自噬及自噬調(diào)節(jié)劑在腦缺血中的研究進展

王愷迪，張麗梅，黎 曉

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2019級碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院2018級碩士研究生；3. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000）

腦缺血（Cerebral ischemia）的病理過程十分復(fù)雜。當(dāng)腦供血不足時可引發(fā)缺血缺氧，使腦實質(zhì)發(fā)生廣泛彌散性病變，并最終導(dǎo)致腦的整合機能明顯受損，甚至急性死亡，因而給患者及社會帶來了嚴(yán)重危害。然而，腦缺血的發(fā)病機制復(fù)雜多樣，現(xiàn)有保守治療多以溶栓藥物及神經(jīng)功能保護劑為主，由于受治療時間窗（3～4.5 h）的限制［1］，導(dǎo)致臨床治療效果差強人意。因此，探明腦缺血發(fā)病機制以尋找新的腦缺血防治策略意義非凡。

自噬（Autophagy）是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象。在正常生理狀態(tài)下，自噬的發(fā)生可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)；而在疾病情況下，可能引起自噬水平的變化，而對機體產(chǎn)生防御或損傷的雙向作用［2］。大量證據(jù)表明，自噬參與了腦缺血的發(fā)生發(fā)展，但真正扮演的角色卻未達成共識?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，自噬的激活在腦缺血損傷中是有益還是有害，很大程度上取決于自噬靶向細(xì)胞內(nèi)底物的負(fù)荷能力與細(xì)胞自噬能力之間的平衡［3］，而能夠調(diào)節(jié)這種平衡狀態(tài)的各類自噬調(diào)節(jié)劑也隨即應(yīng)運而生。為此，本文擬對自噬及自噬調(diào)節(jié)劑在腦缺血疾病研究過程中的研究現(xiàn)狀作一歸納總結(jié)，旨在為相關(guān)研究工作者提供參考。

1 自噬概述

自噬是細(xì)胞中的一種基本分解代謝過程：當(dāng)細(xì)胞處于營養(yǎng)饑餓或代謝應(yīng)激時，自噬將被激活，繼而降解受損的細(xì)胞器或功能失調(diào)的蛋白質(zhì)以獲得能量或游離氨基酸，實現(xiàn)維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。自噬主要包括3種類型：微自噬，分子伴侶介導(dǎo)的自噬和大自噬，通常所說的自噬指大自噬。在真核生物中，自噬過程主要包括3個階段：降解的細(xì)胞質(zhì)成分被吞噬在雙層膜中形成自噬小體、自噬小體與溶酶體（或植物和酵母細(xì)胞中的液泡）融合、水解酶催化降解其內(nèi)容物［4］。越來越多的證據(jù)表明，自噬可通過選擇性降解受損的線粒體、聚集蛋白、過量的過氧化物酶體和入侵的病原體而維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)［5］。

2 自噬與腦缺血的關(guān)系

眾多研究表明，自噬與腦缺血的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。NITATORI 等［6］于1995 年首次報道了腦缺血后存在自噬現(xiàn)象，他們用電子顯微鏡觀察缺血后3天的沙鼠大腦海馬CA1 區(qū)發(fā)現(xiàn)，其中含有膜結(jié)構(gòu)和部分細(xì)胞質(zhì)的膜結(jié)合液泡；隨后SOLENSKI 等［7］也發(fā)現(xiàn)，在大腦中動脈阻塞（Middle cerebral artery oc-clusion，MCAO）大鼠的腦組織中，大腦皮層神經(jīng)元線粒體以凝結(jié)、基質(zhì)密度增加和雙膜自噬的形式表現(xiàn)出明顯的損傷跡象，而這些結(jié)果后來均得到了證實［8-10］；并且，在缺血腦組織的膠質(zhì)細(xì)胞和腦內(nèi)皮細(xì)胞中也觀察到了自噬現(xiàn)象［11-12］，這些證據(jù)表明，自噬參與了腦缺血的病理生理改變，但其作用不甚明了。

