沼澤紅假單胞菌蛋白R(shí)hp-PSP對(duì)煙草花葉病毒的系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)及互作蛋白篩選

周寒梅，陳麗潔，翟忠英，張德詠,2，蘇 品,2，劉 勇,2*

（1. 湖南大學(xué)研究生院隆平分院，長(zhǎng)沙 410125；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，長(zhǎng)沙 410125）

關(guān) 鍵 字：沼澤紅假單胞菌；防御酶；抗病相關(guān)基因；蛋白互作

煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus（TMV）是一種具有代表性的植物病毒，可侵染黃瓜、番茄、辣椒等350多個(gè)物種，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是僅次于黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus（CMV）的第二大優(yōu)勢(shì)病毒[1,2]。目前，TMV的防治措施主要為抗病品種選育、實(shí)行套種輪作等農(nóng)業(yè)防治手段以及治蚜防病、藥劑防治等化學(xué)手段[3]。但由于高抗品種選育難、防治效果不理想、抗藥性、殘留、食品安全等一系列問題，目前還未出現(xiàn)國(guó)際公認(rèn)的抗TMV藥物[4]。在當(dāng)前的綠色農(nóng)業(yè)背景下，生物防治由于其低毒、環(huán)境友好等特點(diǎn)已成為重點(diǎn)研究方向。用于生物防治的生防因子包括拮抗微生物、抗生素和植物誘導(dǎo)子等[5]。

光合細(xì)菌（Photosynthetic bacteria）是指可以在光照下進(jìn)行光合作用的厭氧或兼氧生長(zhǎng)的一類細(xì)菌[6]。作為一種生防菌在生物防治領(lǐng)域已得到廣泛研究和應(yīng)用[7]。研究人員發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[8]。如經(jīng)過光合細(xì)菌處理后的蠶豆與莧色藜植株，對(duì)黃瓜花葉病毒、香石竹斑駁病毒的抗病性增強(qiáng)[9]，劉勇等[10]的研究發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌稀釋液可有效防治田間辣椒病毒?。籗u等[11]的研究表明，在煙草葉際施用光合細(xì)菌活菌懸液后，對(duì)TMV產(chǎn)生了明顯的抗性。但大部分研究未對(duì)光合細(xì)菌發(fā)揮抗病作用的物質(zhì)進(jìn)行深入研究。前期試驗(yàn)證明，在光合細(xì)菌沼澤紅假單胞菌菌液中發(fā)現(xiàn)了一種高氯酸溶性蛋白（perchloric acid-soluble protein，PSP），命名為Rhp-PSP，該蛋白屬于YjgF/YER057c/uK114家族蛋白成員。該家族蛋白多參與細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝，生理生化功能多樣，但功能背后的分子機(jī)制卻不明確[12]。而在微生物中，該類蛋白的功能也被多是基于其蛋白結(jié)構(gòu)與活性基團(tuán)的假設(shè)[13]，對(duì)于其誘導(dǎo)抗病機(jī)制還有待研究。

研究發(fā)現(xiàn)蛋白R(shí)hp-PSP不僅對(duì)TMV病毒粒子有直接抑制作用，且接種TMV前用Rhp-PSP處理過的煙草葉片，更能有效防控病毒的侵染，在100 μg/mL濃度下，Rhp-PSP對(duì)葉片的保護(hù)效果為76.5%[14]。因此，推測(cè)蛋白R(shí)hp-PSP能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對(duì)TMV的系統(tǒng)抗性，為進(jìn)一步驗(yàn)證猜想，本研究通過檢測(cè)煙草相關(guān)防御酶活性與丙二醛（MDA）含量變化、抗病相關(guān)基因的表達(dá)情況，初步篩選互作蛋白，旨在探討蛋白R(shí)hp-PSP誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的作用機(jī)理，希望能夠?yàn)楣夂霞?xì)菌應(yīng)用于生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株、質(zhì)粒：酵母菌株Saccharomyces cerevisiaeY2HGold、Y187、載體pGBKT7-53、pGBKT7-Lam和pGADT7-T均購(gòu)于CLONTECH公司；大腸桿菌E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)于擎科生物技術(shù)有限公司；載體pGADT7和pGBKT7均由湖南省植物保護(hù)研究所保存。

