復(fù)方卡森顆粒成型工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

康雨彤，蔡曉翠，王新堂，賀金華

(新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004)

復(fù)方卡森顆粒為新疆維吾爾醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校直屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，是按照維吾爾醫(yī)理論組方的維藥復(fù)方制劑。處方由玫瑰花、小茴香、黃瓜子和葫蘆子仁等藥材組成，具有通滯利肝、利尿消腫的功效，在新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院和新疆維吾爾醫(yī)學(xué)專科學(xué)校直屬醫(yī)院臨床應(yīng)用多年，用于治療肝炎。該品種原醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)處方組成明確，但制備工藝參數(shù)不明確，且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為院內(nèi)制劑內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，只有玫瑰花的薄層色譜定性鑒別，質(zhì)量可控性差，易使成品質(zhì)量差異較大，從而影響其臨床治療效果。為充分發(fā)揮民族醫(yī)藥的療效優(yōu)勢(shì)，遵循維吾爾醫(yī)用藥理論，按照中藥新藥研究的技術(shù)要求及《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版的規(guī)定[1]，運(yùn)用現(xiàn)代先進(jìn)制藥技術(shù)和生產(chǎn)工藝，制成特色鮮明、劑型合理、使用方便的復(fù)方卡森顆粒，并采用現(xiàn)代質(zhì)量控制研究方法，對(duì)復(fù)方卡森顆粒的制劑工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，保證了該制劑的可控性、有效性和安全性，為我區(qū)維吾爾新藥研究和開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)，也為推進(jìn)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化做出積極貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 U3000高效液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific)；BP211D電子分析天平(Sartorius，感量：0.01 mg)；SK3300H型超聲清洗儀(頻率59 kHz，功率160 W，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；DT-500A型電子計(jì)數(shù)天平(常熟市金羊砝碼儀器有限公司金羊天平儀器廠，感量：0.01 g)；WFH-201B紫外透射反射儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；SP-20E型全自動(dòng)點(diǎn)樣儀(上?？普苌萍加邢薰?；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.1.2試藥 沒(méi)食子酸(批號(hào)：100831-201204，純度89.9%)、茴香醛(批號(hào)：110838-201106)、玫瑰花對(duì)照藥材(批號(hào)：121508-200702)均來(lái)源中國(guó)食品藥品檢定研究院。乳糖(批號(hào)：20140008)為上海華茂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；糊精(批號(hào)：140310)、可溶性淀粉(批號(hào)：131209)為陜西奧克藥用輔料有限公司生產(chǎn)；微晶纖維素(批號(hào)：140226)為安徽山河藥用輔料股份有限公司生產(chǎn)。復(fù)方卡森顆粒，批號(hào)：20170418，20170426，20170428，由新疆西部加斯特藥業(yè)有限公司提供。甲醇為美國(guó)Fisher公司產(chǎn)色譜純，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1復(fù)方卡森顆粒成型工藝條件的優(yōu)選 本方為維吾爾藥復(fù)方制劑，前期以玫瑰花中沒(méi)食子酸為指標(biāo)性成份，篩選和優(yōu)化了水提取、除雜、減壓濃縮和干燥工藝，最終得干膏粉，溶解性相對(duì)較好。但中藥復(fù)方藥粉大都具有不同程度的吸潮性，故選用具有防潮作用的輔料作為制劑的賦形劑具有重要的意義[2-3]。

(1)吸濕率的測(cè)定。將底部裝有氯化鈉過(guò)飽和溶液的玻璃干燥器置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫24 h，使干燥器內(nèi)的相對(duì)濕度達(dá)75%[4]。取浸膏粉適量，分別與乳糖、糊精、淀粉和微晶纖維素按1：1比例混合，取適量置于已干燥恒重的稱量瓶底部，厚度約2 mm，準(zhǔn)確稱定質(zhì)量后，置于上述玻璃干燥器內(nèi)(稱量瓶蓋揭開(kāi))于25 ℃保存，放置168 h定時(shí)稱質(zhì)量(6，12，24，48，72，96，120，144，168 h)，計(jì)算吸濕百分率，吸濕百分率(%)=(吸濕后的質(zhì)量-吸濕前的質(zhì)量)/吸濕前的質(zhì)量×100。

(2)混合輔料的選擇。按表1稱取規(guī)定量的浸膏粉與混合輔料混勻，用適量80%乙醇做潤(rùn)濕劑制軟材，制粒，烘干，過(guò)篩整粒。不同處方要求易制粒整核測(cè)定顆粒的成型性、堆密度、休止角、溶化性及吸濕性，并以各指標(biāo)的綜合評(píng)分評(píng)價(jià)，優(yōu)選最佳混合輔料[5-6]。綜合評(píng)分=(最小吸濕率值/吸濕率值)×25+(成型性值/最大成型性值)×25+(溶化性值/最大溶化性值)×20+(堆密度值/最大堆密度值)×15+(最小休止角值/休止角值)×15。

