外泌體miRNA在卵巢早衰中的研究進展*

周凡茹 宋玙璠 張 楚 劉 霞 李 凡 胡茹楠 黃燕靖 張明敏

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院1中西醫(yī)結(jié)合研究所，2中醫(yī)科，武漢 430030

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指各種原因?qū)е碌呐?0歲以前卵巢功能病理性下降，并伴有閉經(jīng)、性腺功能減退和不孕癥等疾病，嚴重影響女性生殖健康。據(jù)統(tǒng)計[1]，POF在30歲以下女性中的發(fā)病率約為0.1%，在40歲以下女性中的發(fā)病率為1%，其病因包括染色體異常、自身免疫因素、環(huán)境因素、心理因素和醫(yī)源性因素等。目前治療POF的方法主要包括激素治療、卵母細胞和胚胎冷凍保存、卵巢組織移植和干細胞移植等，然而這些治療方法往往存在不同程度的治療局限性、操作侵襲性、質(zhì)量不可控性，甚至可能產(chǎn)生同種異體移植的免疫反應，并且常常涉及倫理問題等[2]。外泌體為細胞產(chǎn)生的直徑在30～100 nm的囊泡，是細胞間信號傳遞及藥物治療的載體，在腫瘤、免疫、心血管等領(lǐng)域已有深入研究，但在卵巢疾病尤其是POF方面的研究目前仍較為有限。微小RNA(microRNA，miRNA)是外泌體攜帶的主要功能因子，其在卵巢早衰的發(fā)生及治療中具有重要意義。鑒于此，本文總結(jié)了目前外泌體miRNA在POF治療中的研究現(xiàn)狀，以期為POF的治療提供新的思路和方法。

1 外泌體的形成與作用

1.1 外泌體的形成

在最近幾年的研究中，出現(xiàn)了新的細胞間相互通信的機制，即細胞外囊泡。細胞外囊泡是通過細胞脂質(zhì)雙層向內(nèi)萌芽收縮，形成細胞內(nèi)的多囊泡體，與細胞膜結(jié)合以鈣依賴性方式釋放到細胞外環(huán)境中形成的納米級囊泡[3]。細胞能夠產(chǎn)生和釋放不同類型的囊泡，例如微泡、外泌體、凋亡小體和外在體，它們的大小、生物發(fā)生和表面標志物都不同[4]。外泌體是細胞間通信的重要介質(zhì)，攜帶多種生物活性細胞因子，包括生長因子、脂質(zhì)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)和miRNA等[5-6]。幾乎所有的細胞均能夠產(chǎn)生外泌體，并且在體液中也有大量存在，例如血液、唾液、尿液、母乳、羊水中，還可從腹腔積液、卵泡液中分離得出[7]。不同細胞來源的外泌體所含RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)均有所差異，功能也不盡相同[8]。

1.2 外泌體的作用

外泌體在細胞間發(fā)揮重要的通信作用[9]，并具有多種屬性，例如轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)、非水溶性分子等，并具有膜穿透能力、載藥能力和長循環(huán)半衰期等[10]?；谕饷隗w產(chǎn)生細胞的生理環(huán)境變化，外泌體的數(shù)量及特征亦可發(fā)生變化[11]。這些特性給外泌體的應用帶來了一定的穩(wěn)定性及可變性，一方面外泌體能夠繼承其產(chǎn)生細胞的一定生物學特征；另一方面，根據(jù)所產(chǎn)生細胞的環(huán)境變化，外泌體攜帶的生物學特性也會發(fā)生部分改變。此外，有研究表明，外泌體具有較長的循環(huán)半衰期，無免疫原性[12]，具有較高溶解度和生物利用度[13]，能夠耐受低pH值[14]和高溫環(huán)境，這些屬性對于將外泌體用作藥物輸送載體是十分重要的。

外泌體在正常生理狀態(tài)下廣泛參與組織再生、免疫監(jiān)視、血液循環(huán)和干細胞重塑等過程[15]，并且在疾病發(fā)病機理中也具有關(guān)鍵作用。外泌體復雜的生物發(fā)生及生物學特征反映了親代細胞內(nèi)部的分子加工過程，最適合用作體液中該親代細胞的潛在替代物[16]，因此廣泛用于臨床診斷和治療開發(fā)。

目前的研究[17-18]結(jié)果顯示，外泌體主要通過3種可能機制參與細胞通信并發(fā)揮作用：第一，外泌體的膜蛋白可以與靶細胞中的受體相互作用并激活細胞內(nèi)信號傳導；第二，外泌體膜蛋白的裂解片段可以作為配體，與靶細胞表面受體結(jié)合，從而激活靶細胞內(nèi)的信號級聯(lián)；第三，外泌體與靶細胞膜融合，以非選擇性方式釋放其內(nèi)含物，從而導致信號傳導的激活。

