復(fù)方桑葉消痤凝膠對(duì)ICR小鼠痤瘡模型炎性改善作用及抗炎機(jī)制初探

陳茜 江陽 呂靜 黃先智

摘要：目的 探究復(fù)方桑葉消痤凝膠對(duì)ICR小鼠痤瘡模型的相關(guān)抗炎影響。方法 將6～8周齡雌性ICR小鼠隨機(jī)分為：生理鹽水對(duì)照組、模型組、七味姜黃搽劑組、復(fù)方桑葉消痤凝膠高、中、低劑量治療組，n=6。小鼠耳廓內(nèi)注射P.acnes致炎24h，各組行生理鹽水、七味姜黃搽劑、復(fù)方桑葉消痤凝膠高、中、低劑量涂抹治療，持續(xù)治療7 d。記錄耳廓厚度及形態(tài)學(xué)變化，行常規(guī)HE染色，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)組織NLRP3、caspase-1、IL-1β的mRNA表達(dá)水平，蛋白免疫印跡法檢測(cè)TLR2等相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 復(fù)方桑葉消痤凝膠能對(duì)痤瘡炎癥起一定改善作用，減輕表皮脊層增生，皮損中炎癥小體相關(guān)因子NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA表達(dá)降低，皮損中TLR2、NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)降低。 結(jié)論 復(fù)方桑葉消痤凝膠減輕了痤瘡模型小鼠的炎癥，這種炎癥改善作用可能受NLRP3炎性小體信號(hào)通路調(diào)控。

關(guān)鍵詞：復(fù)方桑葉消痤凝膠;NLRP3炎性小體;ICR小鼠痤瘡模型

中圖分類號(hào)：R758.73+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2021）11-0065-06

A Preliminary Study on the Inflammation Improvement Effect and Anti-inflammatory Mechanism of Compound Sangye Xiaocuo Gel on ICR Mice with Acne Model

CHEN Qian1， JIANG Yang1， LV Jing1， HUANG Xianzhi2

（1. Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine/Chongqing First People's Hospital， Chongqing 400011， China;2. Department of Science and Technology， Southwest University， Chongqing 400000， China）

【Abstract】Objective： To explore the anti-inflammatory effect of Compound Sangye Xiaocuo Gel on ICR mouse acne model. Methods： Female ICR mice aged 6-8 weeks were randomly divided into normal saline control group， model group， seven-flavored turmeric liniment group， Compound Sangye Xiaocuo Gel groups of high， medium and low doses， n=6. The mice were injected with P.acnes into the auricle to cause inflammation for 24 hours， and each group was treated with normal saline， seven-flavored turmeric liniment， Compound Sangye Xiaocuo Gel of high， medium and low doses， and the treatment lasted for 7 days. The thickness and morphological changes of the auricle were recorded， and conventional HE staining was performed. The mRNA expression levels of NLRP3， caspase-1 and IL-1β in tissues were detected by real-time fluorescent quantitative PCR， and the expression levels of TLR2 and other related proteins were detected by western blotting. Results： Compound Sangye Xiaocuo Gel can improve acne inflammation， reduce epidermal spine hyperplasia， and lower inflammasome-related factors of NLRP3， caspase-1， IL-1β mRNA expression in skin lesions and the protein expression of TLR2， NLRP3 and Caspase-1 in skin lesions. Conclusion： Compound Sangye Xiaocuo Gel has reduced the inflammation in acne model mice， and this inflammation improvement effect may be regulated by the NLRP3 inflammasome signaling pathway.

