果蠅永久制片開發(fā)及在遺傳學(xué)實(shí)驗教學(xué)中的應(yīng)用

王洪預(yù) 劉佳欣 宋慧寧 陳浩源 趙占名 趙磊 劉宏魁 李秋祝

(吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

遺傳學(xué)是當(dāng)今生命科學(xué)中發(fā)展最快、最活躍的學(xué)科之一，是生物學(xué)科各專業(yè)的重要基礎(chǔ)課[1]。溫帶生物黑腹果蠅(Drosophila melanogaster，2n=8)作為遺傳學(xué)研究中的模式生物，在遺傳、發(fā)育、衰老、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域的研究中具有重要地位。以果蠅為材料的遺傳學(xué)實(shí)驗，可覆蓋分離規(guī)律、自由組合規(guī)律和獨(dú)立分配規(guī)律，是中學(xué)及高校本科生物學(xué)實(shí)驗教學(xué)中重要的實(shí)驗對象[2]?！懊系聽柕耐愣闺s交實(shí)驗”是人教版生物學(xué)教材必修內(nèi)容[3]，也是高校遺傳學(xué)實(shí)驗教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。用豌豆作為材料進(jìn)行實(shí)驗受制于實(shí)驗條件和時間，學(xué)生無法親手操作完成。因此，在遺傳學(xué)3大規(guī)律的驗證性實(shí)驗中，果蠅一直都是首選實(shí)驗材料[4]。果蠅作為經(jīng)典的遺傳學(xué)實(shí)驗材料有其突出優(yōu)點(diǎn)，主要表現(xiàn)在5個方面，生長迅速，世代周期短；繁殖力強(qiáng)，后代數(shù)量大，便于統(tǒng)計分析；個體小，飼養(yǎng)管理方便；變異類型多，易于觀察和雜交組合；有巨大型染色體，且數(shù)目較少(2n=8)，便于觀察研究[5]。對果蠅進(jìn)行性狀觀察和性別鑒定是果蠅實(shí)驗重要內(nèi)容，也是進(jìn)行遺傳規(guī)律實(shí)驗前必須熟練掌握的技能。初學(xué)者往往因?qū)嶒灲?jīng)驗不足，果蠅處于麻醉狀態(tài)時間短，很難在有限的時間內(nèi)完成操作，及時挑選出所需的處女蠅。一旦出現(xiàn)觀察未完成但果蠅已經(jīng)蘇醒的情況，不得不進(jìn)行反復(fù)麻醉，很容易造成果蠅死亡。此外，乙醚已被列為國家二級易制毒管控試劑[6]，具有揮發(fā)性且易燃易爆，同時對實(shí)驗操作者身體也可能會造成一定的傷害。果蠅的低溫與CO2麻醉技術(shù)均安全可靠，效果也較好，但對實(shí)驗設(shè)備及條件要求較高，很多裝置都是各教學(xué)科研單位自制，沒有批量生產(chǎn)，不能在市場上直接購得[7]。

制作果蠅永久制片，可以使學(xué)生有充分時間詳細(xì)觀察果蠅的性狀，并準(zhǔn)確進(jìn)行性別鑒定，對于初學(xué)者而言，是簡單有效的解決辦法。果蠅性別鑒定與性狀觀察需要確認(rèn)多個部位細(xì)節(jié)，所以制片應(yīng)盡可能地保持果蠅生活姿態(tài)，不破壞其身體結(jié)構(gòu)。本團(tuán)隊根據(jù)教學(xué)實(shí)際需要，摸索總結(jié)出一套操作簡單的果蠅永久制片制作方法，且無需增加實(shí)驗室投入。所得制片可以在4℃冰箱中長期保存，在室溫下正常反復(fù)使用，目前已經(jīng)在相關(guān)實(shí)驗教學(xué)中得到了成功應(yīng)用。

1 果蠅永久制片的制作

1.1 實(shí)驗備品

解剖針、鑷子、培養(yǎng)皿、膠頭滴管、接種針(或小毛筆)、小藥匙、載玻片、蓋玻片、麻醉瓶、白紙板、標(biāo)簽紙、體視顯微鏡，如圖1。

圖1 實(shí)驗備品

1.2 實(shí)驗試劑

乙醚、70%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯、樹膠、蒸餾水，如圖2。

圖2 實(shí)驗試劑

1.3 制作步驟

1.3.1 選材

選取符合性狀要求的果蠅，乙醚麻醉后置于載玻片。以活體果蠅乙醚麻醉后直接進(jìn)行制片為最佳；實(shí)驗過程中淘汰的果蠅，麻醉后迅速放入70%乙醇中，在15d內(nèi)用來制片效果也較好；死去時間過長的果蠅因身體卷曲或失水，不宜用于制片。

圖3 死后30d制片 圖4 死后15d制片 圖5 麻醉后立即制片

1.3.2 清洗

將果蠅放于載玻片上，加入1滴純凈水，洗去體表的螨蟲、粘著的培養(yǎng)基和灰塵等，要小心操作，注意不要損傷果蠅的翅及身體。清洗和移動果蠅時，可用小藥匙配合接種針進(jìn)行操作，須單只進(jìn)行。接觸液體后，不能再用小毛筆移動果蠅。

1.3.3 透明

將清洗后的果蠅移入盛有二甲苯培養(yǎng)皿中，透明約5min。此過程可增加標(biāo)本對比度，觀察時效果更佳。

1.3.4 脫水

將透明后的果蠅分別放入盛有濃度為70%、95%、100%乙醇的培養(yǎng)皿中，各浸泡3min，以脫去果蠅表面水分，確保果蠅標(biāo)本不會因后期脫水而導(dǎo)致變形，影響觀察效果。