試劑及培養(yǎng)基：本氏煙cDNA文庫(kù)構(gòu)于上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；BamHI/NdeI限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒、熒光定量 PCR試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)于TAKARA公司；過氧化物酶（POD）測(cè)定試劑盒，多酚氧化酶（PPO）測(cè)試盒，苯丙氨酸解氨酶（PAL）測(cè)試盒，丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；LB液體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl、pH 7.0～7.5；LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加1.7%的瓊脂粉；酵母完全培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPDA）：2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、0.003%腺嘌呤、2%葡萄糖。

酵母篩選培養(yǎng)基（synthetic dropout，SD）、色氨酸缺陷型酵母培養(yǎng)基（SD/-Trp）、亮氨酸和色氨酸缺陷型酵母培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu）、色氨酸、亮氨酸和組氨酸缺陷型酵母培養(yǎng)基（SD/-Trp-His-Ade）和色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤缺陷型酵母培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）、X-α-gal，均購(gòu)于CLONTECH公司。

儀器：Milli-QA10純水機(jī)，法國(guó)Millipore公司；小型臺(tái)式離心機(jī)5415C，德國(guó)Eppendorf公司；水平電泳儀，國(guó)產(chǎn)；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化儀器設(shè)備廠；PCR儀，Eppendorf；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)AlphaInnotech公司；pHS-818精密型酸度計(jì)，貴陽學(xué)通儀器儀表有限公司；自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；賽福PRX450D智能人工氣候箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；-80℃超低溫冰箱，日本三洋公司；旋渦器，國(guó)產(chǎn)；搖床，國(guó)產(chǎn)；水浴鍋，國(guó)產(chǎn)；其它小型儀器，國(guó)產(chǎn)。

1.2 蛋白R(shí)hp-PSP的誘抗作用

1.2.1 蛋白 Rhp-PSP處理后煙草葉片中防御酶活性及抗病相關(guān)物質(zhì)含量 挑選健康的 5周齡本氏煙草植株，設(shè)置4個(gè)處理組，分別是清水對(duì)照、Rhp-PSP+TMV、蛋白R(shí)hp-PSP以及TMV，每個(gè)處理5株煙草，3次重復(fù)。蛋白處理方法噴施處理，將100 μg/mL的蛋白R(shí)hp-PSP對(duì)煙草進(jìn)行噴施處理，直至煙草葉片鋪滿細(xì)密的水滴，既不聚集也不流下，24 h后接種TMV病毒粒子。TMV接種方法為摩擦接種。分別于接種TMV后的第1、3、5和7 d時(shí)的煙草頂部葉片進(jìn)行取樣，檢測(cè)煙草葉片中過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL以及丙二醛MDA含量的變化。

1.2.2 蛋白R(shí)hp-PSP處理后煙草葉片中抗病相關(guān)基因的表達(dá)量 取健康的5周齡本氏煙草植株，蛋白處理以及TMV病毒粒子接種方法同1.2.1，本試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理組，噴施蛋白R(shí)hp-PSP后接種TMV（T1）、噴施清水后接種TMV（T2）和噴施清水后用清水摩擦接種（CK）。分別在TMV接種處理后第1、2、3、4 d收集葉片進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)處理5株，3次重復(fù)。

采用Trizol法[15]對(duì)煙草總RNA進(jìn)行提取，使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，以 cDNA產(chǎn)物為模板，Actin作為內(nèi)參基因，使用全式金生物技術(shù)有限公司的 qPCRmix試劑盒進(jìn)行基因表達(dá)量檢測(cè)?？剐曰蚣皟?nèi)參基因的引物序列見表1。qPCR 程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。通過 2-△△Ct法計(jì)算病程相關(guān)基因PR-1、PR-3、PR-5以及PDF1.2的相對(duì)表達(dá)量，其中△△Ct=（待測(cè)組目的基因Ct值－待測(cè)組內(nèi)參基因Ct值）－（對(duì)照組目的基因Ct值－對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值）。

