三葉青黃酮調(diào)節(jié)PI3K/Akt-eNOS信號(hào)通路對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制

吳琦

[關(guān)鍵詞] 三葉青黃酮;PI3K/Akt-eNOS信號(hào)通路;膀胱癌;細(xì)胞生物學(xué)行為

[中圖分類號(hào)] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）18-0031-04

Effects of cloverleaf flavonoids on biological behavior of bladder cancer cells by regulating PI3K/Akt-eNOS signaling pathway and its mechanism

WU Qi

Department of Urinary Surgery， Lishui People′s Hospital of Zhejiang Province， Lishui? ?323000， China

[Abstract] Objective To analyze the effects of cloverleaf flavonoids on the biological behavior of bladder cancer cells by regulating PI3K/Akt-eNOS signaling pathway and its mechanism. Methods The T24 cells in logarithmic growth phase were divided into the blank control group， the high concentration group and the low concentration group. The blank control group was cultured in the blank medium during treatment， and the cells in the high concentration group and the low concentration group were treated with 100 μg/mL and 50 μg/mL of cloverleaf flavonoids. The proliferation， apoptosis， migration and invasion activities of cells were detected， and the protein expression levels of PI3K， Akt， p-Akt， eNOS and β-actin were detected. Results Significant differences in the proliferation， apoptosis， migration and invasion activities of T24 cells were observed in the blank group， the low concentration group and the high concentration group， among which the proliferation， migration and invasion activities of T24 cells in the high concentration group were the lowest， and the apoptosis activity in the high concentration group was the highest， with statistical significance in pair comparisons between groups （P<0.05）. Hoechest staining results showed that the cell nuclei in the blank control group were relatively complete and uniform in color. Cell nuclei in the low concentration group and the high concentration group collapsed， lysed fragments and apoptotic bodies were visible， and the apoptosis of cells was increased with the increase of the drug concentration. Significant differences in the levels of PI3K， p-Akt and eNOS in T24 cells were observed of the blank control group， the low concentration group and the high concentration group， among which the levels of PI3K， p-Akt and eNOS in the high concentration group were the lowest， with statistical significance in pair comparisons between groups （P<0.05）. Conclusion Cloverleaf flavonoids can inhibit the proliferation， migration and invasion of bladder cancer cells by regulating PI3K/Akt-eNOS signaling pathway， and promote cell apoptosis.

[Key words] Cloverleaf flavonoids; PI3K/Akt-eNOS signaling pathway; Bladder cancer; Cell biological behavior

膀胱癌是現(xiàn)階段臨床中較為常見的泌尿生殖道惡性腫瘤，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅[1-2]。膀胱癌具有極強(qiáng)的遷移和侵襲能力，雖然采用手術(shù)治療可將患者的病灶切除，但膀胱癌患者術(shù)后極易復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者的術(shù)后五年生存率較低[3-4]。三葉青是目前最為常見的中草藥之一，具有較強(qiáng)的保肝和抗腫瘤效果，黃酮類成分是其主要的藥理成分[5-6]。三葉青黃酮對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901和乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞干預(yù)后，可顯著促進(jìn)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移和增殖[7]。動(dòng)物水平研究結(jié)果顯示，使用三葉青黃酮對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠治療后可有效抑制腫瘤增殖，降低腫瘤體積，延長小鼠生存期[8]。因而本研究分析三葉青黃酮對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

三葉青黃酮購買自成都曼斯特，RPMI 1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（含EDTA）購買自美國Gibco公司，Propidium Iodide、Annexin V-FITC、Hoechst 33258 熒光染料、PI3K抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、eNOS抗體、β-actin抗體、二抗抗體購買自美國CST公司，四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購買自上海生工科技，Transwell上室購買自康寧公司，ECL顯影液購買自美國密理博公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人膀胱癌T24細(xì)胞使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)，將細(xì)胞置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合率達(dá)80%后，胰蛋白酶消化處理并傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、高濃度組、低濃度組，其中空白組在處理時(shí)采用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)，高濃度組細(xì)胞在處理時(shí)采用100 μg/mL濃度三葉青黃酮干預(yù)，低濃度組采用50 μg/mL濃度三葉青黃酮干預(yù)。

