錫林郭勒奶酪中優(yōu)良菌株的篩選及奶豆腐制作

徐偉良 郭元晟,2 王福超,3 李春冬 安琪 雅梅,2 郭梁,2

(1.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院生物工程研究院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000；2.錫林郭勒盟食品科學(xué)與檢測實驗中心/錫林郭勒盟農(nóng)畜產(chǎn)品檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000；3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食品與生物科學(xué)系，吉林 延吉 133002)

錫林郭勒奶酪主要是指牛乳經(jīng)過自然發(fā)酵凝乳最終形成的一種食物，屬于錫林郭勒地區(qū)特有的傳統(tǒng)固體類奶制品，也是錫林郭勒地區(qū)蒙古族傳統(tǒng)奶制品中非常重要的一類食品。2020年經(jīng)農(nóng)業(yè)部審定，錫林郭勒奶酪成為國家農(nóng)產(chǎn)品地理標志登記產(chǎn)品，其傳統(tǒng)的制作工藝不僅展現(xiàn)著民族的文化特色與精粹，更包含著豐富的科學(xué)內(nèi)涵與教育意義。錫林郭勒奶酪是一種多以凝乳酪蛋白為最終產(chǎn)品形式的高蛋白類乳制品，常見產(chǎn)品種類包括浩乳德(俗稱奶豆腐)、畢希拉格(俗稱熟奶豆腐)、楚拉(俗稱奶渣子)、阿爾沁浩乳德(俗稱酸奶豆腐)等[1,2]。日常生活中以四方塊模具為主，在重大節(jié)日中則用不同的模具制作浩乳德。錫林郭勒奶酪其營養(yǎng)價值較高，含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素、鈣、磷及微量元素。氨基酸比例平衡，必需氨基酸含量較高，消化率接近，脂肪酸含量較高，尤其是不飽和脂肪酸含量高，是老人小孩補充鈣、磷、鋅等元素的良好食物，補充人體各種必需營養(yǎng)，已成為蒙古族人們必需食物之一[3-5]。

錫林郭勒奶酪不僅含有大量營養(yǎng)成分和特色風味營養(yǎng)物質(zhì)，更蘊含著優(yōu)異發(fā)酵性能和特色風味等極其豐富的益生菌資源，對營養(yǎng)保健功能食品和商業(yè)發(fā)酵菌劑的研發(fā)開發(fā)具有巨大潛力，已越發(fā)受到研究人員的重視，逐漸成為益生菌資源研究的熱點[6]。目前已有報道從錫林郭勒傳統(tǒng)奶酪中分離得到了植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)和乳酸片球菌(Pediococcusacidi lactici)等一部分具有益生活性的乳酸菌[7-10]。本實驗以錫林郭勒傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪為原料，通過產(chǎn)酸凝乳發(fā)酵性能為評價指標對優(yōu)良發(fā)酵性能的乳酸菌株進行分離篩選，并以此用于生產(chǎn)加工均有良好營養(yǎng)品質(zhì)的錫林郭勒奶酪，從而為錫林郭勒奶酪發(fā)酵劑的開發(fā)和新式奶豆腐品的研制提供技術(shù)依據(jù)。

1 實驗器材與試劑

1.1 材料

試驗菌株，由錫林郭勒職業(yè)學(xué)院生物工程研究院提供，其中編號B009系列乳酸菌株由錫林郭勒地區(qū)傳統(tǒng)奶酪中分離獲得。具體分離純化步驟：將在牧民家采集的蒙古族傳統(tǒng)奶酪(靜置發(fā)酵奶酪、攪拌發(fā)酵奶酪)攪拌均勻，將其裝入無菌采樣袋中，并編號和記錄，送回實驗室，添加篩選抗生素后利用涂布法進行菌種分離。并挑取不同形態(tài)菌株于液體培養(yǎng)基中進行純化及后續(xù)保存。

發(fā)酵用牛奶，采購于伊利集團市售滅菌純牛奶。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS固體培養(yǎng)基購于北京路橋技術(shù)股份有限公司；TaKaRa快速提取試劑盒(Code No.9164)購于大連寶生物工程有限公司；其它試劑藥品均為國藥分析純試劑。

