活性元素對(duì)生物活性陶瓷促成骨作用的影響研究

韓先卓， 金麗歐， 張京劇

（1. 上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸一科，上海 200072；2. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種應(yīng)用于骨組織工程的生物陶瓷，研究較多的是將生長(zhǎng)因子摻入骨組織支架和植入物中， 如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor, VEGF）、 骨 形 態(tài) 發(fā) 生 蛋 白（bone morphogenetic protein，BMP）， 它們可以激活骨缺損周?chē)杉?xì)胞的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，從而誘導(dǎo)血管生成、骨組織修復(fù)[1]。 但生長(zhǎng)因子價(jià)格昂貴，支架制備時(shí)蛋白質(zhì)易降解， 并且常發(fā)生非特異性靶向作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，不同的離子在細(xì)胞環(huán)境及骨骼愈合過(guò)程中起到一定作用，如鈣（Ca2+）、鍶（Sr2+）、鎂（Mg2+）、鋰（Li+）、硅（SI4+）、硼（B3+）、銅（Cu2+）、鋅（Zn2+）、鈷（Co2+）等。與生長(zhǎng)因子相比，使用此類(lèi)離子誘導(dǎo)骨組織修復(fù)成本低，更簡(jiǎn)便而穩(wěn)定[3]，但其與人體細(xì)胞之間相互作用的確切機(jī)制尚不完全清楚。 生物陶瓷植入體內(nèi)后發(fā)生不同程度的降解，而釋放出來(lái)的離子可改變生物微環(huán)境，從而影響材料的成血管、成骨作用。 因此，特定化學(xué)離子取代的生物陶瓷已被認(rèn)為是促進(jìn)骨再生的一種較有前途的策略。 本文側(cè)重于將生物陶瓷中釋放的離子溶解產(chǎn)物對(duì)骨骼再生的作用和分子機(jī)制作一綜述。

1 離子類(lèi)型

1.1 主族金屬

1.1.1鈣（Ca） 體內(nèi)約99%的鈣存在于骨組織無(wú)機(jī)相中，鈣離子刺激間充質(zhì)前體細(xì)胞以及成熟骨細(xì)胞的增殖，使得一定數(shù)量的骨生長(zhǎng)前體細(xì)胞被募集到損傷部位， 鈣通過(guò)鈣調(diào)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及ERK1/2和PI3K/Akt 途徑的激活， 刺激人成骨細(xì)胞的黏附、增殖和分化。低濃度Ca2+促進(jìn)成骨細(xì)胞、人牙囊細(xì)胞增殖，而中等濃度Ca2+促進(jìn)細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)礦化[4]。 雙相磷酸鈣（hydroxyapatite/tricalcium phosphate, HA/TCP）復(fù)合支架釋放出的鈣離子可促進(jìn)大鼠顱骨缺損的骨形成。 因此，未來(lái)的生物材料設(shè)計(jì)可通過(guò)調(diào)節(jié)其成分的濃度比來(lái)影響成骨作用。

1.1.2鍶（Sr） 鍶與鈣相似，體內(nèi)約98%的鍶位于骨組織中，雷奈酸鍶已被用作骨質(zhì)疏松癥的臨床治療方法[5]。 鍶可以增強(qiáng)成骨、降低破骨[6]，鍶影響間充質(zhì)干細(xì)胞NF-κB 和Wnt/β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖,還通過(guò)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路刺激血管生成。 鍶離子在濃度為0.4～0.9 mmol/L 時(shí)促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）成骨分化，而濃度為0.9～1.8 mmol/L 時(shí)加快增殖[7]。 兔體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，摻鍶的HA 支架新骨形成更多[8]；大鼠體內(nèi)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Sr-HA 形成的骨組織更致密。但是鍶離子進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制，以及細(xì)胞內(nèi)鍶沉積怎樣影響細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，目前尚未清楚。