表1 qPCR引物Table 1 The primers in qPCR

1.3 酵母雙雜交篩選互作蛋白

1.3.1 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)Rhp-PSP序列和pGBKT7載體序列設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物，其中上游引物帶 NdeI酶切位點(diǎn)（5'-TCAGAGGAGGACCTGCATATG GTTGAGCAGAAGCTCG-3'），下游引物帶BamHI酶切位點(diǎn)（5'-CGCTGCAGGTCGACGGATCCTCAGGCGACCTCGAAC-3'）；并以實(shí)驗(yàn)室前期工作中保存的PET28A-RhpPSP質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收目的片段；分別對(duì)PCR擴(kuò)增序列及pGBKT7載體進(jìn)行NdeI和BamHI的雙酶切，并膠回收線性化后的片段；T4 DNA連接酶構(gòu)建連接體系，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆并測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果正確的克隆菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取，即為誘餌載體pGBKT7-RhpPSP。

1.3.2 誘餌載體的自激活及毒性檢測(cè) 采用LiAc法[16]制備酵母菌株Y2HGold的感受態(tài)細(xì)胞，將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-RhpPSP與pGADT7空載體共轉(zhuǎn)化Y2HGold為自激活檢測(cè)組，以含有pGBKT7-53和pGADT7-T質(zhì)粒的酵母菌為陽性對(duì)照組，以含有pGBKT7-Lam和pGADT7-T質(zhì)粒的酵母菌為陰性對(duì)照組。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于SD/-Leu/-Trp、SD/-Trp-Leu-Ade-His、SD/-Trp-Leu-Ade-His/x-α-gal平板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落的顯色情況，確定誘餌蛋白是否具有自激活活性

將誘餌載體 pGBKT7-RhpPSP和對(duì)照空載體 pGBKT7分別轉(zhuǎn)化 Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞并涂布于SD/-Trp平板，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d后，觀察轉(zhuǎn)化誘餌載體和對(duì)照載體的轉(zhuǎn)化菌菌落大小以及生長(zhǎng)狀態(tài)，以判定誘餌蛋白是否對(duì)酵母菌株產(chǎn)生毒性。

1.3.3 酵母 cDNA文庫(kù)篩選 采用 Mating雜交法進(jìn)行酵母文庫(kù)篩選，具體參照 CLONTECH公司的Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作手冊(cè)。挑取新鮮培養(yǎng)的2～3 mm誘餌酵母菌落于50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)20 h。當(dāng)OD600達(dá)到0.8時(shí)，離心并棄去上清液，用5 mL SD/-Trp重懸，將5 mL含誘餌載體的Y2HGold菌液和1 mL Y187 cDNA文庫(kù)菌液加入含有45 mL 2×YPDA/Kan(50 ug/mL)液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床低速振蕩培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下(40×)觀察到二倍體接合型后離心，用10 mL 0.5×YPDA培養(yǎng)基重懸后涂布于直徑150 mm的SD/-Trp-Leu/ X-α-gal平板上，30 ℃避光培養(yǎng)5 d，隨后將平板上的藍(lán)色菌落轉(zhuǎn)移到SD/-Trp-Leu-Ade-His/ X-α-gal平板上，30 ℃避光培養(yǎng)10 d。

挑取上述平板中直徑超過2 mm的藍(lán)色單菌落，于SD/-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，提取酵母質(zhì)粒并以 pGADT7 載體通用引物（F：5'-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3'；R：5'-GTGAACTTG CGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3'）進(jìn)行 PCR鑒定文庫(kù)陽性克隆，分析插入片段的大小并排除重復(fù)克隆。

將符合要求的陽性克隆進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于 LB固體培養(yǎng)基上(含50 μg/mL Ampicillin)，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選單克隆擴(kuò)繁并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證；根據(jù)測(cè)序結(jié)果去除重復(fù)的克隆；再將篩選后的陽性克隆序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，初步獲得候選基因信息。

