正常精漿替換精漿液化不良患者異常精漿對精子前向運動影響研究

劉 敏

（贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，江西 贛州 341000）

人類精液在射精后立即凝結(jié)，通常在體外大約15～20 min 內(nèi)液化［1］。精液不液化是指射精后1 h 內(nèi)精液未液化［2］的現(xiàn)象，目前報道其發(fā)生率并不少見。精液不液化常合并精子運動力下降，是造成男性不育癥常見病因［3］。關(guān)于精子運動力下降原因，目前國內(nèi)外無相關(guān)研究專門研究精液不液化患者精子運動力下降原因。有研究認為是異常精漿免疫成分造成的［4］；也有研究認為不液化的精液中纖維交織成網(wǎng)，物理作用限制了精子運動［5］。本文通過比較液化不良患者異常精漿和液化正常者精漿置換后兩組精子前向運動百分率變化，研究液化不良患者精子活動力下降原因，旨在為精液不液化相關(guān)疾病導致男性不育的治療提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)過醫(yī)學倫理委員會審核通過，每位受試者均簽署知情同意書并告知實驗目的、步驟等情況。選取2017 年5 月—2020 年4 月本院精液不液化合并弱精癥患者28例為液化不良組，另外選取28 例有生育且精液常規(guī)檢查結(jié)果正常為液化正常組。液化不良組年齡21～46 歲，平均（30.1±5.7）歲，所有患者體檢男性性征、生殖器無畸形，睪丸大小無明顯異常。液化正常組年齡20～39歲，平均（29.8±3.7）歲，男性體格檢查正常。

1.2 納入和排除標準 納入標準：液化不良組納入標準根據(jù)WHO 規(guī)定，新鮮離體標本應該在室溫60 min 內(nèi)發(fā)生液化，如果超過60 min 仍然含有不液化的凝塊或者黏液絲，則稱為精液不液化。液化正常組納入標準：體檢健康，離體精液標本都在室溫30 min內(nèi)發(fā)生液化。排除標準：重度少精子癥；睪丸體積（雙側(cè)）＜8 mL、外周血常規(guī)染色體檢查無異常和Y染色體微缺失檢查正常等明確弱精癥病因的。

1.3 方法

1.3.1 標本收集和精子質(zhì)量分析 兩組患者均按生殖醫(yī)學科標準流程操作，禁欲2～7 d，取精室手淫取精。收集完整精液于無菌取精杯中，即送男科實驗室，置于37 ℃恒溫水浴箱中，每10 min觀察1次，觀察精液中是否存在不液化凝塊或黏液絲，記錄凝塊或黏液絲消失的時間。嚴格按照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊（第五版）》標準，采用計算機輔助的精子自動分析系統(tǒng)（CASA），分別記錄兩組精液標本實驗前后的液化情況，濃度、前向運動精子百分率（percentage of forward motile sperm，PR）等指標。

1.3.2 分離得到單純精漿和精子 兩組精液標本采用短時高速離心方法得到單純精漿成分，3 000 g離心，5 min 后取上層精漿1～3 mL，鏡檢確認精漿中無精子存在，得到了不含精子的精漿成分［6］。短時高速離心是蛋白質(zhì)芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對精漿處理常用手段，主要用于檢查異常精漿蛋白質(zhì)，短時高速離心已經(jīng)證實對精漿內(nèi)蛋白質(zhì)含量無明顯影響。密度梯度離心法處理精液前后精子活力差異無統(tǒng)計學意義［7］，所以采用密度梯度離心法處理精液。采用密度梯度離心得到富集精子，有明顯凝塊的精液標本可用注射器多次吹打精液促進液化。液化后的精液放置于下層95%、上層75%的密度梯度離心液（Isolate，Irvine 公司）中以300 g，18 min 梯度離心，然后取下層離心液于3 mL G-ivf（VItrolife公司）中以200 g轉(zhuǎn)速再次離心。舍去上層多余的G-ivf，留取0.5 mL 液體。這樣得到兩組分離的單純精漿和富集精子成分。

1.3.3 精漿交換和計算機輔助精子分析（CASA）

液化不良組富集精子成分0.5 mL 和液化正常組單純精漿0.5 mL 相互混合，輕搖混勻后放置37 ℃恒溫水浴箱中，30 min 后記錄前向運動精子百分率（PR）值。同樣方法處理液化正常組精子成分0.5 mL和液化不良組單純精漿，兩者混勻并記錄PR值。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