1.3.5 整姿

用解剖針在潔凈載玻片上滴1小滴樹膠，樹膠量不宜過多，多余樹膠在蓋片外會影響制片的美觀，可用二甲苯去除。將脫水后的果蠅放入樹膠中，利用接種針等工具將果蠅調(diào)整到理想觀察姿態(tài)。按觀察目的不同，可將翅、復(fù)眼和前足等部位調(diào)整至最佳角度，如性狀觀察主要區(qū)分長翅與小翅、紅眼與白眼以及體色的不同；性別鑒定主要觀察性梳的有無、腹部條紋數(shù)和外生殖器等。此過程中，如樹膠出現(xiàn)起皺現(xiàn)象，可用解剖針沾取少量二甲苯于樹膠上，以保證操作順利進(jìn)行。

圖6 白眼小翅雄蠅 圖7 紅眼小翅雄蠅 圖8 紅眼長翅雌蠅

1.3.6 蓋片

整姿完成后，迅速用鑷子小心蓋上蓋玻片，再利用解剖針輕輕按壓，使樹膠在蓋片下均勻分布，并排出氣泡，蓋片不能用力按壓，否則會導(dǎo)致果蠅身體破裂。蓋片四周如有空隙，可再補(bǔ)充少許樹膠封好。蓋玻片可稍大一些，這樣能夠容納較多樹膠，使果蠅在長時間封存中不產(chǎn)生變形或氧化。根據(jù)經(jīng)驗，使用14mm圓形蓋玻片即可達(dá)到較好效果。

1.3.7 標(biāo)注

標(biāo)注應(yīng)寫明果蠅性狀和性別，注明制作日期和制作人。因果蠅體型較小，所以全部操作過程均需在體視顯微鏡下進(jìn)行，但放大倍數(shù)不宜過高，體視顯微鏡(廈門Motic)放大20倍即可滿足要求。放大倍數(shù)過高，難以精確控制果蠅位置，會影響實(shí)驗效果。

圖9 學(xué)生完成的制片 圖10 實(shí)驗室現(xiàn)有制片

2 果蠅永久制片在教學(xué)中的應(yīng)用

實(shí)驗室所用果蠅品系，最佳保存條件為18℃，60%濕度，每28d左右需更換1次培養(yǎng)基[8]。一般在教學(xué)使用前30d，需進(jìn)行擴(kuò)繁，并于25℃條件下保存，供學(xué)生觀察與實(shí)驗操作。果蠅永久制片的開發(fā)，使以下實(shí)驗不受時間和條件限制，學(xué)生隨時可以開展實(shí)驗。

2.1 果蠅形態(tài)與性狀觀察

果蠅形態(tài)與性狀觀察一直是使用果蠅第一課。野生型果蠅為紅眼、長翅、直剛毛、灰身，對應(yīng)各種突變型分別為白眼、小翅、卷剛毛、黑檀體等。對果蠅各種形態(tài)特征的觀察是認(rèn)識并利用果蠅第一步。但無論采用低溫麻醉還是乙醚麻醉，果蠅都會在較短時間內(nèi)恢復(fù)行動能力，要求觀察者快速準(zhǔn)確完成操作[9]。學(xué)生做為初學(xué)者，往往不能在有限時間內(nèi)掌握實(shí)驗要求內(nèi)容。果蠅永久制片在4℃冰箱內(nèi)可長期保存，反復(fù)使用，而且對觀察者無技術(shù)上要求，可以隨時進(jìn)行觀察，學(xué)生有充分時間準(zhǔn)確區(qū)分各種性狀，無需擔(dān)心果蠅蘇醒而中斷觀察。

2.2 果蠅的性別鑒定

以果蠅為實(shí)驗材料的遺傳規(guī)律驗證實(shí)驗，如自由組合規(guī)律實(shí)驗和伴性遺傳實(shí)驗，都需要準(zhǔn)確選用處女蠅，這是實(shí)驗成敗的關(guān)鍵。剛羽化的果蠅體色較淺，身體未完成展開，因此采用觀察腹部條紋和根據(jù)體型大小的差別進(jìn)行鑒定并不可靠。在處女蠅的選取中，分辨雌雄果蠅最準(zhǔn)確方法就是觀察性梳的有無[10]，而初學(xué)者在有限時間內(nèi)很難準(zhǔn)確判斷性梳的有無，從而導(dǎo)致挑選處女蠅失誤，造成實(shí)驗失敗。利用果蠅永久制片，可對性梳的位置、形態(tài)有準(zhǔn)確的認(rèn)知，并結(jié)合體型、腹部末端條紋等形態(tài)特征對果蠅的性別做出判斷，這樣在處女蠅選取時就會做到迅速準(zhǔn)確。

3 結(jié)語

生物科學(xué)是建立在實(shí)驗基礎(chǔ)上的學(xué)科[11]，實(shí)驗是人才培養(yǎng)中不可忽視的教學(xué)環(huán)節(jié)，通過實(shí)驗操作技能的訓(xùn)練，使學(xué)生能將理論知識與實(shí)踐操作相結(jié)合[12]。在吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院本科遺傳學(xué)教學(xué)實(shí)踐中，安排2學(xué)時實(shí)驗課，利用果蠅永久制片進(jìn)行性狀觀察與性別鑒定，使學(xué)生輕松、迅速和準(zhǔn)確地掌握了實(shí)驗要求內(nèi)容，取得了很好的教學(xué)效果，也為伴性遺傳和遺傳距離測定實(shí)驗中，利用活體果蠅進(jìn)行操作打下良好基礎(chǔ)；果蠅永久制片也已經(jīng)在黑龍江省海林林業(yè)局第一中學(xué)的生物實(shí)驗課上得到了應(yīng)用，受到師生廣泛好評。