脂肪干細(xì)胞來源外泌體在皮膚創(chuàng)面修復(fù)中的作用機制

姜文彬 陳靂風(fēng) 孫家明

【提要】 皮膚創(chuàng)面修復(fù)有多種方法，但均存在一定的局限性。近年來，有關(guān)脂肪干細(xì)胞來源外泌體的研究日益增多，大量研究表明脂肪干細(xì)胞來源外泌體在皮膚創(chuàng)面修復(fù)過程中具有積極的作用。本文對脂肪干細(xì)胞來源外泌體在皮膚創(chuàng)面修復(fù)中的作用機制研究進(jìn)行綜述，并展望其在皮膚組織再生領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

皮膚創(chuàng)面愈合，尤其是皮膚慢性傷口愈合是所有皮膚疾病中醫(yī)療費用最高的一類，僅在美國，每年就有281 億美元以上的醫(yī)療支出用于治療慢性創(chuàng)面［1］。盡管皮膚組織具有一定的自我修復(fù)能力［2］，但創(chuàng)面愈合不良，尤其是暴露部位的創(chuàng)面愈合不良，仍可導(dǎo)致皮膚屏障功能減弱、組織感染和壞死等嚴(yán)重后果。臨床上迫切需要更新、更有效的方法來促進(jìn)愈合過程，以達(dá)到形態(tài)和功能上的最佳效果。外泌體是指由干細(xì)胞分泌的具有單層膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡，直徑30～200 nm。根據(jù)目前的研究，外泌體具有與細(xì)胞相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其中包含了復(fù)雜的RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體除了可以在免疫學(xué)、腫瘤生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)中作為生物標(biāo)志物［3］、生物載體［4］和治療工具［5］外，在組織再生方面也具有潛在的臨床應(yīng)用價值。脂肪干細(xì)胞具有來源廣泛、取材方便等優(yōu)點，該來源的外泌體在多種組織的修復(fù)和再生方面具有治療潛力［6］，其中也促進(jìn)皮膚組織創(chuàng)面的愈合［7］。

1 脂肪干細(xì)胞外泌體

脂肪干細(xì)胞（Adipose－ derived stem cells，ADSCs）在人體內(nèi)儲量豐富，應(yīng)用脂肪抽吸術(shù)可以很容易地從皮下脂肪組織中獲得ADSCs［8］。ADSCs具有強大的增殖分化能力、多向分化能力，且獲取便利、創(chuàng)傷小、副作用少，常用于組織再生與修復(fù)，是組織工程領(lǐng)域的研究熱點。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs 發(fā)揮作用主要依賴于旁分泌機制，通過向胞外分泌大量物質(zhì)來實現(xiàn)，如可溶性細(xì)胞因子、生長因子、功能蛋白、脂質(zhì)、microRNAs、lncRNAs 等［9－11］。

外泌體（Exosomes，Exos）是包含了復(fù)雜RNA 和蛋白質(zhì)的微小囊泡，直徑為30～200 nm，主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體，它是由溶酶體微粒向內(nèi)凹陷形成多泡體，而后多泡體與細(xì)胞膜融合，將其內(nèi)的微小囊泡分泌到胞外而形成。研究發(fā)現(xiàn)，Exos 可廣泛參與細(xì)胞間的信息交流及多種生理、病理過程，如機體免疫應(yīng)答、抗原呈遞、細(xì)胞分化等。Exos 的免疫原性低于細(xì)胞，可有效降低由細(xì)胞移植導(dǎo)致的免疫排斥；而且，Exos 與干細(xì)胞不同，在使用上不存在倫理學(xué)問題，這使其可代替干細(xì)胞進(jìn)入臨床應(yīng)用。根據(jù)目前的研究，ADSCs－Exos 在皮膚創(chuàng)面愈合［12］、骨與軟骨再生［13］、受損神經(jīng)修復(fù)及心肌損傷修復(fù)［14］、腎臟損傷修復(fù)［15］、肝臟損傷修復(fù)［16］等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

1.1 ADSCs－Exos 的分離純化

方便快捷的分離純化法，是標(biāo)準(zhǔn)和高效地進(jìn)行ADSCs－Exos 研究的保障。目前，分離純化ADSCs－Exos 最常用的方法是差速離心法，利用外泌體與其他物質(zhì)間直徑大小以及密度的差異，通過一系列不同離心力、不同離心時長的超速離心［17］逐步將其他物質(zhì)沉淀后去除，最終分離出外泌體。超速離心通常由多個步驟組成，首先低離心力（300 ×g，10 min）去除死亡細(xì)胞和凋亡碎片，然后提高離心力［（1 000～20 000）×g，20～30 min］去除較大的囊泡和碎片，最后以高離心力（100 000 ×g，70 min）獲得ADSCs－Exos［18］。此方法操作簡便，得到的外泌體量多，但是提取時間長，且提取的外泌體純度不足［19］。