1.4 酵母雙雜交一對(duì)一驗(yàn)證

根據(jù)GenBank中同源基因的序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的特異性引物，并加入特定的酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增獲得對(duì)應(yīng)全長(zhǎng)基因序列后，將其插入 pGADT7載體中構(gòu)建重組子。重組子分別與質(zhì)粒 pGBKT7和 pGBKT7-RhpPSP共轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布SD/-Leu/-Trp平板，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑取平板上生長(zhǎng)的單克隆菌落溶于20 μL ddH2O中，即為初始菌液濃度，按4個(gè)濃度梯度(10-1，10-2，10-3和 10-4)對(duì)初始菌液進(jìn)行稀釋，接種于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板，以含有 pGBKT7-53和pGADT7-T質(zhì)粒的酵母菌為陽性對(duì)照組，以含有pGBKT7-Lam和pGADT7-T質(zhì)粒的酵母菌為陰性對(duì)照組，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白R(shí)hp-PSP的誘抗作用

2.1.1 蛋白R(shí)hp-PSP處理后煙草葉片中防御酶活性及抗病相關(guān)物質(zhì)含量變化 通過檢測(cè)蛋白R(shí)hp-PSP處理后煙草防御酶活性變化，試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過Rhp-PSP處理后接種TMV的3種防御酶活性（PPO、POD、PAL）都普遍高于其他處理組，且PAL與POD的酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，分別在5和7 d時(shí)達(dá)到酶活性最大值。與只接種 TMV組相比，Rhp-PSP+TMV組 PAL與 POD的酶活性分別提高 37.79%和54.50%，PPO酶活性則持續(xù)升高，第9 d時(shí)可高達(dá)62.84 U/mg。在MDA含量檢測(cè)結(jié)果中，Rhp-PSP+TMV處理組中的MDA含量呈現(xiàn)先降低再升高，后又降低的趨勢(shì)，而只接種TMV組的MDA含量則隨時(shí)間持續(xù)上升（圖1）。

圖1 蛋白R(shí)hp-PSP處理對(duì)煙草葉片防御酶活性及MDA含量的影響Fig. 1 Dynamic curve of protective enzyme activities and content of MDA after Rhp-PSP treatment in tobacco

2.1.2 蛋白R(shí)hp-PSP處理后煙草葉片中抗病基因表達(dá)量檢測(cè) 通過qPCR方法對(duì)蛋白處理后煙草中抗性基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示，抗性基因PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2在蛋白R(shí)hp-PSP處理后的煙草中，表達(dá)量明顯上調(diào)，在3 d表達(dá)量達(dá)到最高值，分別為空白對(duì)照組的4.9、3.9、8.6和7.7倍，接種TMV組的3.7、2.2、4.3和4.7倍（圖2）。

圖2 抗性基因PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2的相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 Relative expression levels of PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2

2.2 酵母雙雜交篩選互作蛋白

2.2.1 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建 經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的Rhp-PSP序列，通過NdeI/BamHI雙酶切，將Rhp-PSP構(gòu)建至誘餌載體pGBKT7上獲得重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒pGBKT7-RhpPSP進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖3A）和雙酶切驗(yàn)證（圖 3B），結(jié)果與預(yù)測(cè)值相同。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果和目的基因序列一致，說明已成功構(gòu)建了酵母誘餌質(zhì)粒pGBKT7-RhpPSP。

圖3 重組誘餌載體pGBKT7-RhpPSP的PCR驗(yàn)證（A）及雙酶切驗(yàn)證（B）Fig. 3 Dentification of the recombinants of pGBKT7-RhpPSP by PCR (A) and double enzyme digestion (B)