1.1.3鎂（Mg） 鎂參與能量代謝，是脂質(zhì)和核酸合成的酶促反應(yīng)等功能所必需的物質(zhì)，鎂在成骨早期刺激成骨細(xì)胞的增殖、增加細(xì)胞黏附、鋪展，促進(jìn)基質(zhì)礦化，從而提高骨整合[9]。 提高HA 中的Mg2+摻雜濃度可以刺激模擬體液（simulated body fluid，SBF）溶液中仿生磷灰石樣層的形成。 Hung 等[10]發(fā)現(xiàn)，鎂激活人BMSC 中Wnt 信號(hào)通路， 促進(jìn)BMSC 向成骨細(xì)胞譜系分化，1～3 mmol/L 的鎂離子可以提高人成骨細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞間通信[11]。在新西蘭白兔體內(nèi)的測(cè)試表明， 摻Mg-HA 填充股骨缺損具有良好的骨轉(zhuǎn)導(dǎo)性[12]，但目前Mg-HA 的高溶解率仍然需要解決。

1.1.4鋰（Li） 鋰被廣泛用作情緒穩(wěn)定劑，其可抑制糖原合成酶激酶從而激活經(jīng)典Wnt/B-catenin 信號(hào)通路，誘導(dǎo)間充質(zhì)祖細(xì)胞成骨分化，促進(jìn)骨折愈合[13]。 摻鋰磷酸三鈣可促進(jìn)BMSCs 和MC3T3-E1 細(xì)胞的增殖和成骨，并在體內(nèi)刺激骨形成。 Lu 等[14]發(fā)現(xiàn)，摻鋰生物玻璃陶瓷可以通過(guò)激活Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，Li-HA 在模擬體液中可以誘導(dǎo)仿生磷灰石層的體外形成、加速骨整合過(guò)程， 鋰的摻入在2.2～5.5 μg/mg 時(shí)，MG63 細(xì)胞的附著和早期增殖均得到增強(qiáng)[15]。兔體內(nèi)植入的研究發(fā)現(xiàn)，Li-HA 支架能夠誘導(dǎo)新骨形成[16]，但是鋰促進(jìn)成骨的確切作用機(jī)制和離子的用量有待進(jìn)一步研究。

1.2 非金屬

1.2.1硅（SI） 硅是骨骼發(fā)育必不可少的微量元素，補(bǔ)充硅可增加骨密度。 硅可以激活A(yù)MPK/ERK2 和PI3K/Akt 通路，調(diào)節(jié)骨基質(zhì)中膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白穩(wěn)態(tài)， 濃度小于50 μmol/L 的硅可以刺激人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的分化；硅離子穩(wěn)定低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達(dá)，并上調(diào)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、VEGF 等[16]。 而在破骨細(xì)胞中較低濃度的硅會(huì)促進(jìn)破骨細(xì)胞的發(fā)育，而較高濃度的硅會(huì)抑制破骨細(xì)胞的發(fā)育及其骨吸收活性[17]。 然而關(guān)于硅離子誘導(dǎo)成骨成血管的確切濃度，目前尚未有定論，可能需要進(jìn)一步的研究。

1.2.2硼（B） 硼通常被用作調(diào)節(jié)陶瓷和玻璃生物學(xué)特性的關(guān)鍵添加劑，硼處理濃度在1～100 ng/mL，會(huì)使BMSC 和骨祖細(xì)胞MC3T3-E1 細(xì)胞骨形成標(biāo)志基因的表達(dá)和BMP 上調(diào)[18]。

1.3 過(guò)渡金屬

1.3.1銅（Cu） 銅是人類(lèi)必需的微量元素，可上調(diào)VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶致細(xì)胞外基質(zhì)降解，刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。Baino 等[19]發(fā)現(xiàn)硅酸銅生物陶瓷中釋放的Cu2+，能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞中VEGF 的表達(dá)。 摻雜有低Cu2+含量（＜5 at%，at%為原子數(shù)百分含量） 的HA 涂層對(duì)MC3T3-E1 有良好細(xì)胞相容性[20]，其濃度344 μmol/L對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞相對(duì)無(wú)毒；269.4 μmol/L 對(duì)人成骨細(xì)胞系保持相對(duì)無(wú)毒[21]。 但其他研究人員發(fā)現(xiàn)摻雜1 at%的Cu-HA 對(duì)Balb/c3T3 小鼠成纖維細(xì)胞、人類(lèi)胎兒成骨細(xì)胞（hFOB 1.19）有嚴(yán)重細(xì)胞毒性[22]?？赡艹藫诫s水平以外，材料合成技術(shù)以及測(cè)試細(xì)胞系對(duì)摻雜Cu2+的生物學(xué)性能也有很大影響。

