GLP1R基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)及血糖、血脂、胰島功能的關(guān)系

鄭文文，鄭超，周心禾

1.嘉興市第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 嘉興 314001；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 杭州 310009；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325027

胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）主要由小腸遠(yuǎn)端和近端結(jié)腸的腸道L細(xì)胞分泌，由胰高血糖素原基因編碼，是一種由30個(gè)氨基酸組成的多肽[1-2]。GLP-1的特異性靶點(diǎn)為胰高血糖素樣肽1受體（glucagon-like peptide-1 receptor, GLP1R），GLP-1通過與GLP1R結(jié)合，以葡萄糖依賴方式促進(jìn)胰島素分泌，從而維持機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)[3]。因此，GLP1R功能受損將會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的功能障礙。

編碼GLP1R的人類GLP1R基因定位于6號(hào)染色體的短臂（chr 6p21），包含13個(gè)外顯子[4]。其基因多態(tài)性的發(fā)生可能導(dǎo)致GLP1R的結(jié)構(gòu)改變，從而使得GLP1R出現(xiàn)功能障礙[5]。在HapMap II期數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.hapmap.org）中，共鑒定出33個(gè)單倍型標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）位點(diǎn)。本研究選擇其中3個(gè)位點(diǎn)，即rs3765467、rs2268657和rs6923761，目前有關(guān)該3個(gè)位點(diǎn)的研究數(shù)據(jù)在我國(guó)十分有限。本研究通過探討GLP1R基因rs3765467、rs2268657和rs6923761多態(tài)性與中國(guó)漢族人群2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus, T2DM）及血糖、血脂、胰島功能的相關(guān)性，為T2DM的病因診斷、治療及預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2016年3月至2018年6月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的T2DM患者526例，其中男286例，女240例，均符合WHO（1999年）診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除1型糖尿病、特殊類型糖尿病、嚴(yán)重肝腎功能損害者、腫瘤等疾病。選取健康志愿者334例作為對(duì)照組，其中男183例，女151例。本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 臨床及生化檢測(cè) 記錄研究對(duì)象的年齡、性別，并測(cè)量身高、體質(zhì)量，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index, BMI）。留取所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血，由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科專人測(cè)定空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、甘油三酯（triglyceride, TG）、總膽固醇（total cholesterol, TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）。另外留取T2DM患者空腹及餐后2 h靜脈血，檢測(cè)空腹C肽（fasting plasma C-peptide, FP-C）、餐后2小時(shí)血糖（2-hour postprandial blood glucose, 2hPG）、餐后2小時(shí)C肽（2 hours postprandial C-peptide, 2hP-C），并根據(jù)FBG及FP-C水平通過HOMA2 calculator（www.dtu.ox.ac.uk/homacalculator/index.php）軟件計(jì)算獲得胰島β細(xì)胞功能指數(shù)（HOMA-β），胰島素敏感指數(shù)（HOMA-IS）以及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。

1.3 基因組DNA提取及檢測(cè) 留取所有研究對(duì)象的2 mL外周靜脈血，置于乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）抗凝管中，按照DNeasy血液/組織基因組DNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）說明書提取樣本DNA。應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR, KASP）技術(shù)檢測(cè)GLP1R基因rs3765467、rs2268657和rs6923761三個(gè)位點(diǎn)的基因型。步驟如下：先把所有DNA樣本進(jìn)行質(zhì)檢，將質(zhì)檢合格的DNA稀釋至濃度為5 ng/μL。取2 μL DNA樣本，55 ℃ 45 min烘干，并配置混合物（mix），3 μL體系[包括引物mix及2X KASP master mix（北京梓熙生物科技有限公司）]，在ABI 7900儀器上進(jìn)行預(yù)讀，然后在ABI 7900 PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)，94 ℃ 5 min，94 ℃ 20 s，61 ℃ 1 min，10個(gè)循環(huán)；94℃ 20 s，55 ℃ 1 min，26個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min。最后進(jìn)行基因分型和判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?；蛐皖l率分布作Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；計(jì)量資料中符合正態(tài)分布，采用±s表示，不符合正態(tài)分布，采用M（P25，P75）表示，分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T2DM組與對(duì)照組一般資料與生化指標(biāo)比較 T2DM組與對(duì)照組在性別、LDL-C、HDL-C方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；T2DM組的年齡、BMI、TG、TC、FBG、HbA1c水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 T2DM組與對(duì)照組的臨床指標(biāo)比較