(3)混合輔料比例的選擇。稱取規(guī)定量的浸膏粉與混合輔料混勻，用適量的80%乙醇做潤(rùn)濕劑制軟材，制粒，烘干，過(guò)篩整粒。測(cè)定顆粒的成型性、堆密度、休止角、溶化性及吸濕性，并以各指標(biāo)的綜合評(píng)分評(píng)價(jià)，優(yōu)選最佳混合輔料比例。見(jiàn)表2。

表2 不同混合輔料比例的篩選

(4)浸膏粉和混合輔料比例的選擇。稱取規(guī)定量的浸膏粉與混合輔料混勻，用適量的80%乙醇做潤(rùn)濕劑制軟材，制粒，烘干，過(guò)篩整粒。測(cè)定顆粒的成型性、堆密度、休止角、溶化性及吸濕性，并以各指標(biāo)的綜合評(píng)分評(píng)價(jià)，優(yōu)選最佳浸膏粉和混合輔料比例。見(jiàn)表3。

表3 不同比例浸膏粉與混合輔料的篩選

(5)潤(rùn)濕劑的選擇。稱取規(guī)定量的浸膏粉與混合輔料混勻，分別用適量60%，70%，85%，87%，90%乙醇做潤(rùn)濕劑制軟材，制粒，烘干，過(guò)篩整粒。測(cè)定顆粒的成型性、堆密度、休止角、溶化性及吸濕性，并以各指標(biāo)的綜合評(píng)分評(píng)價(jià)，優(yōu)選最佳潤(rùn)濕劑。見(jiàn)表4。

(6)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。為進(jìn)一步確認(rèn)工藝穩(wěn)定可行，按上述工藝進(jìn)行了中試放大生產(chǎn)，并按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部附錄0104顆粒劑項(xiàng)下規(guī)定，對(duì)3批中試樣品進(jìn)行檢查。

1.2.2復(fù)方卡森顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

(1)薄層色譜鑒別。①玫瑰花鑒別：取本品3 g，加乙醇30 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；另取玫瑰花對(duì)照藥材1.0 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；取處方中缺玫瑰花陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜板上，以甲醇-水(3：1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，放置10 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視[7-8]。

②小茴香鑒別：取本品100 g，照揮發(fā)油測(cè)定法(2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則2204)實(shí)驗(yàn)，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度部分并溢流入燒瓶時(shí)為止，加入正己烷2 mL，加熱回流1.5 h，分取正己烷層，作為供試品溶液；另取茴香醛對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每毫升含1 μL的溶液，作為對(duì)照品溶液；取處方中缺小茴香陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(17：3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液，放置20 min，日光下檢視[9-11]。

(2)沒(méi)食子酸含量測(cè)定。①色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動(dòng)相A，0.05%磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫(0.00～15.00 min，3%A；15.00～20.00 min，3%→90%A；20.00～25.00 min，90%→3%A；25.00～35.00 min，3%A)[12-13]；檢測(cè)波長(zhǎng)：272 nm，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL·min-1。

表4 不同潤(rùn)濕劑的篩選

②對(duì)照品溶液的制備：精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，加水制成每毫升含沒(méi)食子酸50 μg的溶液，即得。

③供試品溶液制備方法的考察：Ⅰ供試品溶液處理溶劑的確定：供試品溶液的制備：取本品約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入水和流動(dòng)相50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(電壓：220 V，頻率：50 Hz)30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，并用相應(yīng)的溶劑補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。每種溶劑平行處理兩份。依法測(cè)定沒(méi)食子酸的含量，結(jié)果用水處理的樣品含量為9.46 mg·g-1，用流動(dòng)相處理含量為9.30 mg·g-1，用水作溶劑處理樣品時(shí)，樣品中沒(méi)食子酸含量較大，結(jié)合藥典和文獻(xiàn)中的方法，選擇用水作為處理樣品的溶劑[14-15]。

Ⅱ 供試品溶液的處理方式及時(shí)間的確定。供試品溶液的制備：取本品約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入水50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，分別回流提取和超聲提取(電壓：220 V，頻率：50 Hz)45，60，90，120 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，并用水補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。每種提取方式和時(shí)間平行處理兩份。依法測(cè)定沒(méi)食子酸的含量，結(jié)果相同提取時(shí)間下，回流提取均比超聲提取含量高；隨著回流提取時(shí)間的增加，含量也隨之增加，回流1.5 h后含量也不再增加，故確定供試品溶液的處理方式：回流提取，提取時(shí)間：1.5 h。

