一測(cè)多評(píng)法測(cè)定舒膽片中5種成分的含量

籍瑞芳 孟德新

1.濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心中藥檢驗(yàn)科，山東濟(jì)南 250102；2.濟(jì)南市章丘區(qū)中醫(yī)醫(yī)院門診中藥房，山東濟(jì)南 250200

舒膽片是由大黃、虎杖、芒硝、梔子等九味藥材經(jīng)煎煮、制粒、顆?；旌隙瞥傻钠瑒?，具有清熱化濕、利膽排石，行氣止痛的功效[1]。在臨床上主要用于急慢性膽囊炎的治療，聯(lián)合拉氧頭孢鈉使用，可顯著提升治療效果[2-4]。舒膽片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二十冊(cè)中[1]，該標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)大黃和梔子苷進(jìn)行了薄層鑒別，未對(duì)任何成分進(jìn)行定量分析，無(wú)法準(zhǔn)確反映其質(zhì)量水平。舒膽片中的君藥大黃和佐藥虎杖含有多種蒽醌類物質(zhì)，多為蒽醌的羥基、羧甲基、甲氧基和羧基衍生物，是其主要的藥效成分[5-9]。本研究采用一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components with a single-marker，QAMS），測(cè)定舒膽片中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量，以期全面了解舒膽片中的活性成分，為研究舒膽片的臨床藥理特性提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2030 Plus 高效液相色譜儀（日本島津公司）；METTLER TOLEDO MS204TS/02（瑞士梅特勒公司）；MS205DU 電子天平（瑞士梅特勒公司）；DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 對(duì)照品與試劑

蘆薈大黃素（110795-201308，含量97.8%），大黃酸（110757-201607，含量99.3%），大黃素（110756-201512，含量98.7%），大黃酚（110796-201922，含量99.4%），大黃素甲醚（110758-201616，含量99.0%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

樣品：舒膽片（陜西漢王藥業(yè)有限公司，批號(hào)：004001、006001、010003、011003、012003）。

試劑：流動(dòng)相用甲醇為色譜級(jí)（美國(guó)TEDIA）；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品，加甲醇制成每1 毫升含蘆薈大黃素9.9365 μg、大黃酸9.5824 μg、大黃素108.2739 μg、大黃酚43.8950 μg 和大黃素甲醚19.1268 μg 的混合溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。再精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5 ml 至10 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取舒膽片樣品20 片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5 ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 ml，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3 次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：Shimadzu VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；流速為1.0 ml/min；柱溫為35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；進(jìn)樣量為10 μl。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和“2.2”項(xiàng)下方法制得的供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的色譜峰分離度良好，均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于5000。用二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)供試品溶液中5 個(gè)成分的色譜峰進(jìn)行峰純度檢查，均符合要求。

圖1 混合對(duì)照品溶液和供試品溶液的HPLC 圖譜

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 ml 至10 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成不同濃度的對(duì)照品溶液。分別按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)X，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚這5 種成分在各自濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

表1 5 種成分線性關(guān)系的測(cè)定結(jié)果

2.4.3 精密度考察 取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積的RSD 依次為：0.072%、0.091%、0.021%、0.054%和0.069%。表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 取舒膽片樣品（批號(hào)010003），按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、8、12、18 和24 h 進(jìn)樣。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積的RSD依次為：1.10%、0.99%、1.28%、1.03%和0.75%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性考察 取同一批號(hào)舒膽片樣品（批號(hào)010003），按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。計(jì)算出6 份樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD 依次為1.67%、1.92%、1.90%、1.67%和1.68%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的舒膽片樣品（批號(hào)010003）6 份，每份0.25 g，精密稱定，分別精密加入“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液10.0 ml，按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液。按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。計(jì)算出蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均加樣回收率依次為95.22%、96.46%、98.29%、97.90%和95.88%。RSD 依次為1.14%、1.12%、0.76%、0.54%和0.71%。表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5 相對(duì)校正因子的確定