免疫磁珠法也是常用的ADSCs－Exos 分離方法。外泌體膜上存在著多種特異性蛋白，利用抗體與外泌體膜上的特異性蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)，經(jīng)沉淀可分離外泌體。免疫磁珠吸附分離耗時短，外泌體純度高，但分離前需進(jìn)行充分的預(yù)處理，以去除其他的細(xì)胞外囊泡，否則將影響外泌體的純度。

近年來，一些新方法被用于ADSCs－Exos 的分離和純化，如微流控技術(shù)、尺寸排阻色譜技術(shù)、靜水壓濾透析技術(shù)以及超濾技術(shù)等。每種方法都有其優(yōu)缺點，目前還沒有統(tǒng)一的規(guī)范，應(yīng)根據(jù)實驗科學(xué)背景及后續(xù)實驗內(nèi)容選擇合適的分離純化方法［20］。

1.2 ADSCs－Exos 的鑒定與儲存

脂肪干細(xì)胞來源外泌體鑒定的常用方法有形態(tài)學(xué)分析、特異性蛋白表達(dá)。電子顯微鏡下觀察ADSCs－Exos，可見膜的茶托樣結(jié)構(gòu)，直徑30～200 nm；利用Western blot 或抗體芯片對ADSCs－Exos 表面特定蛋白進(jìn)行檢測，其表面蛋白陽性表達(dá)的有FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、ANXA5、TSG101 等。

外泌體通常儲存于－80 ℃環(huán)境下。但最近的報道表明，與新鮮提取的外泌體相比，在－80 ℃條件下長期保存的外泌體并不穩(wěn)定，有可能導(dǎo)致其內(nèi)部RNA 的降解。Charoenviriyakul 等［21］開發(fā)了一種凍干儲存外泌體的方法，在室溫下儲存凍干外泌體，既不會影響外泌體RNA 含量、理化和藥代動力學(xué)特性，也不會影響外泌體上蛋白質(zhì)和DNA 的功能。

2 皮膚組織的結(jié)構(gòu)與皮膚創(chuàng)面愈合的過程

2.1 皮膚組織的結(jié)構(gòu)

皮膚是在人體表面直接同外部環(huán)境接觸的組織，具有保護、分泌、調(diào)節(jié)體溫等重要作用。皮膚分3 層，最外層的表皮主要由復(fù)層扁平上皮組成，由淺到深又可細(xì)分為角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘細(xì)胞層、基底層等5 層；中間的真皮層主要由膠原纖維、彈力纖維構(gòu)成，內(nèi)含豐富的血管、神經(jīng)末梢、毛囊和各種腺體，由淺到深可細(xì)分為乳頭層和網(wǎng)狀層；最深處的皮下組織，位于真皮以下肌肉筋膜以上，是維持皮膚彈性的重要結(jié)構(gòu)，主要成分為脂肪組織［22］。

2.2 皮膚創(chuàng)面愈合的過程

皮膚創(chuàng)傷是由于疾病或外部暴力而導(dǎo)致的表皮、黏膜或組織破損。皮膚具有自我修復(fù)能力，皮膚創(chuàng)面的愈合由一系列復(fù)雜而動態(tài)的組織恢復(fù)階段組成，常需要免疫細(xì)胞、造血細(xì)胞和皮膚常駐細(xì)胞的共同參與［23］。深達(dá)真皮的皮膚創(chuàng)面修復(fù)包括4 個相互重疊的階段，分別為止血、炎癥、增殖和重塑，每個階段又有精密調(diào)節(jié)的多個子階段。各個階段間相互依賴，密不可分。

第一階段是止血階段，這是機體對創(chuàng)傷的迅速反應(yīng)。在這個階段，血小板和纖維蛋白原的聚集會導(dǎo)致血凝塊的形成，暫時封閉傷口［24］，有的凝塊表面干燥形成痂皮，凝塊及痂皮可起到保護傷口的作用。第二階段是炎癥階段，皮膚創(chuàng)面形成后數(shù)小時內(nèi)便出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為局部充血、漿液性滲出及白細(xì)胞游出，故導(dǎo)致創(chuàng)面局部紅腫。早期白細(xì)胞浸潤以嗜中性粒細(xì)胞為主，約3 d 后轉(zhuǎn)為以巨噬細(xì)胞為主。血小板釋放的細(xì)胞因子將中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集到創(chuàng)傷部位，和常駐的肥大細(xì)胞一起，開始?xì)缛肭值奈⑸?，并清除?chuàng)傷部位的細(xì)胞碎片［25］。第三階段是增殖階段，由白細(xì)胞釋放的激素誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞向傷口中心遷移，形成新的血管和肉芽組織。肉芽組織由傷口底部及傷口邊緣長出，以填平缺損組織，其中沒有神經(jīng)，故無感覺。毛細(xì)血管以0.1～0.6 mm／d 的速度增長，生長方向大都垂直于創(chuàng)面，并呈袢狀彎曲。從傷后第5～6 天起，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維，其后的1 周內(nèi)膠原纖維形成更為活躍，以后生成速度逐漸減緩。隨著膠原纖維的增多，瘢痕形成，可能是由于局部張力的作用，瘢痕中的膠原纖維最終與皮膚表面平行。同時，創(chuàng)面周圍的成纖維細(xì)胞也可以進(jìn)一步刺激傷口邊緣角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖，使新表皮完全覆蓋傷口。第四階段是重塑階段，為了恢復(fù)正常皮膚的結(jié)構(gòu)，瘢痕重塑，新沉積的膠原分子交聯(lián)，導(dǎo)致組織的拉伸強度增加［26］，在此過程中膠原纖維不斷合成、交聯(lián)和降解，這一階段可長達(dá)數(shù)月至數(shù)年［27］。