1.3 儀器與設(shè)備

Eppendorf 5418R Centrifuge高速臺式離心機，德國艾本德股份公司；Nanodrop 2000c核酸蛋白質(zhì)分析儀，美國Thermo Fisher公司；2720 Thermal Cycler PCR擴增儀，美國BIO-RAD公司；瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，北京六一生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 菌株產(chǎn)酸凝乳能力篩選

將51株菌取出并復(fù)蘇后，用MRS液體培養(yǎng)基連續(xù)不間斷活化3代，按2%的接種量接種于裝有市售純牛奶的試管中，放置于37℃的條件下進行培養(yǎng)。并以發(fā)酵8h時的酸度>80oT(吉爾涅爾度)及常溫凝乳狀態(tài)(有無凝乳、凝塊是否均勻、潤滑，乳清是否析出以及發(fā)酵感官風味)設(shè)為篩選的標準，進行產(chǎn)酸凝乳菌株的初步挑選。參照國標GB 5009.239-2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》中的方法滴定樣品酸度[11]。

2.2 菌株產(chǎn)酸凝乳能力復(fù)篩

將滿足初步篩選條件得到的菌株，再次按照初篩的接種比例加入到100mL純牛奶的三角瓶中進一步擴大培養(yǎng)，并以最終發(fā)酵8h時常溫凝乳狀態(tài)和加熱凝乳狀態(tài)(凝乳是否成團、凝塊的顏色、乳清澄清程度、感官風味)綜合因素作為篩選的標準，從而再次進行產(chǎn)酸凝乳菌株的復(fù)篩。

2.3 菌種PCR擴增及序列鑒定

采用TaKaRa快速提取試劑盒對篩選菌株的基因組總DNA進行提取。選用細菌通用引物(27F/1495R)用于擴增。引物序列分別為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1495R(5′-CTACGGCTACCTTGTT ACGA-3′)。

PCR反應(yīng)體系(20μL)，模板DNA 1μL、引物各1μL、ddH2O 7μL、Easy Taq PCR Super Mix 10μL。反應(yīng)條件，94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min、58℃退火1min、72℃延伸2min，共30循環(huán)；72℃末端延伸10min。

擴增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，經(jīng)檢測后合格的擴增產(chǎn)物送至北京睿博生物科技有限公司進行測序，測序結(jié)果經(jīng)拼接后在美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology formation.NCBI)進行BLAST同源比對。

2.4 奶豆腐的制作

2.4.1 奶豆腐制作工藝流程

菌種經(jīng)過產(chǎn)酸凝乳能力篩選后，把篩選得到的3株菌按照1∶1∶1的比例混合制成復(fù)合菌種。在無菌條件下，將復(fù)合菌種按3%比例接種到1L市售全脂滅菌牛奶，然后放置于25℃常溫下，模擬自然條件進行靜置發(fā)酵24h。隨后進行酸度滴定，若酸度達65oT以上，且發(fā)酵凝乳伴有少量乳脂析出，則發(fā)酵達到終點，否則繼續(xù)發(fā)酵至終點。

制作流程：把發(fā)酵好的凝乳倒入鍋中進行加熱排乳清，溫度控制在50～60℃，并保持10min，為了乳清的排出需要保持不停攪拌，并使其受熱均勻；待凝塊慢慢收縮至原來大小的1/2時，且凝乳富有彈性時，用濾網(wǎng)把乳清排出；將過濾掉乳清的凝乳塊繼續(xù)進行加熱攪揉，溫度控制在70℃以上，待凝乳經(jīng)攪揉成團后，取出放入模具成型。

2.4.2 奶豆腐的品質(zhì)評定

奶豆腐制作完成后，放在陰涼干燥環(huán)境下晾曬16h，揮發(fā)部分水分后計算奶豆腐得率，見公式1。抽選15位食品專業(yè)具有相關(guān)感官評定資質(zhì)的檢測人員以外觀色澤、口感、氣味、組織狀態(tài)以及融水狀態(tài)幾個方面為標準對制作得到的奶豆腐進行感官評分，主要是對奶豆腐進行風味和質(zhì)地的打分，評分標準見表1。并將奶豆腐樣品參照國標GB 5009.3-2016[12]、GB 5009.5-2016[13]、GB 5009.6-2016[14]進行水分、蛋白質(zhì)、脂肪檢測。

表1 奶豆腐感官評分表

奶豆腐得率(%)=奶豆腐成品質(zhì)量/原料乳的質(zhì)量×100%

(1)