置換前液化正常組的精子PR 明顯大于液化不良組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；置換后兩組間PR 值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。從兩組內(nèi)的PR 縱向比較顯示，置換前后兩組精子PR 明顯呈升降變化，液化正常組精子PR 下降而液化不良組上升，PR 變化差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 精漿置換前后不同組間PR和組內(nèi)PR變化比較/±s

注：PR：精子前向運動精子百分率。

組別液化不良組液化正常組n t P 28 28 15.233 7.127 0.016 0.027 tP精漿替換前PR 21.57±3.63 45.26±9.64 12.170 0.021精漿替換后PR 40.83±5.62 30.89±4.57 1.901 0.073

3 討 論

人類精液在射精離體后立即凝固，隨后出現(xiàn)精液液化過程，這是人類進化過程中重要的生理現(xiàn)象。液化過程通常在15～20 min 內(nèi)完成，其液化過程受凝塊中精漿蛋白部分水解程度的影響［8］。有文獻指出精液不液化影響了大約12%～29%的男性不育患者［9］。精液不液化不僅對精液的物理和生化特性有不利影響，而且還對精子的活力和形態(tài)等重要參數(shù)產(chǎn)生負面影響；但對精子存活率和精子數(shù)量、濃度無影響［10］。對于精子活力方面，有研究認為精液不液化表現(xiàn)出阻礙精子前向運動的捕獲物理效應，將精子捕獲在由精漿蛋白形成的基質(zhì)中，從而影響精子運動并對生育能力產(chǎn)生負面影響［11］。也有研究利用熒光定位證實發(fā)現(xiàn)精囊凝固蛋白Ⅰ（Semenogelin Ⅰ，Sg Ⅰ）通過與精子表面的附睪蛋白酶抑制劑（Epididymis protease inhibitor，Eppin）相結(jié)合形成Sg Ⅰ-Eppin 復合體覆蓋在于精子表面，從而抑制精子的前向運動［12］。有研究分析了616對夫婦的精液質(zhì)量與性交后測試（the postcoital test，PCT）結(jié)果之間的關(guān)系，認為更好的精液液化時間與顯著改善PCT 的結(jié)果正相關(guān)［13］。所以精液不液化患者異常精漿可能是導致男性不育的重要因素。為了研究精液不液化異常精漿對精子前向運動影響程度，本研究首次利用正常精漿和異常精漿交換后精子前向運動精子百分率（PR）變化的方法，目前國內(nèi)外還未有精漿交換用于精子活力方面的研究。本研究觀察的是精子前向運動，因此排除了小睪丸、外周血常染色體和Y染色體微缺失檢查異常等明確弱精癥病因的患者。

本研究結(jié)果顯示：①精漿置換前液化正常組的精子PR 明顯大于液化不良組。與GONZALES GF等［3］研究結(jié)果一致，提示精液不液化患者通常有弱精癥表現(xiàn)。②精漿置換前后同組精子PR 有明顯變化，液化不良組PR 升高，而液化正常組PR 下降，置換后兩組間PR 值差異無統(tǒng)計學意義。上述實驗數(shù)據(jù)說明精漿置換后液化不良組異常精漿降低了液化正常組正常精子前向運動百分率，而正常精漿對不液化不良組精子作用提高了PR。實驗結(jié)果證實精液不液化患者精子活力下降是異常精漿導致，而非精子自身原因。

目前認為精液凝固和液化是精子前向運動和精子獲能的關(guān)鍵，而精液液化過程受多因素影響。精漿內(nèi)的精囊凝固蛋白（Sg Ⅰ）、附睪蛋白酶抑制劑（Eppin）與前列腺特異性抗原（Prostate specific antigen，PSA）在調(diào)控精液凝固與液化過程中起主導作用［14］。與正常男性組對比，精液不液化使得精液中Sg Ⅰ仍然停留在精子表面，進一步導致精子運動能力降低［15］。而正常精漿中含有如纖溶酶原、系統(tǒng)組織纖溶酶原激活劑（Tissue-typeplasminogenactivator，tPA）及尿激酶纖溶酶原激活劑（Urokinase-typeplasminogen activator，uPA）、前列腺釋放的激肽釋放酶等蛋白酶類等促進或誘導精液液化，可能是精漿置換后精子前向運動變化的原因。

因此本研究結(jié)果有助于為精液不液化提供治療方向，治療此疾病更應針對異常精漿，促進精液液化提高精子活力，而不是單純利用提高精子活性類藥物。