2.2.2 誘餌載體的自激活檢測(cè)及毒性檢測(cè) 將自激活檢測(cè)組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)化到 Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞后，在SD/-Leu/-Trp、SD/-Trp-Leu-Ade-His、SD/-Trp-Leu-Ade-His/x-α-gal平板上培養(yǎng)5 d結(jié)果表明，三組均能在 SD/-Leu/-Trp平板上正常生長(zhǎng)（圖 4A），說明質(zhì)粒已共轉(zhuǎn)化到酵母菌株中。在SD/-Trp-Leu-Ade-His培養(yǎng)基上，自激活檢測(cè)組同陰性對(duì)照組一樣無法生長(zhǎng)（圖4B），并且在加了X-α-Gal的平板上只有陽性對(duì)照組變藍(lán)色（圖4C），表明所構(gòu)建的酵母誘餌載體報(bào)告基因沒有自激活活性。因此，構(gòu)建的誘餌表達(dá)載體pGBKT7-RhpPSP可以用于后續(xù)酵母雙雜交的篩選試驗(yàn)。

圖4 重組誘餌載體pGBKT7-RhpPSP的自激活檢測(cè)Fig. 4 Self-activating detection of the recombinants of pGBKT7-RhpPSP

在SD/-Trp平板上可觀察到誘餌質(zhì)粒的酵母菌同對(duì)照相比，兩者在菌落生長(zhǎng)速度、大小、形態(tài)以及數(shù)目上并沒有明顯的差異（圖5）。結(jié)果表明，誘餌載體pGBKT7-RhpPSP對(duì)酵母菌株Y2HGold沒有毒性。

圖5 重組誘餌載體pGBKT7-RhpPSP對(duì)酵母菌株Y2HGold的毒性檢測(cè)Fig. 5 Analysis of toxicity of pGBKT7-RhpPSP to yeast strain Y2HGold

2.2.3 酵母雙雜交篩選互作蛋白 以pGBKT7-RhpPSP為誘餌篩選煙草cDNA文庫(kù)，統(tǒng)計(jì)SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上共有51個(gè)藍(lán)色陽性菌落，利用PCR鑒定cDNA文庫(kù)插入片段的大小，舍棄500 bp以下的小片段，其余的陽性酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，并進(jìn)行測(cè)序分析。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，去除重復(fù)序列，最終獲得了11個(gè)與Rhp-PSP互作的蛋白（表2）。

表2 與 Rhp-PSP 相互作用蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析Table 2 Bioinformatics analysis of proteins interacting with Rhp-PSP

2.3 酵母一對(duì)一驗(yàn)證結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證相互作用，避免假陽性情況，構(gòu)建誘餌載體 pGADT7-CP2410A、pGADT7-Cab10b、pGADT7-protein40、pGADT7-Cab10A、pGADT7-cab91R、pGADT7-protein7、pGADT7-Lhcb1、pGADT7-CAB7、pGADT7-GPI、pGADT7-HCF136、pGADT7-VAN3，與質(zhì)粒pGBKT7和pGBKT7-RhpPSP共轉(zhuǎn)化酵母菌 Y2HGold。結(jié)果顯示，陽性對(duì)照（pGBKT7-53+pGADT7-T）正常生長(zhǎng)，而陰性對(duì)照（pGBKT7-Lam+pGADT7-T）及11個(gè)誘餌質(zhì)粒與pGBKT7共轉(zhuǎn)化的單克隆菌株在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上均不能正常生長(zhǎng)，說明所驗(yàn)證的誘餌載體均無自激活活性。pGADT7-Cab10A、pGADT7-GPI、pGADT7-VAN3誘餌載體與pGBKT7-RhpPSP共轉(zhuǎn)化在4個(gè)不同濃度上均能長(zhǎng)出白色菌落（圖6）。由上述結(jié)果可知，篩選出的同源蛋白中GPI錨定蛋白、VAN3結(jié)合蛋白及葉綠素結(jié)合蛋白A與Rhp-PSP具有相互作用。