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株產(chǎn)酸凝乳能力篩選結(jié)果

產(chǎn)酸能力通常是用于評價乳酸菌活力和篩選優(yōu)良發(fā)酵性能菌株的重要指標。乳酸菌經(jīng)過發(fā)酵后，會將乳中的乳糖、蛋白質(zhì)等逐漸分解,不僅產(chǎn)生一些有機酸和小分子肽等營養(yǎng)成分，還能為發(fā)酵食物賦予一些獨特的風味[15]。因此，產(chǎn)酸能力是乳酸菌發(fā)酵功能里的一個非常重要的指標，并且酸的生成能力與發(fā)酵時間成反比。此外，凝乳程度也是影響發(fā)酵乳制品生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵因素，尤其是在蒙古族乳制品傳統(tǒng)制作過程中，一般會通過調(diào)控加熱凝乳過程來達到可控的產(chǎn)品品質(zhì)與風味[16,17]。本實驗對分離于錫林郭勒傳統(tǒng)奶酪中的51株菌株，以37℃的條件下，發(fā)酵8h，酸度達到>80oT進行初篩，并以最終常溫凝乳狀態(tài)和加熱凝乳狀態(tài)等綜合因素作為篩選的標準進行復(fù)篩。初篩結(jié)果見表2，復(fù)篩結(jié)果見表3。

由表2、表3可知，根據(jù)初篩標準，共有13株具有較好產(chǎn)酸能力的菌株，酸度均達到80oT以上，其中酸度最高可達87oT，且初篩菌株常溫凝乳狀態(tài)均相對較好。然后對初篩所得13株菌進行了復(fù)篩，最終得到了酸度、常溫凝乳狀態(tài)和加熱凝乳狀態(tài)均較好的菌株，分別為B009-074、B009-089和B009-092。

表2 菌株的產(chǎn)酸凝乳能力篩選

表3 產(chǎn)酸凝乳菌株復(fù)篩結(jié)果

3.2 菌種序列鑒定結(jié)果

為最終確定后續(xù)奶豆腐制作所用的發(fā)酵菌株，同時鑒別初篩菌種的多樣性，因此將篩選所得的13株菌同時進行分子鑒定?？侱NA提取和瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果如圖1所示(R1～R13)。序列測序同源比對后，鑒定結(jié)果見表4。由表4可知，經(jīng)產(chǎn)酸凝乳篩選得到的13株分離于錫林郭勒傳統(tǒng)奶酪中的乳酸菌經(jīng)過測序后，結(jié)果顯示皆為乳酸乳球菌(Lactobacillus lactis)，并且其同源相似性均為100%。這與前期研究文章中從蒙古族奶嚼口與下層凝乳中乳酸菌的篩選結(jié)果所得的種類相似，均為乳酸乳球菌[18]。此外，莫藍馨等從16份錫林郭勒盟傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到了105株乳酸菌株，多數(shù)歸屬于乳球菌屬[19]。因此本實驗最終篩選出的13株菌均為乳酸乳球菌(L.lactis)，與上述兩位學(xué)者研究中的菌種屬種基本相同。

圖1 13株乳酸菌(R1～R13)的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果注：R1～R13為產(chǎn)酸凝乳菌株復(fù)篩結(jié)果編號順序。

表4 篩選菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

3.3 奶豆腐制作結(jié)果分析

3.3.1 奶豆腐感官品質(zhì)評價

將篩選得到的3株乳酸菌按照1∶1∶1的比例混合制成復(fù)合菌劑加入到市售純牛奶中進行自然發(fā)酵，并將發(fā)酵凝乳用于奶豆腐的制作。重復(fù)制作6個批次后，所制奶豆腐產(chǎn)品得率與感官評定如表5。由結(jié)果顯示，經(jīng)菌劑發(fā)酵制作的奶豆腐感觀評分平均值在83.8分，整體感觀評分較好，質(zhì)地光滑，組織較細膩，但融水狀態(tài)略差，受熱易分散。制得奶豆腐平均得率為13.7%±0.81%，與傳統(tǒng)奶豆腐加工生產(chǎn)得率(一般在10%左右)相比提高了37%。而據(jù)文獻報道，王曉宇等[20]利用篩選所得菌種進行工業(yè)化生產(chǎn)奶豆腐時，通過對菌種添加量、發(fā)酵溫度、排乳清溫度以及攪和溫度進行工藝優(yōu)化后，奶豆腐出成率可達8.31%。由此可知，本實驗所篩選的菌種進行奶豆腐制作時，產(chǎn)品得率顯著提高，但產(chǎn)品整體感觀評分略差，融水狀態(tài)渾濁，受熱易分散。這可能是由于在奶豆腐制作過程中上層乳脂析出較少，使得最終產(chǎn)品中含脂率偏高，這也由表6理化檢測結(jié)果中得到驗證，同時也符合王曉宇對含脂率偏低(<1.4%)的原料乳適合奶豆腐工業(yè)化生產(chǎn)的推斷。