【Key words】Compound Sangye Xiaocuo Gel; NLRP3 inflammasome; ICR Mouse Model of Acne

痤瘡是一種以粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)、囊腫為表現(xiàn)的毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病，可導(dǎo)致部分患者嚴(yán)重瘢痕，極大地影響患者容貌及身心健康[1-3]。痤瘡發(fā)病因素復(fù)雜且發(fā)病率高，我國幾項(xiàng)痤瘡流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果顯示[4]，中小學(xué)生痤瘡發(fā)病率可達(dá)50%，作息不規(guī)律的大學(xué)生發(fā)病率可高達(dá)80%。痤瘡丙酸桿菌（P.acnes）為誘發(fā)痤瘡炎癥的重要因素之一，作為正常皮膚菌群的一員，P.acnes在痤瘡患者的毛囊皮脂腺卻是明顯增加[5]。近年來，較多研究指出，TLR2 信號(hào)通路介導(dǎo)了P.acnes誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答[6-7]，同時(shí)相關(guān)報(bào)道也指出，除了TLR2 信號(hào)通路外，其他通路途徑也參與了痤瘡的炎癥過程，近幾年越來越多的報(bào)道指出NLRP3炎性小體也參與其中。NLRP3炎癥小體是固有免疫系統(tǒng)識(shí)別受體家族重要成員之一，較多研究證明其參與了多種皮膚病的炎癥過程，P.acnes在人皮脂腺細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中均能激活NLRP3炎性小體，通過自活化激活caspase-1后，進(jìn)一步剪切IL-1β前體，使IL-1β成熟及分泌，進(jìn)而引起機(jī)體一系列炎癥反應(yīng)[8-9]。

本院自制的中藥制劑復(fù)方桑葉消痤凝膠，主要成分為桑葉、柿葉、川芎。本復(fù)方中，桑葉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒，味甘、苦，具有降血壓、血脂以及抑菌抗炎的作用。柿葉做藥用首載于《滇南本草》，其味苦，性寒，具有清熱解毒，潤肺活血功效。川芎亦始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其具有活血化瘀，祛風(fēng)止痛之功效。故本中藥復(fù)方三藥配伍共奏疏風(fēng)清熱、涼血活血和散結(jié)消腫之功。該方前期臨床應(yīng)用效果良好，涂抹于于面部直達(dá)病所，但具體作用機(jī)制尚未探索。

本次研究利用痤瘡丙酸桿菌建立ICR小鼠痤瘡模型，通過觀察我院自制復(fù)方桑葉消痤凝膠對(duì)ICR小鼠痤瘡模型炎性改善作用，初步探究其對(duì)TLR2/NLRP3炎性小體及下游炎癥相關(guān)因子Caspase-1和IL-1β的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 蛋白電泳儀及酶標(biāo)儀購買于BIO-RED，熒光定量PCR儀購買于瑞士羅氏公司，電泳相關(guān)基礎(chǔ)試劑及β-actin抗體均購買于碧云天生物技術(shù)有限公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（sb-wb012）購買于圣爾生物，SYBR Premix Ex TaqTM（04707516001）、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（04897030001）購買于瑞士羅氏公司，TLR2（ab209216）、NLRP3（ab263899）、Caspase-1（ab138483）等一抗購買于abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔二抗購買于聯(lián)科生物公司，所有引物均由擎科生物科技有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 陽性藥：七味姜黃搽劑（貴州雙升制藥有限公司生產(chǎn)）。復(fù)方桑葉消痤凝膠制劑（桑葉、柿葉、川芎烘干超微粉碎過300目篩），凝膠高劑量組為柿葉∶川芎∶桑葉濃縮粉比例1∶1∶2;復(fù)方桑葉消痤凝膠中劑量組為柿葉∶川芎∶桑葉濃縮粉比例1∶1∶1;復(fù)方桑葉消痤凝膠低劑量組為柿葉∶川芎∶桑葉濃縮粉比例1∶1∶0.5。柿葉，川芎，桑葉等份配比熬制后提煉制成凝膠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性ICR小鼠36只，6～8周齡，30～40 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK-（渝）2017-0006）。

1.4 造模及治療

1.4.1 痤瘡丙酸桿菌混懸液制備 痤瘡丙酸桿菌購買于中國藥品生物制品檢定所（編碼：ATCC6919），取1株菌株于腦心浸液培養(yǎng)基中37℃轉(zhuǎn)種活化并厭氧培養(yǎng)增殖，用PBS配制濃度為5×106CFU/μl菌液，備用。