1.3 細(xì)胞生物學(xué)行為檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)? 取對(duì)數(shù)生存期T24細(xì)胞，接種于96孔板中，依照分組分別使用空白培養(yǎng)基和三葉青黃酮干預(yù)，培養(yǎng)24 h后每孔20 μL ，MTT（5 mg/mL），細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后將上清棄去，加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩避光處理10 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔波長490 nm處吸光度值（OD490），計(jì)算各組細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞增殖率=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）-1。

1.3.2 細(xì)胞凋亡活性檢測(cè)? 取對(duì)數(shù)生存期T24細(xì)胞，接種于6孔板中，依照分組分別使用空白培養(yǎng)基和三葉青黃酮干預(yù)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，利用胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，加入Propidium Iodide和Annexin V-FITC避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 Hoechst 33258 熒光染色? 取對(duì)數(shù)生存期T24細(xì)胞，接種于96孔板中，依照分組分別使用空白培養(yǎng)基和三葉青黃酮干預(yù)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，將培養(yǎng)基棄去，加入固定液處理10 min，使用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，加入Hoechst 33258 熒光染色避光孵育5 min，顯微鏡下490 nm激發(fā)光下觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.3.4 細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲? 取對(duì)數(shù)生存期T24細(xì)胞，接種于Transwell上室中，其中細(xì)胞遷移不使用Matigel基質(zhì)膠包被小室，細(xì)胞侵襲使用Matigel基質(zhì)膠包被小室，后依照分組在Transwell小室上室分別使用空白培養(yǎng)基和三葉青黃酮干預(yù)，下室加入600 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，將培養(yǎng)基棄去，使用4%多聚甲醛固定10 min，將甲醛丟棄，結(jié)晶紫染色3 min，將未穿過小室膜細(xì)胞擦除，使用顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞遷移率和細(xì)胞侵襲率，細(xì)胞遷移率=（劃線寬度-遷移后寬度）/劃線寬度×100%，細(xì)胞侵襲率=侵襲細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.5 western blot檢測(cè)? 取對(duì)數(shù)生存期T24細(xì)胞，接種于96孔板中，依照分組分別使用空白培養(yǎng)基和三葉青黃酮干預(yù)，后細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，將培養(yǎng)基棄去，使用細(xì)胞裂解液制備細(xì)胞蛋白，采用BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白含量，使用SDS-PAGE電泳法分離蛋白，利用恒流法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入PI3K、Akt、p-Akt、eNOS、β-actin一抗抗體孵育過夜，使用TBST洗滌3次，采用二抗抗體孵育2 h后，采用ECL發(fā)光液處理，使用天能顯影儀檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0和Graphpad軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，利用方差檢驗(yàn)分析多組間計(jì)量資料差異，使用ImageJ軟件分析westernblot檢測(cè)圖，采用Flowjo軟件分析流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果

本組研究結(jié)果顯示，空白組、低濃度組和高濃度組T24細(xì)胞增殖活性存明顯差異，其中高濃度組細(xì)胞增殖活性最低，且組間兩兩比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

本組研究結(jié)果顯示，空白組、低濃度組和高濃度組T24細(xì)胞凋亡活性存在明顯差異，其中高濃度組細(xì)胞凋亡活性最高，且組間兩兩比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Hoechest染色結(jié)果顯示，空白組細(xì)胞細(xì)胞核相對(duì)較為完整，且顏色均一，低濃度組和高濃度組細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)坍縮，出現(xiàn)裂解碎塊并可見凋亡小體，且隨給藥濃度增高，細(xì)胞凋亡越高。見表2和封三圖2。

2.3 細(xì)胞遷移和侵襲率檢測(cè)結(jié)果

本組研究結(jié)果顯示，空白組、低濃度組和高濃度組T24細(xì)胞遷移和侵襲活性存在明顯差異，其中高濃度組細(xì)胞遷移和侵襲活性最低，且組間兩兩比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4 細(xì)胞PI3K/Akt-eNOS信號(hào)通路檢測(cè)結(jié)果