表5 奶豆腐產(chǎn)品得率與感官評分

表6 奶豆腐理化檢測指標

3.3.2 奶豆腐理化品質(zhì)評價

奶豆腐的理化檢測指標數(shù)據(jù)見表6，可知水分平均含量為41.6%±3.7%，符合地方標準DBS15/001.3-2017要求(水分≤53%)[21]；蛋白質(zhì)平均含量為21.9%±1.5%，略低于地方標準DBS15/001.3-2017要求蛋白質(zhì)含量≥26%；脂肪平均含量為27.5%±2.1%，雖然此次重新修訂的地標中未限定具體脂肪含量，但整體含量遠高于原地方標準DBS15/001.3-2011要求≥10%，同時也高于文獻報道奶豆腐脂肪含量在8%～25%。所制得奶豆腐理化檢測顯示蛋白質(zhì)含量與地標要求的奶豆腐指標相比偏低，而脂肪含量相對偏高，這可能與奶豆腐制作工藝中的脫脂程度和晾曬脫水分程度有關(guān)[22]。如，奶豆腐根據(jù)水分含量可分為濕、半干、干3種產(chǎn)品類型，而依據(jù)產(chǎn)品類型的不同，奶豆腐的水分、蛋白質(zhì)，脂肪及灰分等營養(yǎng)成分指標也有所不同[23]。由于本實驗所使用的復(fù)合菌劑在制作奶豆腐時會出現(xiàn)脂肪上浮較少，使得脫脂程度降低，最終所得產(chǎn)品脂肪含量較高。因此，推斷該復(fù)合菌劑可用于生產(chǎn)高脂型奶豆腐，而脂肪含量增加，不僅使產(chǎn)品的營養(yǎng)價值增高，更賦予了其獨特的風味。

4 結(jié)論與討論

本實驗通過對分離于錫林郭勒傳統(tǒng)奶酪中的51株乳酸菌進行優(yōu)良發(fā)酵性能的篩選，以37℃的條件下，發(fā)酵8h，酸度>80oT進行初篩，并以最終常溫凝乳狀態(tài)和加熱凝乳狀態(tài)等綜合因素作為篩選的標準進行復(fù)篩。共篩出了3株發(fā)酵時間短、凝乳組織狀態(tài)好、具有良好感官風味的乳酸菌。并對其進行了序列測序以及同源比對，最終確定3株菌株皆為乳酸乳球菌(L.lactis)，且同源相似性均為100%。雖然所篩選得到菌株均為乳酸乳球菌，但菌株的發(fā)酵性能并不完全相同，這可能是由于所篩選的菌株隸屬于乳酸乳球菌的不同亞種，而本實驗利用細菌通用引物只能將菌種鑒定到種的水平，對于亞種還需進一步鑒定。

將篩選得到的3株優(yōu)良發(fā)酵性能乳酸菌進行1∶1∶1混合制成復(fù)合菌劑，以此復(fù)合菌劑制作奶豆腐，所得產(chǎn)品整體感觀評分較好，平均得率與傳統(tǒng)奶豆腐加工生產(chǎn)得率相比提高了37%。所得奶豆腐整體脂肪含量相對偏高，由此推斷，本實驗所使用的復(fù)合菌劑在制作奶豆腐時會使脫脂程度降低，并利用所篩選菌株發(fā)酵生產(chǎn)奶豆腐所得產(chǎn)品得率與理化指標均有較好改進，可為錫林郭勒奶酪發(fā)酵劑的研發(fā)以及新型高脂型奶豆腐產(chǎn)品的生產(chǎn)提供一定的科學(xué)依據(jù)。