1.4.2 分組及造模 ICR小鼠隨機(jī)分為6組：生理鹽水對(duì)照組，模型組，七味姜黃搽劑組（陽性組），復(fù)方桑葉消痤凝膠高、中、低劑量治療組，每組6只。除對(duì)照組外，其余各組共30只小鼠，每只小鼠左耳內(nèi)側(cè)面耳注射一次痤瘡丙酸桿菌混懸液20ul（5×106CFU/μl），24 h后，可見鼠耳明顯增厚，毛囊口毛孔擴(kuò)大明顯，擠壓可見白色內(nèi)容物，可見P.acnes囊腫，類似于炎癥性痤瘡。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)方法 除生理鹽水對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物在造模范圍用棉簽涂抹各組對(duì)應(yīng)藥物，每日早晚 2 次，連續(xù)給藥7 d為1個(gè)療程。其中復(fù)方桑葉消痤凝膠高、中、低劑量組每次涂抹厚度約為1～2 mm，無需清洗，小鼠自身活動(dòng)會(huì)逐漸蹭掉。結(jié)束干預(yù)后，戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取材，備用。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀察及耳廓厚度記錄 各組小鼠干預(yù)前后，肉眼觀察并拍照記錄小鼠耳部炎癥、膿皰、紅腫等。利用千分尺記錄造模前后及治療期間小鼠耳廓皮損厚度，測(cè)量時(shí)均選擇皮損處同一位置同一力度進(jìn)行測(cè)量，重復(fù)3次，記錄測(cè)量數(shù)據(jù)。

1.5.2 組織病理切片HE染色 皮損組織經(jīng)多聚甲醛液固定、30%蔗糖溶液脫水、石蠟包埋、切片（厚6um）、行 Hematoxylin-Eosin染色，光學(xué)顯微鏡拍照。

1.5.3 Real-time PCR 組織總RNA獲取采用常規(guī)TRIZOL法，并進(jìn)一步用ROCHE試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real-time PCR的反應(yīng)體系為：SYBR TaqII（2×）5ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，cDNA 1ul，dH2O 3ul，總體積為10ul。 Real-time PCR程序?yàn)椋?5℃10 min，95℃ 15s，60℃ 30s，總循環(huán)數(shù)為40;溶解曲線95℃ 5s，60℃ 1 min，95℃ 1s，冷卻40℃ 10s。下表1為引物上下游堿基序列。

1.5.4 Western blot 組織總蛋白提取及制備，電泳分離（電壓先80V分離0.5h后，再調(diào)至120V分離約1.5h），蛋白膜轉(zhuǎn)移（電壓100V轉(zhuǎn)移時(shí)間1h），脫脂牛奶封閉1h后加入合適稀釋度的一抗（TLR2、NLRP3、Caspase-1、β-actin），4℃冰箱孵育過夜，加TBST，于搖床洗膜3次每次10 min，合適濃度的二抗1h，重復(fù)TBST洗膜3次每次10 min，顯色。ImageJ軟件測(cè)量目的蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS l 9.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以表示，組間差異采用單因素方差分析。P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICR小鼠耳部痤瘡模型建立及腫脹情況 見圖1。生理鹽水對(duì)照組小鼠耳薄、光滑呈半透明狀，可見毛細(xì)血管;注射P.acnes造模后，各組耳部均出現(xiàn)明顯紅腫，注射部位形成皮丘膿皰。模型組1周后耳廓膿腫仍然持續(xù)，部分表面破潰結(jié)痂;七味姜黃搽劑組給藥1周后耳廓炎癥相較模型組呈明顯減輕狀，耳廓膿腫、膿皰及丘疹等大部分吸收;復(fù)方桑葉消痤凝膠高、中、低劑量組治療后炎癥、膿腫均有不同程度減輕，內(nèi)耳闊逐漸恢復(fù)平滑光澤，且高劑量組肉眼可見腫脹改善相對(duì)明顯。