2.2 各SNP位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) GLP1R基因rs3765467（C＞T）、rs2268657（G＞A）、rs6923761（G＞A）三個(gè)位點(diǎn)分布情況見表2。對(duì)對(duì)照組中該三個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，三個(gè)基因位點(diǎn)分布符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.782、0.570、0.759），提示研究樣本具有群體代表性。

2.3 各SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布 T2DM組GLP1R基因：rs3765467位點(diǎn)CC基因型和C等位基因的頻率均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。在隱性模型中，T2DM組GLP1R基因rs3765467位點(diǎn)CC基因型頻率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表2 GLP1R基因各位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布[例（%）]

表3 兩種遺傳模型中GLP1R基因各位點(diǎn)基因型頻率分布[例（%）]

2.4 T2DM影響因素的Logistic回歸分析結(jié)果 以是否發(fā)生T2DM作為因變量，以rs3765467隱性模型、年齡、性別、BMI、TG、TC為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，Logistic回歸模型在調(diào)整了年齡、性別、BMI、TG、TC后，rs3765467位點(diǎn)CC基因型是T2DM發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，攜帶CC基因型患者發(fā)生T2DM的風(fēng)險(xiǎn)是CT或TT基因型攜帶者的1.724倍（OR=1.724，95%CI=1.217～2.443，P= 0.002），見表4。

表4 T2DM影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.5 GLP1R基因多態(tài)性與BMI、血脂、血糖代謝關(guān)系 在隱性模型中，GLP1R基因（rs3765467、rs2268657、rs6923761）的基因型與BMI、血糖、血脂之間的關(guān)系見表5。在GLP1R基因rs3765467位點(diǎn)中，CC基因型HbA1c水平高于CT+TT基因型（t= -2.517，P=0.012）；而在GLP1R基因rs2268657位點(diǎn)中，GG基因型HDL-C水平顯著高于GA+AA基因型（t= -2.162，P=0.031）。

2.6 T2DM組中GLP1R基因rs3765467位點(diǎn)胰島功能情況 在T2DM組中，GLP1R基因rs3765467位點(diǎn)CC基因型的FP-C、HOMA-β、HOMA-IR水平均低于CT+TT基因型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.978，P=0.048；t=2.308，P=0.021；t=2.012，P=0.045），見表6。

表6 T2DM組中GLP1R基因rs3765467位點(diǎn)胰島功能比較

3 討論

已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)GLP1R基因多態(tài)性與T2DM、肥胖、胰島素分泌、GLP1R受體激動(dòng)劑藥物療效等具有相關(guān)性[6-8]。在我國(guó)鮮有研究發(fā)現(xiàn)GLP1R基因rs3765467、rs2268657、rs6923761三個(gè)位點(diǎn)與T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而有關(guān)其對(duì)代謝指標(biāo)以及胰島功能影響的研究更是少見。本研究采用病例-對(duì)照研究對(duì)中國(guó)漢族人群T2DM的GLP1R基因三個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性的分布特點(diǎn)及對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GLP1R基因rs3765467位點(diǎn)基因多態(tài)性與T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)，經(jīng)過Logistic回歸分析校正混雜因素后，發(fā)現(xiàn)攜帶CC基因型者患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶CT+TT基因型者的1.724倍，表明CC基因型是T2DM的危險(xiǎn)因素。但本研究未發(fā)現(xiàn)rs2268657、rs6923761與T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，這可能是由于樣本量較少且不同種族中這些位點(diǎn)的表達(dá)存在差異，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量予以驗(yàn)證。