目前的證據(jù)表明，自噬對腦缺血損傷后神經(jīng)元的存活起著“雙刃劍”作用［13］。一些觀點認(rèn)為，多種神經(jīng)保護機制與神經(jīng)元自噬強度的增加有關(guān)。例如，缺血預(yù)處理和缺氧預(yù)處理誘導(dǎo)的內(nèi)源性神經(jīng)保護機制［14-15］，以及神經(jīng)保護藥物激活的神經(jīng)保護［16］，均被認(rèn)為激活了神經(jīng)元的自噬。另一些研究則相反，他們在體外和體內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，過度的細(xì)胞自噬反而會導(dǎo)致神經(jīng)元死亡（自噬性細(xì)胞死亡）［17-18］。這說明自噬在腦缺血中的作用可能取決于其發(fā)生程度。換言之，適度的自噬可以發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但如果自噬被過度激活，則可能促進神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元死亡。因此，控制自噬激活的程度似乎是研究的關(guān)鍵。

當(dāng)前，對于基因、蛋白質(zhì)及信號通路中相關(guān)分子表達水平的檢測技術(shù)已日益完善，這為實現(xiàn)自噬過程的操縱——即自噬調(diào)節(jié)提供了技術(shù)保障。在對腦缺血疾病的研究中已成功鑒定了許多與自噬有關(guān)的基因和蛋白質(zhì)［19］，因而通過調(diào)節(jié)自噬干預(yù)腦缺血疾病似乎也成為可能。甚至，在一些腦缺血干預(yù)治療的研究中，通過對自噬的調(diào)節(jié)已顯示出樂觀的結(jié)果，這也激發(fā)了許多制藥工業(yè)對自噬調(diào)節(jié)劑的研究和開發(fā)，因而自噬調(diào)節(jié)劑在腦缺血中的作用也成為了新的關(guān)注點。

3 自噬調(diào)節(jié)劑在腦缺血中的作用及作用機制

自噬受復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控［20］。在腦缺血損傷中，通常認(rèn)為自噬主要由上游調(diào)節(jié)因子即雷帕霉素靶蛋白（The mammalian target of target of rapamy-cin，mTOR）復(fù)合物1（mTORC1）和AMP 激活的蛋白激酶［Adenosine 5"-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK］共同調(diào)節(jié)，它們接受來自壓力傳感器的激活或抑制的信號［21］并作出相應(yīng)的反應(yīng)。在營養(yǎng)充足的條件下，mTORC1被過度激活，而AMPK 的活性則受到抑制，在這種情況下，由于mTORC1 使ULK1 和Atg13 的磷酸化失活，兩種激酶的下游靶標(biāo)ULK1 激酶復(fù)合物將被抑制，進而導(dǎo)致自噬通量的減少［22］；相反，在營養(yǎng)耗盡的條件下，AMPK 可被激活，激活后可進一步使mTORC1 失活間接或直接激活ULK1 激酶復(fù)合物［23］，從而促使自噬加強。相應(yīng)地，自噬調(diào)節(jié)劑在腦缺血中的作用也主要通過調(diào)控這些信號分子實現(xiàn)。