3 ADSCs－Exos 促皮膚創(chuàng)面修復(fù)的機制

皮膚創(chuàng)面愈合是機體動態(tài)、精密的生理反應(yīng)過程。內(nèi)源性ADSCs 已被證明參與了皮膚創(chuàng)面的愈合過程，其分泌的Exos 也被證實在減輕炎癥反應(yīng)、加速血管生成、促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖與遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的重塑中發(fā)揮著不可替代的作用。

3.1 ADSCs－Exos 可通過多種機制減輕炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)是創(chuàng)面修復(fù)的始動環(huán)節(jié)之一，但過度的炎癥反應(yīng)會延緩皮膚創(chuàng)面的愈合過程，并可能使創(chuàng)面發(fā)展為經(jīng)久不愈的慢性創(chuàng)面，故減輕傷口愈合的炎性反應(yīng)是皮膚創(chuàng)面修復(fù)中的重要一環(huán)。炎癥反應(yīng)階段是以血管系統(tǒng)為中心的一系列局部反應(yīng)，由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等共同參與，炎性反應(yīng)階段可清除壞死組織及入侵細(xì)菌，促進(jìn)愈合過程。研究發(fā)現(xiàn)，減少創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，可以減少瘢痕的生成。例如，早期胎兒和口腔傷口的無瘢痕愈合過程，是缺乏典型的炎癥反應(yīng)的創(chuàng)面愈合［28］，這類過程與傷口炎癥反應(yīng)下游的轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF－β1）有關(guān)［29］。外泌體減輕炎癥反應(yīng)的機制多種多樣，如介導(dǎo)siRNA 傳遞來阻斷神經(jīng)系統(tǒng)炎癥小體激活［30］；通過抑制促炎酶和細(xì)胞因子的分泌而發(fā)揮抗炎作用［31］；通過LIN28b／LET－7 軸抑制核因子κB（NFκB）的激活，從而抑制牛子宮內(nèi)膜上皮（BEND）細(xì)胞的炎癥［32］；通過3 個特異性miRNAs（miR－21、miR－146a 和miR－181），抑制小鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥［33］。其中，ADSCs－Exos 對減輕炎癥反應(yīng)的作用更為突出［34］。首先，ADSCs－Exos 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 表型極化，從而降低了巨噬細(xì)胞激發(fā)炎癥反應(yīng)的能力［35］；而白細(xì)胞介素－10（IL－10）作為一種有效的抗炎物質(zhì)，能夠抑制由炎癥反應(yīng)造成的創(chuàng)面延遲愈合。另外，高表達(dá)Nrf2 的ADSCs－Exos 可降低IL－1β、IL－6 和TNF－α 等炎癥細(xì)胞因子水平，從而降低創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)［36］。

3.2 ADSCs－Exos 可加速血管生成

局部血液循壞是影響創(chuàng)面愈合的重要因素，可以提供組織再生所需營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，促使細(xì)胞生長、肉芽組織形成；另外，對吸收壞死組織及控制局部感染也起到了重要作用［37］。當(dāng)局部血流循環(huán)良好時，創(chuàng)面再生修復(fù)快；相反，局部血液供應(yīng)不良時，該處的創(chuàng)面愈合遲緩。新生血管的形成是加速局部血液循環(huán)的關(guān)鍵，在創(chuàng)面愈合的過程中意義重大［38］。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs－Exos 可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管形成，進(jìn)而增加局部組織的血液循環(huán)，加速創(chuàng)面愈合過程。這種加速血管生成的效應(yīng)多是通過各類特異性miRNAs 的高表達(dá)來實現(xiàn)的。實驗證實，通過miR－130a 的高表達(dá)，可顯著促進(jìn)小鼠體內(nèi)的血管生成［39］；通過miR－21 的高表達(dá)，可明顯促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的血管化［40］。另有研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs－Exos 可以通過轉(zhuǎn)運功能性酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），來增加內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管的形成，加速血管生成的過程［41］。