1.3.2鋅（Zn） 鋅離子對(duì)機(jī)體骨骼的正常生長(zhǎng)至關(guān)重要，鋅刺激骨形成和礦化，在模擬體液SBF 中浸泡3 d 后， Zn 摻雜（2.4 at%）HA 表面出現(xiàn)仿生磷灰石樣層，Zn2+濃度分別低于15、7 μg/mL 時(shí)， 對(duì)破骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)毒[23]。 摻鋅介孔羥基磷灰石微球/膠原支架可增強(qiáng)大鼠BMSC 成骨分化； 與純HA 相比，摻鋅HA 植入大鼠體內(nèi)能夠促進(jìn)新骨形成[24]，鋅改性的硅酸鈣涂層的鋅離子通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 促進(jìn)骨質(zhì)疏松兔體內(nèi)植入物周?chē)鹿堑男纬蒣25]。由于以上鋅對(duì)成骨細(xì)胞生成、成骨細(xì)胞活性和組織礦化的促進(jìn)作用，鋅離子被認(rèn)為有望改善材料的骨整合作用。

1.3.3鈷（Co） 鈷具有促進(jìn)骨組織血管形成的作用，低摻雜水平（0.37 at%）Co-HA 可以維持人類(lèi)骨肉瘤細(xì)胞活力，增強(qiáng)成骨、促血管生成[26]。 在成骨早期階段，鈷濃度為1×10-6時(shí)，成骨和促血管生成因子均被上調(diào)；而在成骨晚期階段，其濃度為1×10-6時(shí)骨再生效果最佳，而5×10-6時(shí)，破骨細(xì)胞生成活性最強(qiáng)。 將鈷摻入磷酸三鈣中可以激活HIF 目標(biāo)基因（如VEGF） 來(lái)促進(jìn)血管生成; 而含鈷的磷酸鈣使MC3T3-E1 細(xì)胞活力顯著降低、細(xì)胞骨架組織損傷。但是大鼠動(dòng)物模型表明，Co-HA 可以在植入后6 個(gè)月發(fā)生下頜缺損處顯著成骨[27]。因此，我們認(rèn)為調(diào)節(jié)鈷的劑量范圍，可能會(huì)一定程度地調(diào)節(jié)骨骼和血管系統(tǒng)的協(xié)作,但鈷在生物材料中的應(yīng)用仍存在爭(zhēng)議。

1.4 其他離子

除以上幾種離子外，還有一些離子新近被應(yīng)用于成骨材料中，以下選取釓、鎵進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。 釓（Gd）基生物陶瓷或螯合劑已經(jīng)用于抗癌治療、磁共振成像中。 Liao 等[28]發(fā)現(xiàn)摻雜釓有效激活了Wnt/βcatenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨相關(guān)基因的表達(dá)。 但目前仍很少有關(guān)于基于Gd 的生物材料用于骨缺損愈合的研究， 其生物相容性和成骨活性仍有待于討論。 鎵（Ga）有抗增殖特性，多在癌癥治療中研究，其通過(guò)破壞微生物對(duì)鐵的利用，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。 含Ga 的磷酸鹽玻璃顯著抑制破骨相關(guān)基因的表達(dá)，上調(diào)晚期成骨基因的表達(dá)[29]。

2 展望

生物材料中離子發(fā)揮的作用是復(fù)雜而精妙的，在臨床應(yīng)用上有著可觀的前景，而離子成骨作用的發(fā)揮會(huì)受到材料種類(lèi)、離子濃度、材料釋放其他離子等的影響。 離子產(chǎn)生的化學(xué)信號(hào)影響相鄰細(xì)胞間通信，從而加速組織再生。 因此，使用具有特定化學(xué)離子摻雜的生物材料已被認(rèn)為是骨組織工程中一種有前途的策略。

但我們?nèi)孕鑼?duì)材料的生物學(xué)特性有一個(gè)更好的了解，并判斷離子與骨再生的潛在信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)關(guān)系， 將先進(jìn)的材料和/或干細(xì)胞和/或生長(zhǎng)因子等結(jié)合起來(lái)，用基于離子的支架進(jìn)行骨再生。 并應(yīng)行進(jìn)一步研究以評(píng)估它們的生物相容性、 細(xì)胞毒性、骨整合和生物降解特性，從而研發(fā)出更有效的成骨材料，以期為臨床應(yīng)用提供參考。