1.3 外泌體miRNA的作用

在外泌體運載的生物分子中，miRNA的作用受到越來越多的關(guān)注，miRNA是長度約為20～24個核苷酸的非編碼RNA，這些小分子與靶標mRNA結(jié)合，可以導致翻譯的抑制和/或mRNA降解，異常的miRNA表達與多種人類疾病有關(guān)，例如癌癥、心血管疾病、炎性疾病和婦科疾病[19]。生殖系統(tǒng)中miRNA的表達水平與女性的生育能力以及胚胎發(fā)育能力密切相關(guān)[20]。miRNA通過轉(zhuǎn)錄抑制或降解來調(diào)控基因表達，在卵母細胞成熟和卵泡形成過程中發(fā)揮重要作用[21]。

2 外泌體miRNA對卵巢早衰不同環(huán)節(jié)的調(diào)控

卵巢卵泡是一個由內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌信號精密調(diào)控的相對獨立單位，卵巢卵泡的生長和成熟過程涉及廣泛的細胞間通信，包括體細胞(卵泡膜細胞、顆粒細胞、卵丘細胞)間、體細胞與卵母細胞間。研究者[22]對卵泡中的主要成分卵泡液進行研究分析，發(fā)現(xiàn)其富含多種來源的外泌體，并且在介導哺乳動物卵泡內(nèi)的細胞通信中起著前所未有的作用。

2.1 外泌體miRNA與顆粒細胞功能

顆粒細胞是卵泡主要的細胞類型，它們支持卵泡的形成和發(fā)育，并具有分泌促性腺激素以維持卵巢功能的作用，是維持卵泡正常發(fā)育的關(guān)鍵。卵泡閉鎖是POF的一個重要特征，主要是由卵泡細胞的凋亡，尤其是顆粒細胞的凋亡引起的[23]。

多個研究結(jié)果表明，外泌體可以通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)途徑來改善卵巢功能。Yang等[24]通過對骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)來源的外泌體進行研究發(fā)現(xiàn)，其攜帶的miR-144-5p能夠靶向抑制第10號染色體同源缺失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)，從而上調(diào)PI3K/AKT通路來促進化療后的卵巢卵泡恢復。Santonocito等[25]研究也顯示，在卵泡液來源的外泌體中，高表達的miR132、miR212、miR214能夠靶向PTEN沉默，從而激活AKT打開PI3K信號傳導途徑。

Huang等[26]研究結(jié)果顯示人脂肪間充質(zhì)干細胞(human adipose mesenchymal stem cells，HAMSCs)來源的外泌體可通過激活SMAD通路來抑制Fas/FasL、caspase-3和caspase-8的表達，并且可以在體內(nèi)和體外增加SMAD2、SMAD3和SMAD5的mRNA和蛋白質(zhì)表達，從而促進顆粒細胞的增殖并抑制其凋亡，改善卵巢功能不全小鼠的卵巢功能。

在一項順鉑誘導POF的實驗[27]中發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs)來源的外泌體可顯著上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調(diào)凋亡蛋白c-caspase-3的表達，表明HUMSCs來源的外泌體對順鉑誘導的卵巢顆粒細胞凋亡亦具有保護作用。該研究者還對HUMSCs來源的外泌體攜帶的miRNA進行了實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)陣列分析，并預測miRNA-24、miRNA-106a、miRNA-19b和miRNA-25可能與細胞凋亡密切相關(guān)。在另一項研究中，Sang等[28]鑒定出存在于微泡和人卵泡液上清液中的miRNA-24能調(diào)節(jié)雌二醇濃度和孕酮濃度，這表明高表達的miRNA-24可靶向于生殖、內(nèi)分泌和代謝過程中相關(guān)基因。外泌體對于卵巢顆粒細胞類固醇合成的調(diào)節(jié)作用在Vashisht等[29]研究中也有印證，其結(jié)果表明從姜黃素處理過的顆粒細胞培養(yǎng)基中提取的外泌體能夠阻止水牛顆粒細胞中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)抑制的Cyp19A1表達和17β-雌二醇生成。

基于上述研究，我們發(fā)現(xiàn)外泌體對于卵巢顆粒細胞的調(diào)控主要表現(xiàn)在兩個方面，即顆粒細胞自身的增殖凋亡和顆粒細胞的類固醇合成功能。其調(diào)控的差異可能受到外泌體來源的影響，并根據(jù)其攜帶的不同miRNA而產(chǎn)生不同的調(diào)控作用。

2.2 外泌體miRNA與卵巢血管形成

血管形成是女性生殖系統(tǒng)正常運作和成功實現(xiàn)妊娠的重要過程[30]。卵巢功能取決于復雜血管系統(tǒng)的建立和持續(xù)重塑，正常的血管網(wǎng)絡(luò)是供給卵泡和黃體充足氧氣、營養(yǎng)和激素的必要條件[31]，因此，血管形成對于卵泡發(fā)育、優(yōu)勢化及排卵至關(guān)重要。