本組研究結(jié)果顯示，空白組、低濃度組和高濃度組T24細(xì)胞PI3K、p-Akt、eNOS水平存在明顯差異，其中高濃度組細(xì)胞PI3K、p-Akt、eNOS水平最低，且組間兩兩比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

膀胱癌是現(xiàn)階段臨床中最為常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，目前臨床中在對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行治療時(shí)主要采用化療方案進(jìn)行干預(yù)治療，但常規(guī)化療方案由于其存在較大的不良反應(yīng)，且膀胱癌細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致患者化療效果較差，導(dǎo)致患者易出現(xiàn)復(fù)發(fā)[9]。因此，目前臨床中采用包括三葉青在內(nèi)的傳統(tǒng)中藥對(duì)患者進(jìn)行輔助治療，實(shí)現(xiàn)直接殺腫瘤細(xì)胞、增強(qiáng)化療藥物的效果，并通過輔助化療可降低患者不良反應(yīng)，降低膀胱癌患者治療后復(fù)發(fā)率，提高膀胱癌患者生存率，已成為目前臨床研究熱點(diǎn)[10]。

黃酮是三葉青中十分重要的藥理活性成分，有研究指出三葉青黃酮具有較好的抗炎作用，且對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖也具有良好的抑制效果[11]。三葉青黃酮屬于黃酮類化合物，其具有多種生物學(xué)效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)三葉青黃銅具有明確的抗炎癥、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用[12]。有學(xué)者指出，三葉青黃酮可通過降低細(xì)胞侵襲和遷移，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長作用[13]。此外，三葉青黃酮還具有副作用小、毒性低、抗腫瘤譜寬特點(diǎn)，是潛在的具有廣泛應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物之一[14]。但目前針對(duì)三葉青黃酮對(duì)腫瘤的影響研究多集中在肝癌和胃癌等領(lǐng)域，其對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及其作用機(jī)制目前仍未見報(bào)道[15]。本組研究結(jié)果顯示，膀胱癌細(xì)胞使用三葉青黃酮干預(yù)治療后，可有效抑制T24細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加速細(xì)胞核坍縮，并降低腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力。結(jié)果提示，三葉青黃酮對(duì)膀胱癌也具有明確的抗腫瘤作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，與前人研究結(jié)果基本類似，但其作用機(jī)制尚未明確。

PI3K是目前已知的重要的原癌基因之一，其屬于磷脂酰肌醇與肌醇的重要的激酶。生理狀態(tài)下，PI3K存在兩種激活形式，一種是通過p110和Ras結(jié)合活化PI3K，另一種使用通過與連接蛋白或酪氨酸殘基的生長因子受體磷酸化并相互作用，改變二聚體構(gòu)象而被激活[16]。有研究指出，PI3K活化后會(huì)使Akt轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，并催化Akt發(fā)生自身磷酸化而被激活[17-18]。PI3K/Akt信號(hào)通路激活后，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)p-Akt水平升高，繼發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞中并參與腫瘤細(xì)胞的翻譯、轉(zhuǎn)錄、代謝、細(xì)胞周期、凋亡、血管新生等多種生理或病理過程的調(diào)控[19]。有研究指出，在膀胱癌患者體內(nèi)可見膀胱癌病變組織中PI3K/Akt通路呈異常激活狀態(tài)[20]。本組研究結(jié)果顯示，采用三葉青黃酮干預(yù)后可有效降低膀胱癌細(xì)胞中Akt蛋白磷酸化水平，有效降低細(xì)胞中PI3K和eNOS水平，結(jié)果表明，使用三葉青黃酮干預(yù)后可有效抑制PI3K/Akt-eNOS信號(hào)通路。且基于本組研究結(jié)果推測(cè)認(rèn)為，三葉青黃酮可通過調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞中PI3K/Akt-eNOS信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而起到對(duì)抗膀胱癌的作用。

綜上所述，三葉青黃酮可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt-eNOS信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但本研究并未對(duì)三葉青黃酮處理后膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的基因水平差異進(jìn)行探討和分析，有待后續(xù)繼續(xù)分析。

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（收稿日期：2021-01-02）