3.3 ADSCs－Exos 可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖與遷移

促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、遷移是皮膚創(chuàng)面愈合以及傷口收縮的關(guān)鍵。纖維蛋白凝塊的分解、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的重塑和膠原纖維的形成過程，都有成纖維細(xì)胞的參與［42］。ADSCs－Exos 可以通過多種機制促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖與遷移。多項研究表明，外泌體miRNA 對成纖維細(xì)胞有積極作用。如，人羊膜上皮細(xì)胞來源的外泌體miRNA 可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)傷口愈合［43］；外泌體miRNA 的上調(diào)會促進(jìn)癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）的形成和激活［44］。另外，Exos 內(nèi)包含的各類蛋白也對成纖維細(xì)胞有著重要影響。Bakhtya 等［45］證明了Exos 在體外可以提高成纖維細(xì)胞活力，并在小鼠的穿孔活組織創(chuàng)傷模型中促進(jìn)皮膚傷口的愈合，這些效應(yīng)與Exos 內(nèi)含有大量的α2 巨球蛋白有關(guān)。而ADSCs－Exos 作用于成纖維細(xì)胞增殖與遷移的研究，近些年開展廣泛。研究認(rèn)為，ADSCs－Exos 在角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞的形成中可發(fā)揮關(guān)鍵作用，ADSCs－Exos 可以增強角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞的活力，促進(jìn)角膜基質(zhì)細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化［46］。另外，ADSCs－Exos 可以通過優(yōu)化成纖維細(xì)胞的特性來促進(jìn)皮膚傷口的愈合。ADSCs－Exos 刺激成纖維細(xì)胞后，以劑量依賴的方式刺激細(xì)胞遷移、增殖和膠原合成［47］，Ⅰ型膠原（COL1）、Ⅲ型膠原（COL3）、MMP1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）和TGF－β1 mRNA 水平均升高，在體內(nèi)可顯著促進(jìn)創(chuàng)面愈合［48］，在體外可提高p－Akt／Akt 水平，這是促進(jìn)傷口愈合的重要信號通路［49］。Ren 等［50］的研究也證明了這一觀點，認(rèn)為ADSCs－Exos 加速了成纖維細(xì)胞中AKT 和ERK 信號通路的激活，在體外和體內(nèi)均可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、遷移。

3.4 ADSCs－Exos 可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑

ECM 是細(xì)胞周圍由多種大分子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，與傷口愈合的重塑階段密切相關(guān)，在瘢痕的形成過程中也發(fā)揮重要作用。但是，目前針對ADSCs－Exos 作用于皮膚創(chuàng)面處細(xì)胞外基質(zhì)重塑的文獻(xiàn)十分有限，大量研究僅停留在ADSCs－Exos 對細(xì)胞外基質(zhì)的重塑的促進(jìn)作用［51］，對于ADSCs－Exos 促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑的具體機制，仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論與展望

相較于細(xì)胞治療，ADSCs－Exos 治療具有來源豐富、易儲存、性質(zhì)穩(wěn)定、免疫原性低、不受倫理限制等諸多優(yōu)勢，為今后的臨床治療方案提供了新的思路。因此，近些年相關(guān)研究廣泛開展，針對ADSCs－Exos的制備與純化、組成成分，及其促進(jìn)組織修復(fù)機制的高質(zhì)量研究越來越多，這為ADSCs－Exos 的臨床應(yīng)用提供了更加堅實的理論基礎(chǔ)。此外，眾多研究也提出了諸多不同的ADSCs－ Exos 應(yīng)用方法，如直接注射ADSCs－ Exos 懸液、同敷料聯(lián)合使用、結(jié)合載藥技術(shù)等。近年來，3D 打印技術(shù)飛速發(fā)展，結(jié)合水凝膠光固化打印的ADSCs－Exos 水凝膠表面敷料將是未來的研究與應(yīng)用的熱點之一。

盡管有著諸多明顯的優(yōu)勢，ADSCs－ Exos 的臨床應(yīng)用仍存在諸多問題。目前，外泌體的提取和純化過程比較繁瑣，且缺乏特定細(xì)胞來源外泌體的統(tǒng)一鑒定方法，應(yīng)用于人體的安全劑量也尚未知曉，對其不良作用、副作用及長期效果還缺少深入研究［52］。

綜上所述，ADSCs－Exos 為創(chuàng)面修復(fù)提供了一種新的可能，但要真正地應(yīng)用于臨床，必須先明確其發(fā)揮作用的具體機制、可能存在的不良作用、長期效果的穩(wěn)定性、給藥劑量及給藥途徑等，這一切都需要進(jìn)行更為深入的基礎(chǔ)研究和臨床前期研究。