血管生成是涉及血管形成細胞與細胞外環(huán)境之間相互作用的復雜生物過程，而miRNA是內(nèi)皮細胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，尤其是血管生成的重要調(diào)節(jié)劑[32]。目前，外泌體對于血管形成相關(guān)調(diào)控機制已有深入研究。在一項將人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)進行體外培養(yǎng)的實驗中，Gong等[33]驗證了間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)的條件培養(yǎng)基具有促血管生成能力，并發(fā)現(xiàn)MSC衍生的外泌體能夠攜帶各種促血管生成相關(guān)的miRNA，并將這些miRNA轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮細胞，從而促進血管生成；外泌體攜帶的miR-30b可能通過抑制DLL4表達，從而在MSC介導的血管生成中起重要作用。類似的結(jié)果在Liang等[34]的研究中也被發(fā)現(xiàn)，他們的研究結(jié)果表明，HAMSCs來源的外泌體在體外和體內(nèi)均可增強內(nèi)皮細胞血管形成，其富含的miR-125a可轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞中，并通過直接抑制DLL4來促進尖端細胞的特異性。此外，Zhang等[35]在對人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells，HAECs)來源的外泌體進行研究發(fā)現(xiàn)，其能夠抑制化療誘導POF模型中的急性血管損傷，從而保護卵巢血管免受損害。

外泌體對于血管形成的調(diào)控作用還可能會受到外泌體產(chǎn)生環(huán)境的影響。Wang等[36]研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病模型心肌細胞的外泌體和健康心肌細胞的外泌體均包含促血管生成的miR-126和抗血管生成的miR-320，但其中包含的miRNA數(shù)量卻有所不同，健康心肌細胞組的外泌體比2型糖尿病模型組的外泌體具有更高水平的miR-126和更低水平的miR-320，這可能部分導致了2組中完全相反的血管形成作用。這個結(jié)果提示，外泌體miRNA/蛋白質(zhì)的組成可以是動態(tài)變化的，并取決于細胞/組織的生理/病理狀況。

2.3 外泌體miRNA與卵巢微環(huán)境

氧化應激是引起細胞衰老的主要原因之一，暴露于有毒物質(zhì)和電離輻射均可導致氧化應激的發(fā)生[37-38]。氧化應激在POF發(fā)病機理中的作用雖未得到深入研究，但已有結(jié)果[39]顯示卵巢氧化應激是原始卵泡加速衰竭的原因。

研究[40]表明，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)作為氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，在保護生物體免受各種氧化劑及有毒物質(zhì)損傷中起著重要作用。Kahroba等[41]發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶的Nrf2及其介導產(chǎn)物可調(diào)節(jié)靶細胞抗氧化水平，從而誘導組織修復和再生。在一項用過氧化氫培養(yǎng)顆粒細胞誘導氧化應激實驗中，Saeed-Zidane等[42]發(fā)現(xiàn)顆粒細胞來源的外泌體含有Nrf2 mRNA，該mRNA可激活其他細胞特別是卵母細胞中的抗氧化信號通路，從而抵抗氧化應激環(huán)境。此外，人類胚胎干細胞(human embryonic stem cell，HESCs)衍生的外泌體能夠恢復內(nèi)皮細胞的衰老及其增殖遷移和血管形成能力，這種機制可能是通過miR-200a在HESCs衍生的外泌體中高度富集，并下調(diào)負調(diào)控Nrf2表達的Keap1，從而在其介導的血管再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[43]。

Ding等[44-45]研究揭示了HAECs來源的外泌體miR-320a和HUMSCs來源的外泌體miRNA-17-5p，分別能夠靶向下調(diào)SIRT4和SIRT7及下游相關(guān)基因表達水平，從而降低卵巢內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)積累，減少細胞凋亡并抑制細胞衰老的發(fā)生。靶向ROS產(chǎn)生和誘導抗氧化反應是克服衰老的前景治療策略，外泌體miRNA在其中的作用仍有很多未知途徑，仍待進一步研究證實。

3 研究展望

迄今為止，外泌體在生殖系統(tǒng)疾病中的研究越來越受到重視，外泌體miRNA作為細胞間信號傳遞的重要物質(zhì)及潛在治療靶點，對卵巢顆粒細胞、血管形成和抗氧化微環(huán)境調(diào)節(jié)具有重要作用。經(jīng)過文獻綜述發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA的作用主要表現(xiàn)在兩個方面：一方面，正常組織中不同來源的外泌體miRNA可以直接發(fā)揮功能特異的調(diào)控作用；另一方面，藥物干預能夠改變外泌體miRNA的數(shù)量和特性，從而改變其功能，這也是外泌體作為藥物載體的一項重要應用。在未來的研究中，仍需進一步深入探討靶向外泌體miRNA治療的開發(fā)和應用，以期為卵巢早衰治療提供更安全有效的方法。