血清學(xué)抗體檢查，而唾液中亦含有多種免疫球蛋白，深入研究唾液檢測與血清檢測的相關(guān)性和平行性、唾液中各類抗體與疾病狀態(tài)的相關(guān)性以及與組織病理學(xué)嚴(yán)重程度的相關(guān)性，探討唾液檢測替代血清檢測的可能性，將其用于患者隨訪和病情監(jiān)測，將是非常有意義的。