進(jìn)一步研究GLP1R基因三個(gè)位點(diǎn)與血糖、血脂等代謝指標(biāo)的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，rs3765467位點(diǎn)CC基因型HbA1c水平明顯高于CT+TT基因型；rs2268657位點(diǎn)GG基因型HDL-C水平顯著高于GA+AA基因型。這在既往研究中亦有類似報(bào)道，DE LUIS等[9]關(guān)于肥胖人群的研究發(fā)現(xiàn)，與rs6923761位點(diǎn)GG基因型人群相比，GA/AA基因型人群具有更優(yōu)的BMI、TG和HDL-C水平。李蕊等[10]的研究則發(fā)現(xiàn)，在T2DM人群中，攜帶rs10305420位點(diǎn)CC基因型者的HDL-C水平明顯高于CT/TT基因型者；攜帶rs3765467位點(diǎn)GG基因型者的TG水平顯著低于GA/AA基因型者。但本研究發(fā)現(xiàn)的GLP1R基因位點(diǎn)與血糖、血脂的關(guān)系與以往的研究不同，補(bǔ)充了既往研究。上述研究表明GLP1R基因變異可能會(huì)影響機(jī)體的血糖、血脂代謝。

GLP-1通過與胰島、腸道、腦、肺、腎臟、下丘腦、心臟等器官上的GLP1R結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的作用。GLP1R是G蛋白偶聯(lián)受體B1家族成員，主要在胰島β細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，含有463個(gè)氨基酸[11]。在胰島上，GLP-1與胰島β細(xì)胞上的GLP1R結(jié)合，激活環(huán)磷酸腺苷酶依賴的蛋白激酶A信號(hào)通路，從而促進(jìn)胰島素釋放，抑制胰高血糖素分泌，抑制胰島β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖[12]。因此，GLP1R基因變異可能改變GLP1R對(duì)體內(nèi)GLP-1的反應(yīng)。GLP1R基因rs3765467位點(diǎn)是目前發(fā)現(xiàn)的與GLP1R功能改變相關(guān)的SNPs之一，該突變是由谷氨酰胺取代了第131位精氨酸[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)rs3765467位點(diǎn)與胰島β細(xì)胞功能相關(guān)。LI等[13]通過研究Roux-en-Y胃旁路術(shù)后的肥胖T2DM患者發(fā)現(xiàn)rs3765467位點(diǎn)可能通過削弱GLP-1與GLP1R的相互作用導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙和凋亡。NISHIYA等[14]研究也發(fā)現(xiàn)在高能量攝入的日本男性研究者中攜帶rs3765467位點(diǎn)GG基因型者HOMA-β水平明顯低于AA+AG基因型者，提示GG基因型可能是降低胰島素分泌的重大風(fēng)險(xiǎn)。本研究在對(duì)攜帶rs3765467位點(diǎn)的T2DM患者分析中發(fā)現(xiàn)，攜帶CC基因型者空腹C肽、HOMA-β水平顯著低于CT+TT基因型者，表明CC基因型可能是胰島β細(xì)胞功能障礙，胰島素分泌下降的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。這與既往研究結(jié)果相符。而CT+TT基因型患者HOMA-IR水平明顯高于CC基因型患者，提示攜帶CT+TT基因型者可能更容易出現(xiàn)胰島素抵抗。這在既往研究中尚未發(fā)現(xiàn)，期待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來(lái)研究明確。

綜上所述，本研究初步探討了GLP1R基因多態(tài)性與T2DM之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GLP1R基因rs3765467位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群T2DM的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，且相關(guān)位點(diǎn)與血糖、血脂及胰島功能存在一定關(guān)聯(lián)。