蜂毒組成分析方法的研究*

王彩肖，任風(fēng)芝，陳若塵，張向彬，張 彥，高彩杰，劉建芬，李麗紅

(1 華北制藥華坤河北生物技術(shù)有限公司，河北 石家莊 050000；2 華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050000)

蜂毒是工蜂毒腺分泌的一種具有芳香氣味的成分復(fù)雜的混合物，主要含有蛋白質(zhì)多肽類、酶類、生物胺類和其它物質(zhì)，其中蜂毒肽約占蜂毒干重的50%，是蜂毒中主要功能物質(zhì)[1]。蜂毒具有豐富的生物活性物質(zhì)，是天然藥物開發(fā)利用的良好資源，被廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等疾病的治療[2]，但因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜易引起藥物穩(wěn)定性的問題[3]，因此需要采用不同的分析方法研究不同來源的蜂毒在蛋白多肽組成上的差異，以期為今后蜂毒的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)方法采用銀染的方法進(jìn)行分離[4]，銀染法分辨率高，可以識別0.5 mg/kg以上的不同蛋白，這樣可以準(zhǔn)確識別出不同的樣品中的蛋白分布。分子排阻色譜-高效液相色譜法(SEC-HPLC)可以定量蛋白質(zhì)的分布及純度，檢測靈敏度高、速度快[5-6]。質(zhì)譜分析具有高靈敏、高準(zhǔn)確、高通量特性，為蛋白質(zhì)學(xué)領(lǐng)域提供了高質(zhì)量的研究分析手段，目前已有報(bào)道應(yīng)用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析，證明高分辨質(zhì)譜有其強(qiáng)大的高分辨率和高性能，適用于肽段和蛋白質(zhì)的組學(xué)分析[7-8]。

本研究擬采用不同的分析手段，包括聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、分子排阻色譜-高效液相色譜法(SEC-HPLC)、高分辨率質(zhì)譜法(HRMS)分別對4個(gè)不同來源的粗蜂毒樣品進(jìn)行蛋白多肽組分的差異性分析，及利用高效液相色譜法(HPLC)分析其蜂毒肽含量的差異性，從而希望能為后期蜂毒的開發(fā)利用提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

蜂毒，市售；12%預(yù)制膠，Invitrogen；Marker，Thermo；10×PBS，Sigma；銀染試劑盒，Thermo；乙腈(色譜純)，Honeywell；冰醋酸(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；甲酸(色譜純)，Merck；三氟乙酸(色譜純)，Honeywell；蜂毒肽標(biāo)準(zhǔn)品(≥97%，HPLC)，aladdin；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，自制。

表1 樣品信息Table 1 The sample information

1.1.2 儀器與設(shè)備

PowerPac Basic Power Supply1645050電泳儀，美國Bio-Rad；e2695高效液相色譜儀，美國Waters；LC-2030C Plus高效液相色譜儀，日本島津；高分辨率質(zhì)譜儀(QE)，美國Thermo，超純水機(jī)，美國Pall。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SDS-PAGE方法

實(shí)驗(yàn)采用12%的預(yù)制膠，60 V的電壓進(jìn)行電泳，上樣量為25 μL，電泳結(jié)束后選擇銀染色法進(jìn)行固定、染色與脫色。

樣品溶液：稱取適量蜂毒，用1×PBS溶液溶解稀釋成 1.0 mg/mL的溶液。

1.2.2 SEC-HPLC方法

色譜柱：Shodex PROTEIN KW-802.5(8.0×300 mm， 5 μm)；流動相：將乙腈、水與冰醋酸按300:400:200的比例混合，用濃氨水(25%～30%)調(diào)pH至3.0，然后用水稀釋至1000 mL；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：UV276 nm；進(jìn)樣量：100 μL。

樣品溶液：稱取適量蜂毒，用水溶解稀釋成1.0 mg/mL的溶液。

1.2.3 HRMS方法

色譜條件：使用超高效液相色譜儀，色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18Column(2.1×100 mm，1.7 μm)；流動相：A-0.1%的甲酸水溶液，B-0.1%的甲酸乙腈溶液，梯度洗脫(0～2.5 min：10%B；2.5～5.5 min：10%～50%B； 5.5～12.5 min，50%～80%B；12.5～13 min，80%～10%B；13～15 min，10%B)；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.4 mL/min；檢測波長：214/254nm。

質(zhì)譜條件：使用高分辨質(zhì)譜儀，離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子模式；噴霧電壓：3.5 kV；透鏡電壓：50 V；輔助氣體流速：5 L/min毛細(xì)管溫度：320 ℃；分辨率：70000；掃描范圍：200～2000 m/z。

樣品溶液：稱取適量蜂毒，用水溶解稀釋成0.25 mg/mL的溶液。

1.2.4 HPLC方法

色譜柱：UniPS 5-300(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：A-0.1%的三氟乙酸水溶液，B-0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脫(0～15 min：30%～50%B；15～20 min，50%～30%B)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm。