2.5.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算 取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件，依次進(jìn)樣2、5、10、12、15、20 μl。以大黃素為內(nèi)參物（s），分別計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚的相對(duì)校正因子（用f 表示）。計(jì)算公式為f=（ck/Ak）/（cs/As）（ck、cs 為待測(cè)成分和內(nèi)參物的濃度；Ak、As 為待測(cè)成分和內(nèi)參物的峰面積）[10-12]。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 4 種成分相對(duì)校正因子

2.5.2 相對(duì)校正因子耐用性考察 取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別使用2 臺(tái)不同品牌的HPLC 儀和3 種不同品牌的C18色譜柱，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算各成分相對(duì)校正因子和RSD，結(jié)果見(jiàn)表3 所示。不同品牌的HPLC 儀和C18色譜柱所得的相對(duì)校正因子的RSD 均小于5.0%，表明各成分相對(duì)校正因子的系統(tǒng)耐用性良好。

表3 不同儀器和色譜柱的相對(duì)校正因子

2.5.3 待測(cè)成分色譜峰的定位 根據(jù)“2.5.2”項(xiàng)下所得色譜圖，分別計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚與大黃素的相對(duì)保留時(shí)間（用r 表示），通過(guò)相對(duì)保留時(shí)間即可對(duì)樣品中的待測(cè)成分進(jìn)行定位確認(rèn)[13-15]。并且考察相對(duì)保留時(shí)間在不同HPLC 儀和不同C18色譜柱中的耐用性。結(jié)果見(jiàn)表4。不同品牌的HPLC 儀和C18色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間有影響，但RSD 均小于5.0%，表明各成分的相對(duì)保留時(shí)間耐用性較好，可用于待測(cè)成分色譜峰的定位。

表4 不同儀器和色譜柱的相對(duì)保留時(shí)間

2.6 QAMS 與外標(biāo)法（external standard method，ESM）含量測(cè)定結(jié)果的比較

將5 批舒膽片樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。分別采用QAMS 法和ESM 法計(jì)算樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明QAMS 法與ESM 法測(cè)得各成分的含量無(wú)顯著差異，提示QAMS 法可用于舒膽片中多成分的質(zhì)量分析。

表5 ESM 與QAMS 測(cè)定舒膽片中5 種成分的含量

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本研究考察了不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-甲醇-磷酸溶液系統(tǒng)。當(dāng)有機(jī)相比例較低時(shí)，各成分保留時(shí)間較長(zhǎng)，不利于批量分析，甲醇濃度為85%時(shí)保留時(shí)間適中，分離度良好；0.1%磷酸溶液有助于改善峰形；一定比例的乙腈-甲醇-磷酸溶液也可以實(shí)現(xiàn)良好的分離，但是本著簡(jiǎn)單實(shí)用的原則，最終選用甲醇-磷酸溶液（85∶15）。

3.2 供試品溶液的制備方法優(yōu)化

由于游離型蒽醌常與糖苷類物質(zhì)結(jié)合生成結(jié)合蒽醌化合物[16]，所以本研究采用將結(jié)合蒽醌化合物酸解后測(cè)定游離蒽醌總量的方法。根據(jù)文獻(xiàn)[17-20]比較了直接加入甲醇-鹽酸進(jìn)行水解和提取的方法，該方法得到的供試品溶液，在色譜分析時(shí)，雜質(zhì)峰較多，干擾主成分分析。最終采用先用甲醇提取然后加入鹽酸和三氯甲烷加熱回流進(jìn)行水解，最后再用三氯甲烷萃取的方法。在對(duì)本文采用的制備方法進(jìn)行考察時(shí)，對(duì)比了超聲和加熱回流的提取方法，對(duì)比了加熱回流的時(shí)間0.5、1、2 h，結(jié)果表明加熱回流提取1 h 效果最佳。

本研究所建立的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，減少了對(duì)照品的用量，降低了實(shí)驗(yàn)成本，可作為全面分析舒膽片中蒽醌類物質(zhì)的檢測(cè)方法。