④專屬性考察：按照處方工藝制備不含玫瑰花的樣品作為陰性樣品，將沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。

⑤線性關(guān)系考察：精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，加水制成每毫升含500 μg 的溶液，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取上述儲(chǔ)備液0.25，0.5，1，1.25，2 mL，置于10 mL量瓶中，加水稀釋制成不同濃度的對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀，進(jìn)行線性關(guān)系考察。

⑥精密度：Ⅰ儀器精密度：取同一份對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。

Ⅱ 重復(fù)性：取本品約0.25 g，精密稱定，平行6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入水50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取1.5 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，并用水補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。按上述含量測(cè)定方法測(cè)定。

Ⅲ中間精密度：取本品，在不同日期，經(jīng)不同人員按“2.2.2.⑥.Ⅱ”項(xiàng)下供試品處理方法進(jìn)行制備，按上述含量測(cè)定方法測(cè)定。

⑦對(duì)照品和供試品溶液的穩(wěn)定性：取對(duì)照品溶液和重復(fù)性1#供試品溶液置于冰箱4 ℃冷藏，分別放置不同時(shí)間，按上述含量測(cè)定方法測(cè)定。

⑧加樣回收率：取本品約0.125 g，精密稱定，平行6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液(C=1.223 mg·mL-1，純度89.9%)1.0 mL，再精密加入水49 mL，按“2.2.2.⑥.Ⅱ”項(xiàng)下供試品處理方法進(jìn)行制備，按上述含量測(cè)定方法測(cè)定。

⑨3批樣品含量測(cè)定結(jié)果：取3批樣品，采用“1.2.2(2)③”建立的供試品溶液的制備方法制備，并按含量測(cè)定方法測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1成型工藝研究

2.1.1吸濕率 各樣品放置168 h后，浸膏粉的吸濕百分率高達(dá)23.97%，且吸濕現(xiàn)象非常嚴(yán)重；而浸膏粉與各輔料混合后的吸濕百分率大大降低，其中乳糖的抗?jié)衲芰ψ顝?qiáng)，但浸膏粉與乳糖混合物的液化現(xiàn)象較其他輔料混合物嚴(yán)重，綜合考慮選擇使用混合輔料作為本制劑輔料使用。見(jiàn)圖1。

圖1 浸膏粉與不同輔料的混合物吸濕曲線

2.1.2混合輔料的選擇 按各處方的綜合評(píng)分，混合輔料乳糖：糊精=1：1的綜合評(píng)分最高，確定混合輔料為乳糖和糊精。見(jiàn)圖2。

圖2 不同混合輔料篩選結(jié)果

2.1.3混合輔料比例的選擇 按各處方的綜合評(píng)分，乳糖：糊精=1：1的綜合評(píng)分最高，確定混合輔料比例為乳糖：糊精為1：1。見(jiàn)圖3。

圖3 不同混合輔料比例的篩選結(jié)果

2.1.4浸膏粉和混合輔料比例的選擇 按各處方的綜合評(píng)分，浸膏粉：乳糖：糊精=2：1：1的綜合評(píng)分最高，確定浸膏粉和混合輔料比例為1：1。見(jiàn)圖4。

圖4 不同比例浸膏粉與混合輔料的篩選結(jié)果

2.1.5潤(rùn)濕劑的選擇 由圖5不同潤(rùn)濕劑結(jié)果可知，處方組成及比例為浸膏粉：乳糖：糊精=2：1：1，潤(rùn)濕劑為75%乙醇的綜合評(píng)分最高，故確定潤(rùn)濕劑為75%乙醇。

圖5 不同潤(rùn)濕劑的篩選結(jié)果

2.1.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 3批樣品的溶化性、粒度、裝量差異等均符合規(guī)定。見(jiàn)表5。

2.2復(fù)方卡森顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

2.2.1薄層色譜鑒別 供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖6。供試品薄層色譜圖中與對(duì)照品薄層色譜圖相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖7。

2.2.2沒(méi)食子酸含量測(cè)定 ①專屬性考察：陰性無(wú)干擾，此方法專屬性良好。見(jiàn)圖8。

表5 復(fù)方卡森顆粒檢查項(xiàng)結(jié)果

1.樣品；2.樣品；3.樣品；4.玫瑰花對(duì)照藥材。

1.樣品；2.樣品；3.樣品；4.茴香醛對(duì)照。

②線性關(guān)系考察：沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液的濃度在11.25～89.97 μg·mL-1范圍內(nèi)，與其峰面積顯示有良好的線性關(guān)系，回歸方程：Y=0.396 3X+0.350 5，r=0.999 9。