2.2 各組ICR小鼠耳廓厚度及組織病理改變 各組在注射P.acnes致炎24h后，耳廓均出現(xiàn)明顯的增厚，且各組隨著時(shí)間的增加厚度呈現(xiàn)不同程度降低趨勢(shì)，其中模型組小鼠耳廓平均厚度下降較為緩慢，陽性對(duì)照組及復(fù)方桑葉消痤凝膠高中低組療后耳廓平均厚度下降更為迅速，以高劑量組療效最明顯。具體數(shù)據(jù)見圖2。耳部組織石蠟切片后，行HE染色，生理鹽水對(duì)照組小鼠耳廓的表皮、毛囊及真皮等均未見明顯異常的病理變化。模型組表皮厚度增加，真皮內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤增多且呈彌散狀，間質(zhì)充血水腫，同時(shí)皮脂腺增生顯著;七味姜黃搽劑組及復(fù)方桑葉消痤凝膠高劑量組耳部真皮內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，組織水腫減輕，真皮上部散在少許皮脂腺腺體;復(fù)方桑葉消痤凝膠中、低劑量組表皮增厚情況減輕，炎癥細(xì)胞浸潤、組織水腫及皮脂腺增生相較于模型組均有緩解，見圖3。

2.3 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果與模型組相比，七味姜黃搽劑組，復(fù)方桑葉消痤凝膠高、中、低劑量組NLRP3、IL-1β mRNA表達(dá)水平均明顯下降，（P<0.001）;相較模型組，七味姜黃搽劑組，復(fù)方桑葉消痤凝膠高、中劑量組Caspase-1表達(dá)明顯降低（P<0.001），但復(fù)方桑葉消痤凝膠低劑量組與模型組沒有明顯差異。見表2。

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果與模型組相比，七味姜黃搽劑組，復(fù)方桑葉消痤凝膠高、中、低劑量組TLR2、NLRP3、caspase-1 蛋白表達(dá)水平均明顯下降（P<0.001），見表3及圖4。

3 討論

痤瘡發(fā)病因素極其復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果，包括Toll樣受體、白介素、腫瘤壞死因子等多種促炎因子、趨化因子參與其炎癥過程。體表出現(xiàn)痤瘡病變的主要因素之一就在于毛囊皮脂腺中痤瘡丙酸桿菌（P.acnes）的過度增殖[5]。P.acnes是正常寄生于皮膚的菌群之一典型的革蘭氏陽性厭氧菌。大量研究表明，在痤瘡患者毛囊皮脂腺中，P.acnes數(shù)量明顯增高。Sunhyo Ryu等[10]通過建立ICR小鼠耳廓痤瘡模型，即于耳廓皮內(nèi)注射P.acnes，24 h后，耳廓出現(xiàn)嚴(yán)重的紅斑腫脹，表現(xiàn)出典型的炎癥癥狀。進(jìn)一步研究表明，P.acnes誘導(dǎo)小鼠耳廓痤瘡模型后，炎癥相關(guān)因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)明顯增加[11]。