樣品溶液：稱取適量蜂毒，用水溶解稀釋成1.0 mg/mL的溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE方法

SDS-PAGE是定性分析蛋白質(zhì)最常用的電泳方法，從樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果的電泳圖譜(圖1)中可以看出凝膠背景清晰，蛋白條帶分辨率高。

圖1 SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE test results

由圖1可知，蜂毒蛋白質(zhì)的表達(dá)條帶較多，蛋白質(zhì)分子量在1.7～40 kDa之間在樣品中所占比例較大，是樣品中的主要成分，蜂毒各主條帶沒有明顯差異；在分子量大于40 kD范圍內(nèi)，不同蜂毒中呈現(xiàn)出不同的蛋白條帶結(jié)果，這表明不同來源的蜂毒在蛋白組成上存在差異性，可對存在差異性的目標(biāo)成分進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，為今后蜂毒的開發(fā)及藥用研究奠定基礎(chǔ)。

2.2 SEC-HPLC方法

通過SEC-HPLC測定蜂毒的組分差異性，實(shí)驗(yàn)采用兩根串聯(lián)的色譜柱(Shodex PROTEIN KW-802.5，8.0×300 mm， 5 μm)，詳細(xì)結(jié)果見圖2和表2。

圖2 SEC-HPLC檢測結(jié)果Fig.2 SEC-HPLC test results

表2 SEC-HPLC結(jié)果匯總Table 2 Summary of SEC-HPLC results

蜂毒樣品在20～40 min內(nèi)，有5個(gè)肽類成分得到良好的分離，其中峰5為蜂毒肽I單體，以峰面積占比作為主要特征峰標(biāo)準(zhǔn)。由表2和圖2可知，不同來源的蜂毒比較，高分子蛋白的含量與分布在1、2、4的位置上明顯差異，這表明蜂毒樣品之間組成成分存在明顯差異，因此，高分子蛋白的方法可用于后期樣品的研究工作中。

2.3 HRMS方法

實(shí)驗(yàn)采用HRMS方法對不同蜂毒進(jìn)行分析，對樣品中有關(guān)物質(zhì)的分子量進(jìn)行分析，確認(rèn)樣品差異性，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3和表3。

圖3 HRMS方法結(jié)果圖譜(TIC圖)Fig.3 Results of HRMS method (TIC diagram)

表3 HRMS結(jié)果匯總Table 3 Summary of HRMS results

從圖3和表3中可知，蜂毒的成分復(fù)雜，主峰位于RT6. 16～6.42 min內(nèi)，為蜂毒肽單體，其分子量為2845.8 Da。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在RT 5.43～5.60 min區(qū)間內(nèi)，蜂毒-1，2，3樣品中的多聚體(分子量為16132.5 Da)明顯多于蜂毒-4(2021004)；RT 6.53 min左右，各個(gè)樣品中的分子量分布明顯不同，這也表明蜂毒樣品之間組成成分存在明顯差異，可作為后續(xù)對蜂毒樣品分析研究的依據(jù)。

2.4 HPLC方法

實(shí)驗(yàn)采用HPLC方法對不同蜂毒樣品中的主成分蜂毒肽的含量進(jìn)行分析，確認(rèn)樣品差異性，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4和表4。

圖4 HPLC方法結(jié)果圖譜Fig.4 Results of HPLC method

表4 蜂毒肽含量結(jié)果匯總Table 4 Summary of melittin content results

本實(shí)驗(yàn)利用HPLC法，對4個(gè)蜂毒樣品中蜂毒肽的含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，來源不同的蜂毒樣品中的蜂毒肽含量存在明顯差異。蜂毒肽是蜂毒中的主要成分，根據(jù)蜂毒肽的含量可以為后期蜂毒樣品質(zhì)量性研究及為進(jìn)一步研究和開發(fā)蜂毒產(chǎn)品提供分析依據(jù)。

3 結(jié) 論

本研究運(yùn)用SDS-PAGE、SEC-HPLC和HRMS技術(shù)對蜂毒中的蛋白多肽組分的差異性進(jìn)行了一些基礎(chǔ)分析，及利用HPLC技術(shù)對蜂毒肽含量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示這些分析方法可以檢測出蜂毒中蛋白多肽分子的差異性，可用于后期的深入研究中。由于蜂毒的化學(xué)成分體系非常復(fù)雜，其質(zhì)量可能會受多種因素的影響，如物種來源、養(yǎng)殖環(huán)境、采集方法等，而且蜂毒原料與臨床應(yīng)用上的用藥功效及安全性都有著緊密的聯(lián)系，為了保證蜂毒及其相關(guān)制劑在臨床上的穩(wěn)定性和安全有效性，因此，有必要選擇合適的分析方法用于研究蜂毒的組分差異性，為今后蜂毒的質(zhì)量分析及開發(fā)利用等方面提供技術(shù)支撐。