圖6 蛋白互作驗(yàn)證Fig. 6 Verify protein interactions

3 討論

抗性誘導(dǎo)是生物防治的途徑之一，并作為一種防治農(nóng)作物病害有效的方法被廣泛研究[17]。蛋白是一種能介導(dǎo)植物獲得系統(tǒng)抗性的物質(zhì)。如Liang等[18]報(bào)道了大葉黃萎病菌的PevD1蛋白與Nbnrp1蛋白互作誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，郭景紅等[19]表明玫瑰黃鏈霉菌產(chǎn)生的誘抗粗蛋白能夠誘導(dǎo)黃瓜抗病性的提升。付強(qiáng)等[20]以枯斑三生煙和普通煙為試驗(yàn)對(duì)象，采用半葉枯斑法以及田間試驗(yàn)，表明超敏蛋白不僅明顯提高了煙草的抗性，還能有效促進(jìn)煙株生長(zhǎng)。

本研究通過蛋白R(shí)hp-PSP誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白R(shí)hp-PSP提高了煙草葉片防御酶的活性和抗病相關(guān)基因的表達(dá)，其中POD、PPO、PAL活性與植物抗病性密切相關(guān)[21]，PR-1、PR-3、PR-5在水楊酸（SA）信號(hào)通路中起重要作用，PDF1.2是茉莉酸/乙烯（JA-ET）信號(hào)通路的標(biāo)志基因[22]，并降低了MDA的含量，MDA作為膜脂過氧化作用的指標(biāo)，MDA的含量低，膜受損程度越小，相反則越大。綜上所述，蛋白R(shí)hp-PSP可誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對(duì)TMV的抗病性。為進(jìn)一步探討誘抗機(jī)理，我們對(duì)Rhp-PSP與煙草之間的互作情況進(jìn)行探究。選用酵母雙雜交方法篩選互作蛋白，確認(rèn)pGBKT7-RhpPSP誘餌載體無自激活活性及無毒性后，用Mating法進(jìn)行互作蛋白篩選。結(jié)果初步篩選到11個(gè)蛋白，通過酵母雙雜交一對(duì)一進(jìn)一步驗(yàn)證了葉綠素結(jié)合蛋白A、GPI錨定蛋白、VAN3結(jié)合蛋白與Rhp-PSP的互作。

葉綠素結(jié)合蛋白與植物的光合作用密切相關(guān)；Van3結(jié)合蛋白根據(jù)UniProt提供的GO功能注釋分析為葉維管束、韌皮部或木質(zhì)部組織發(fā)生相關(guān)蛋白；GPI錨定蛋白是一種在真核生物細(xì)胞膜表面普遍存在的蛋白質(zhì)，最大特點(diǎn)是沒有跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)，通過翻譯后修飾產(chǎn)生的GPI結(jié)構(gòu)錨定在細(xì)胞膜上[23]。GPI錨定蛋白這類細(xì)胞表面受體研究較少，現(xiàn)在普遍認(rèn)為，它們涉及細(xì)胞識(shí)別、生長(zhǎng)、分化和程序性死亡等重要的生命過程[24]。Shen等[25]的研究表明GPI錨定蛋白與擬南芥FLS2關(guān)聯(lián)，通過調(diào)節(jié)FLS2的積累和信號(hào)傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)植物免疫。Yu等[26]的研究揭示了植物多肽RALF被CrRLK1L型受體激酶與GPI錨定蛋白復(fù)合物識(shí)別，表明GPI蛋白可作為受體直接識(shí)別配體，介導(dǎo)植物細(xì)胞膜內(nèi)外信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Li等[27]的研究表明GPI蛋白參與多種類受體激酶的轉(zhuǎn)運(yùn)及其質(zhì)膜定位，并作為這些激酶的共受體感知外部信號(hào)。這一系列的研究結(jié)果表明，GPI錨定蛋白在植物信號(hào)識(shí)別與傳導(dǎo)過程中具有重要作用。但還未見GPI錨定蛋白參與對(duì)TMV系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)的報(bào)道。

本研究下一步將重點(diǎn)對(duì)GPI錨定蛋白進(jìn)行體內(nèi)和體外互作的進(jìn)一步驗(yàn)證，明確其誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的通路以及其中的互作進(jìn)程。本研究對(duì)深入了解沼澤紅假單胞菌Rhp-PSP的基因功能及其參與的誘導(dǎo)抗性機(jī)制研究有重要意義。