圖8 沒(méi)食子酸對(duì)照品(A)、樣品(B)及陰性品(C) HPLC色譜圖

③精密度：Ⅰ儀器精密度：峰面積均值為18.315，RSD為0.06%，儀器精密度良好。Ⅱ重復(fù)性：含量均值為8.56 mg·g-1，RSD為1.40%，建立的含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。Ⅲ中間精密度：含量均值為8.51 mg·g-1，RSD為1.03%，建立的含量測(cè)定方法中間精密度良好。

④對(duì)照品和供試品溶液的穩(wěn)定性：對(duì)照品溶液在26 h內(nèi)的峰面積均值為18.243，RSD為0.58%；供試品溶液在21 h內(nèi)的峰面積均值為17.312，RSD為0.003%，供試品溶液在21 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

⑤加樣回收率：回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合要求。見(jiàn)表6。

⑥三批樣品含量測(cè)定：批號(hào)為20170418，20170426，20170428的樣品中，沒(méi)食子酸含量分別為8.82，9.55，9.37 mg·g-1，平均含量8.99 mg·g-1。

3 討論

醫(yī)院制劑臨床疾病治療工作中發(fā)揮著重要的作用，是新藥開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)和重要來(lái)源。讓院內(nèi)中藥制劑走向市場(chǎng)，開(kāi)發(fā)成新藥，要求新制劑確有療效，安全無(wú)毒，具有嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。新疆維吾爾醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校直屬醫(yī)院院內(nèi)制劑復(fù)方卡森顆粒，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只列入了性狀、玫瑰花的薄層鑒別及顆粒劑項(xiàng)下規(guī)定的檢查項(xiàng)，無(wú)其他藥材的鑒別及處方中特征成分的含量測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)較低，不能很好的控制本品的質(zhì)量。因此，需要發(fā)揮臨床與基礎(chǔ)，多學(xué)科合作的優(yōu)勢(shì)，對(duì)復(fù)方卡森顆粒進(jìn)行全面研究，提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使產(chǎn)品的質(zhì)量更加的穩(wěn)定可靠，從而擴(kuò)大本品的用藥范圍，使其成功地走向市場(chǎng)。

表6 沒(méi)食子酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)

中藥浸膏粉易吸濕，吸濕后易導(dǎo)致顆粒變軟、化學(xué)成分發(fā)生變化、流動(dòng)性降低、結(jié)塊甚至霉變，給中藥顆粒劑的生產(chǎn)和儲(chǔ)存帶來(lái)較大困難，甚至影響制劑的質(zhì)量和療效。輔料作為藥物制劑的基礎(chǔ)材料和重要組成部分，對(duì)制劑的吸潮性有著明顯的影響。原院內(nèi)制劑復(fù)方卡森顆粒制劑所用輔料為蔗糖，而通過(guò)篩選研究發(fā)現(xiàn)輔料選擇乳糖和糊精更為合理，減少了患者糖的攝入量，擴(kuò)大了用藥人群。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)處方中的玫瑰花、小茴香、黃瓜子和葫蘆子仁等藥材進(jìn)行了薄層色譜條件的摸索，發(fā)現(xiàn)黃瓜子、葫蘆籽仁等藥材均有陰性干擾，因此確定了玫瑰花和小茴香薄層色譜鑒別方法，并對(duì)鑒別方法分別進(jìn)行了不同溫度(10，25，45 ℃)和濕度(45%，75%)的耐用性考察，結(jié)果玫瑰花和小茴香藥材薄層色譜鑒別方法耐用性均良好，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠。

由于本組方成分復(fù)雜，藥材有效成分和藥理作用的研究報(bào)道相對(duì)較少。在前期生產(chǎn)工藝指標(biāo)性成分篩選基礎(chǔ)上，采用HPLC法，以沒(méi)食子酸為含量測(cè)定指標(biāo)，對(duì)本品含量進(jìn)行控制。參照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》一部中地榆、廣棗、委陵菜、拳參等藥材中沒(méi)食子酸測(cè)定所用波長(zhǎng)270～273 nm相近，故選擇272 nm作為沒(méi)食子酸含量測(cè)定用波長(zhǎng)，選定用甲醇-0.05%磷酸系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在此條件下沒(méi)食子酸保留時(shí)間較短，分離效果良好，陰性樣品溶液中其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，符合測(cè)定要求。

本研究所建立的TLC 和HPLC 方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于復(fù)方卡森顆粒的質(zhì)量控制。