3.1 經(jīng)PI3K 信號分子介導(dǎo)神經(jīng)保護作用的自噬調(diào)節(jié)劑目前，經(jīng)PI3K信號分子介導(dǎo)神經(jīng)保護作用的自噬調(diào)節(jié)劑研究相對較多，通常以Ⅰ類和Ⅲ類多見。其中，Ⅲ類PI3Ks能被各種刺激如氨基酸、葡萄糖和其他營養(yǎng)物質(zhì)激活，激活后能將磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）磷酸化為磷脂酰肌醇3-磷酸（Phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P），并在自噬、吞噬和胞內(nèi)體運輸中發(fā)揮重要作用。激活的Ⅲ類PI3K 能與自噬標(biāo)記性蛋白Beclin-1 形成復(fù)合物，這有助于自噬體膜的形成，說明調(diào)節(jié)Ⅲ類PI3K的活性可以調(diào)控自噬的強度。經(jīng)典的自噬抑制劑3-MA、Wortmannin 和LY294002，都是通過抑制Ⅲ類PI3K進而抑制自噬作用的［24］。此外，Ⅰ類PI3K也具有保護神經(jīng)元免受腦缺血損傷的治療價值，它在G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）或受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase，RTK）激活時被招募，一旦被招募到質(zhì)膜上，它們將磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇（3，4，5）P3（PIP3），PIP3是第二信使，負(fù)責(zé)激活多種AKT/蛋白激酶B 依賴性和AKT 非依賴性下游信號通路。Ⅰ類PI3K 可通過激活A(yù)kt-mTOR 途徑抑制自噬，最終實現(xiàn)對腦缺血后神經(jīng)元的保護作用［25］。自噬抑制劑HSYA 即通過激活Ⅰ類PI3K，進而抑制經(jīng)AktmTOR 信號通路的自噬，從而對體外氧糖剝奪/再灌注（Oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷的神經(jīng)元起治療作用［26］。

很多經(jīng)典的藥物已被發(fā)現(xiàn)是通過PI3K/Akt 途徑抑制過度自噬發(fā)揮對腦缺血中的保護作用。①褪黑素是一種天然神經(jīng)保護劑，它通過阻止Beclin-1的表達抑制自噬并激活PI3K/Akt 途徑來預(yù)防腦缺血損傷［27］；而N-乙酰血清素是褪黑素的直接前體，目前在腦缺血小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)其可通過抑制線粒體和自噬細(xì)胞死亡途徑而具有神經(jīng)保護作用［28］。②黃芩素（5，6，7-三羥基黃酮）乃自黃芩（Scutellaria Baicalensis Georgi）根中提取的生物活性成分。YANG S 等［29］研究了黃芩素在MCAO 誘導(dǎo)的大鼠腦缺血再灌注亞急性期中的治療作用，他們發(fā)現(xiàn)，黃芩素可降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，促進PI3K/Akt-mTOR 信號通路的磷酸化，提示黃芩素可能通過抑制自噬發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷大鼠的防治作用。③加巴噴?。℅abapentin，GBP）是一種輔助抗癲癇藥和止偏頭痛的預(yù)防藥物。YAN B C等［30］對其研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的GBP 預(yù)處理可激活PI3K/Akt-mTOR 通路，繼而減輕因腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元損傷。④枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）是枸杞的主要活性成分，已經(jīng)證實其具有多種有益作用，包括神經(jīng)保護，抗衰老和抗氧化等。有研究發(fā)現(xiàn)，LBP預(yù)處理可提高OGD/R后原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中p-Akt和p-mTOR 水平，說明LBP 可激活A(yù)kt-mTOR 信號通路抑制自噬繼而減輕海馬神經(jīng)元的損傷［31］。⑤人參皂甙是人參的主要活性成分，能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)多種神經(jīng)功能的藥理作用。LUO T 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rb1（GRb1）對OGD 或短暫性全腦缺血模型中誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有較好的治療作用，其機制可能與激活PI3K/Akt-mTOR途徑抑制過度的自噬有關(guān)。

以上證據(jù)表明，自噬抑制劑可通過PI3K信號分子介導(dǎo)神經(jīng)保護作用，且種類繁多，其中還不乏多種中藥的有效成分，這為進一步開發(fā)我國傳統(tǒng)中藥的藥用價值具有重要參考意義。