在痤瘡的炎癥、免疫反應(yīng)過程中，TLR2信號(hào)通路一直是研究的熱點(diǎn)。研究表明，痤瘡患者外周血單核細(xì)胞TLR2表達(dá)水平較正常志愿者明顯增高，且IL-1β、IL-6等促炎因子也呈高表達(dá)，進(jìn)一步經(jīng)異維A酸治療1周后，TLR2及上述細(xì)胞因子的分泌顯著降低[12]。痤瘡患者P.acnes大量增殖后，經(jīng)TLR2信號(hào)通路可產(chǎn)生一系列炎癥相關(guān)因子，觸發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，研究者發(fā)現(xiàn)利用抗-TLR2中和抗體對(duì)此炎癥反應(yīng)起到一定阻斷作用，但并不能將其完全阻斷，阻斷作用大約為50%～60%。因此推斷存在其他信號(hào)通路和TLR2信號(hào)通路一起參與P.acnes誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答過程[13]。近來研究顯示NLR（NOD-like receptors）也參與了痤瘡的炎癥過程[14-15]，NLRP3屬于NLRs家族，可以與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）及含胱天蛋白酶1 前體（pro-caspase-1）形成一種多蛋白復(fù)合體，稱炎性小體，炎性小體可以使pro-caspase-1自身剪切為活化的Caspase-1，Caspase-1作為效應(yīng)分子可以進(jìn)一步將IL-1β前體剪接成成熟的IL-1β，而大量成熟的IL-1β的分泌則進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥相關(guān)疾病發(fā)生[16]。已有研究證實(shí)痤瘡患者皮損中NLRP3、Caspase-1及IL-1β較正常人增多;P.acnes誘導(dǎo)激活NLRP3炎性小體，成熟的Caspase-1，誘導(dǎo)IL-1β細(xì)胞因子大量分泌，研究人員進(jìn)一步通過基因沉默NLRP3炎性小體相關(guān)因子后，可以明顯抑制IL-1β的產(chǎn)生，通過靶向阻斷療法成功的減輕了P.acnes誘導(dǎo)的相關(guān)炎癥[17-19]。由此可見，NLRP3炎性小體也參與P.acnes誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的過程。

痤瘡在中醫(yī)屬“粉刺”或“肺風(fēng)粉刺”的范疇，治療則多以清瀉肺胃之熱、活血消腫散結(jié)為主[20-22]。陳福君等[23]通過探索桑葉的抗炎，證實(shí)桑葉具有顯著抑制由巴豆油導(dǎo)致的小鼠耳廓腫脹的療效，也能抑制醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加，減輕角叉菜膠所致的小鼠足跖浮腫。說明桑葉具有一定的抗炎作用，故對(duì)治療以炎癥為特點(diǎn)的痤瘡可能具有良好的作用。楊建雄等[24]研究發(fā)現(xiàn)柿葉黃酮有明顯的體外抗氧化作用。Sun等[25]實(shí)驗(yàn)證實(shí)柿葉總黃酮的抗氧化活性和抗過氧化物陰離子、羥基自由基和金屬螯合物的活性明顯強(qiáng)于蘆丁強(qiáng)。川芎能有效改善微循環(huán)、抑制腫脹。綜上，本凝膠制劑由桑葉柿葉及川芎制備而成，兼具抗菌、消炎、抗氧化、改善循壞，可對(duì)抑制痤瘡的炎癥起一定作用。

本研究建立小鼠痤瘡模型，經(jīng)復(fù)方桑葉消痤凝膠進(jìn)行干預(yù)治療，HE染色可見，復(fù)方桑葉消痤凝膠能減輕痤瘡模型的炎癥，改善表皮脊層增生;Real-time顯示皮損中NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA表達(dá)降低;western blot顯示皮損中TLR2、NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)降低。復(fù)方桑葉消痤凝膠對(duì)痤瘡小鼠的炎癥反應(yīng)起到明顯的抑制作用，該作用機(jī)理可能是通過TLR2通路抑制了痤瘡的炎癥，同時(shí)協(xié)同抑制NLRP3炎性小體的激活。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)復(fù)方桑葉消痤凝膠對(duì)TLR2、NLRP3、caspase-1、IL-1β的影響進(jìn)行了初探，旨在探索復(fù)方桑葉消痤凝膠治療痤瘡的作用機(jī)制，但痤瘡發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及到多條信號(hào)通路的共同作用，其中TLR2信號(hào)通路及NLRP3炎性小體是究竟通過何種協(xié)同作用參與痤瘡炎癥的抑制值得持續(xù)深入探索。

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（收稿日期：2021-08-27）