3.2 經(jīng)AMPK-mTOR 信號介導(dǎo)神經(jīng)保護作用的自噬調(diào)節(jié)劑文獻表明，一些自噬調(diào)節(jié)劑可以通過上調(diào)AMPK 信號分子誘導(dǎo)自噬而發(fā)揮腦保護作用。例如，白藜蘆醇預(yù)處理后可以上調(diào)缺血皮質(zhì)區(qū)腦組織LC3（Microtubulesas sociated protein light chain 3，MAP-LC3）和beclin1 的表達，他們認(rèn)為，其保護機制可能通過上調(diào)AMPK 誘導(dǎo)自噬，繼而減少短暫性全腦缺血大鼠皮層活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、脂質(zhì)過氧化和一氧化氮（NO）等物質(zhì)的產(chǎn)生，從而減少神經(jīng)元的死亡［33］；也有研究表明，在大鼠脊髓損傷模型中，辛伐他汀的神經(jīng)保護作用可能部分歸因于其激活A(yù)MPK 并抑制Akt 及其下游靶標(biāo)mTOR 而誘導(dǎo)自噬反應(yīng)［34］。此外，AO L 等［35］研究發(fā)現(xiàn)，新合成化合物JLX-001 可減輕腦缺血損傷的潛在機制也可能激活A(yù)MPK 抑制mTOR 活性，從而誘導(dǎo)自噬有關(guān)。

相反地，一些自噬調(diào)節(jié)劑則被認(rèn)為是通過抑制AMPK 進而抑制自噬發(fā)揮腦保護作用的。例如，WANG J F等［36］在大鼠MCAO模型研究中發(fā)現(xiàn)，葛根素可以通過下調(diào)缺血側(cè)海馬中AMPK，并上調(diào)p-mTOR和pS757-ULK1 的蛋白表達水平，進而抑制自噬，發(fā)揮對腦缺血/再灌注損傷的保護作用；另一項研究稱，五味子素也可通過調(diào)節(jié)AMPK-mTOR 途徑抑制自噬，對OGD 模型中的PC12 細(xì)胞起保護作用［37］。由此，通過AMPK 直接或間接介導(dǎo)神經(jīng)保護作用的有關(guān)自噬調(diào)節(jié)劑的研究仍處于初級階段，且該類自噬調(diào)節(jié)劑的具體作用靶點仍不清楚，尚需更多的研究進行探討。

3.3 經(jīng)MAPK 信號介導(dǎo)神經(jīng)保護作用的自噬調(diào)節(jié)劑絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）通常分為ERK、p38、JNK 和ERK5 四個亞類。許多對中藥神經(jīng)保護機制的研究發(fā)現(xiàn)，其作用可能通過MAPK信號通路介導(dǎo)自噬發(fā)揮的。例如，吳茱萸堿可以通過JNK 信號通路激活自噬來改善腦缺血［38］；黃連解毒湯可以通過MAPK 信號通路抑制mTOR進而激活自噬，從而減輕腦缺血損傷［39］。

最近經(jīng)FDA 批準(zhǔn)的神經(jīng)保護性自噬調(diào)節(jié)劑bexarotene，是維甲酸X 受體激動劑。在腦缺血合并黃斑病變的老年共發(fā)病模型中，bexarotene可增加自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II 和p62 的表達，同時可以減輕線粒體的損傷，而神經(jīng)元的損傷很大程度上取決于線粒體損傷，說明bexarotene 可以通過激活自噬維持線粒體的穩(wěn)態(tài)，使神經(jīng)元免受損傷；同時在患有中風(fēng)和脊椎病的小鼠模型中，研究者應(yīng)用bexarotene后可增強其腦部自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ和p62 的表達，腦缺血引起的梗死顯著減少，且行為缺陷也得到改善，并認(rèn)為該作用可能通過JNK 途徑實現(xiàn)，這就驗證了bexarotene 可能通過MAPK 信號分子介導(dǎo)其神經(jīng)保護作用［40］。如此看來，經(jīng)MAPK 信號分子介導(dǎo)的自噬調(diào)節(jié)劑多以激活自噬的形式發(fā)揮神經(jīng)保護作用的，而其具體的激活機制仍需進一步闡明。

3.4 其他自噬調(diào)節(jié)劑事實上，還有很多藥物雖已證實在腦缺血中發(fā)揮神經(jīng)保護作用的同時也改變了自噬的強度，但其具體的作用路徑卻并未明確。比如，醒腦靜和犀牛地黃湯等中藥復(fù)方在發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的保護作用的同時，能降低Beclin1 和LC3 的表達，即減弱腦缺血大鼠的自噬程度［41-42］；再比如米諾環(huán)素作為廣譜四環(huán)素類抗生素，也被發(fā)現(xiàn)可以顯著降低大鼠TUNEL 陽性細(xì)胞和Beclin-1，LC3-II/LC3-I的比值和caspase-3/8的蛋白水平，即可以通過減少大鼠模型中細(xì)胞凋亡和自噬的激活來對抗腦出血［43］；同時，我們的研究也發(fā)現(xiàn)，對植物雌激素——染料木素（Genistein）進行磺酸化結(jié)構(gòu)改造后所得的染料木素磺酸鈉（Genistein sodium sulfo-nate，GSS）對缺血再灌注損傷模型大鼠的腦保護作用也可能與抑制自噬有關(guān)，但其具體的作用機制還有待進一步研究［44］?？傊@類自噬調(diào)節(jié)劑的作用路徑甚為復(fù)雜，可能通過上述一條或多條通路，甚至通過其它新的未知路徑實現(xiàn)其對缺血性腦病的治療作用。

4 小結(jié)與展望

迄今認(rèn)為，自噬在腦缺血損傷過程中是一把“雙刃劍”，因而對自噬程度的調(diào)節(jié)或許可成為治療腦缺血的一個方向。由于自噬是一個由多分子靶點組成的復(fù)雜過程，又受到多種信號通路控制，因此，對自噬調(diào)節(jié)劑的選用也需全面而審慎。另外，許多自噬調(diào)節(jié)劑及自噬級聯(lián)反應(yīng)過程都得到了很好的研究，但同時針對自噬級聯(lián)反應(yīng)中相同途徑或關(guān)鍵自噬蛋白的負(fù)性或正性調(diào)節(jié)劑的研究卻不多見。并且，同一種調(diào)節(jié)劑對自噬的調(diào)節(jié)產(chǎn)生不同結(jié)果的機制也不甚明了，目前認(rèn)為這可能與腦缺血的自噬程度有關(guān)，如SHI 等［45］發(fā)現(xiàn)在氧-糖剝奪模型中發(fā)現(xiàn)再灌注前24 h，3-MA 會導(dǎo)致大量的神經(jīng)細(xì)胞死亡；而在48～72 h，3-MA 又會表現(xiàn)為顯著的神經(jīng)元保護作用，同一種調(diào)節(jié)劑在同一模型中發(fā)揮著完全不同的作用，這也許是由于長時間的氧-糖剝奪導(dǎo)致的自噬被過度激活所致。值得注意的是，同一種自噬調(diào)節(jié)劑在腦缺血中的不一致結(jié)果也可能因不同的實驗過程中所給的劑量及途徑不同，或這些調(diào)節(jié)劑本身并不是單一特異性，再者有可能因?qū)嶒炦^程中不同的動物模型帶來的差異等，諸多因素影響了結(jié)果的呈現(xiàn)。

所以，自噬過程的復(fù)雜性及腦缺血過程中腦功能變化的復(fù)雜性，均導(dǎo)致了自噬的研究在不同的實驗中無法顯示出一致的穩(wěn)定結(jié)果，這給自噬在腦缺血的研究也造成了一定的困難。同時，不同程度的自噬對神經(jīng)功能作用的對立結(jié)果仍值得我們深思，在今后對腦缺血的干預(yù)研究中，對于自噬調(diào)節(jié)劑的選用或是研究開發(fā)，應(yīng)有更審慎的態(tài)度。我們也期待，在以后的研究中可以確定自噬在神經(jīng)保護功能與損害功能之間的中立點，對自噬調(diào)節(jié)劑加以正確利用，這將為臨床治療腦缺血提供新的策略。