天麻素與薯蕷皂苷元最佳配伍比例篩選及對(duì)HUVECs缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)機(jī)制*

張明爍，葉田園，祝娜，黃秀蘭，李志勇

(1.中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，濟(jì)南 250355)

土家族用天麻配伍延齡草防治“腦衰”病，本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明，天麻配伍延齡草可以增強(qiáng)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎所致的癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)合成、保護(hù)腦細(xì)胞[1-2]。天麻素(gastrodin，Gas)是中藥天麻的主要活性成分，在抗氧化、抗炎、抗凋亡、改善缺血缺氧造成的腦損傷、保護(hù)神經(jīng)元等方面具有良好的活性[3-4]。薯蕷皂苷元(diosgenin，Dio)是中藥延齡草的主要活性成分，具有保護(hù)血管、保護(hù)神經(jīng)、抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種藥理作用[5]。有效組分配伍是近年來(lái)出現(xiàn)的配伍研究新模式，從復(fù)方中各層次(部位-組分-成分)藥效物質(zhì)出發(fā)，具有作用明確、靶位清楚、對(duì)病證針對(duì)性更強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[6]。本研究通過(guò)基線(xiàn)等比增減設(shè)計(jì)確定Gas和Dio的配伍比例，并利用主成分分析方法在谷氨酸損傷的SH-SY5Y細(xì)胞模型和缺氧HUVECs上優(yōu)選出最佳配伍比例，并在分子水平研究最佳配伍比例對(duì)缺氧HUVECs中HIF-1α、VEGF、iNOS、eNOS蛋白表達(dá)的影響，初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1受試細(xì)胞 SH-SY5Y細(xì)胞由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)。原代HUVECs購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.2藥物與試劑 天麻素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110807-201407)、薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111539-200001)；谷氨酸(北京拜耳迪生物技術(shù)公司分裝)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C1063)；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)(Science cell，批號(hào)：1001)；活性氧檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：S0033)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(Angent，Ab46154)；低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)(Abcam，批號(hào)：Ab2185)；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)(Abcam，批號(hào)：Ab15323)；內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)(Immunoway，批號(hào)：YM3164)；山羊抗兔IgG(H+L)，辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)(天德悅生物科技有限公司)；山羊抗小鼠IgG(H+L)，HRP(天德悅生物科技有限公司)。

1.3主要儀器 全自動(dòng)流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)Beckman Coulter，F(xiàn)C500)；倒置熒光顯微鏡(Olympus，IX-81)；三氣培養(yǎng)箱(Thermo，Hera cell 150)；低溫冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，L535R-1)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) Molecular Devices 公司，F(xiàn)lexStation3)；垂直板電泳槽(北京六一生物科技有限公司，DYCZ-24DN)；半干式轉(zhuǎn)移電泳槽(美國(guó) Bio-Rad 公司，Trans-Blot SD)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司，PowerPac)；脫色搖床(美國(guó)Labnet公司，2030-RC-220)。

1.4方法

1.4.1基線(xiàn)等比增減法確定組分配比 依據(jù)天麻與延齡草的臨床配比(2：1)，結(jié)合天麻質(zhì)控研究中的Gas含量(≥0.20%)[7]、延齡草質(zhì)控研究中Dio含量(≥1.3 mg·g-1)[8]。臨床用藥中天麻為主藥，因此在配比設(shè)計(jì)時(shí)，除去一側(cè)終點(diǎn)單純?yōu)樘炻樗兀溆嗯湮楸壤龖?yīng)保證天麻素的比例>1/2[9]。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行基線(xiàn)等比增減設(shè)計(jì)，得出7組配伍比例為Gas：Dio=10：0，9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，0：10。

1.4.2不同組分配伍比例對(duì)谷氨酸損傷SH-SY5Y細(xì)胞的影響 ①細(xì)胞增殖毒性(cell counting kit-8，CCK-8)法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)接種于96孔板，每孔加200 μL含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12的完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h后，更換為無(wú)血清的DMEM/F12的培養(yǎng)基，每組6孔，正常對(duì)照組給予Locke’s buffer，模型對(duì)照組給予2 mmol·L-1谷氨酸(glutamate，Glu)，給藥組給予不同比例的Gas和Dio。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后，更換為含10% CCK-8的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃孵育3 h，使用多功能微孔板檢測(cè)儀，于450 nm處測(cè)定吸光度(A值)。

②Annexin V /PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，以每孔6×105個(gè)接種于6孔板，細(xì)胞分組及培養(yǎng)操作同“1.4.2 ①”項(xiàng)，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，按Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.3不同組分配伍比例對(duì)缺氧HUVECs的影響 ①HUVECs的分離、培養(yǎng)及鑒定 參照文獻(xiàn)[10-11]的方法，對(duì)原代HUVECs進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)及鑒定，并加以改進(jìn)。以10 mL ECM培養(yǎng)液重懸，制成單細(xì)胞懸液，接種于用2%明膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)，每2～3天換液1次，第2—第5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVECs用于實(shí)驗(yàn)。用免疫熒光鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原以鑒定細(xì)胞。

②不同組分配伍比例對(duì)缺氧HUVECs存活率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs，以每孔1×104個(gè)接種于96孔板，其余細(xì)胞培養(yǎng)及分組操作同“1.4.2 ①”項(xiàng)。正常對(duì)照組在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，缺氧模型組和藥物干預(yù)組于三氣培養(yǎng)箱(1% O2、5% CO2、94% N2)共培養(yǎng)，藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后，更換為含10% CCK-8的DMEM/F12培養(yǎng)液，37 ℃孵育3 h，使用多功能微孔板檢測(cè)儀，于450 nm處測(cè)定吸光度(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

③不同組分配伍比例對(duì)缺氧HUVECs中活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的影響 將細(xì)胞以每孔6×105個(gè)接種于6孔板，其余細(xì)胞分組及培養(yǎng)操作同“1.4.2②”項(xiàng)下，用全自動(dòng)流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞ROS含量。具體實(shí)驗(yàn)操作參考ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4.4主成分分析法篩選最佳配伍比例 分別以“1.4.2”和“1.4.3”項(xiàng)下細(xì)胞存活率及凋亡率的結(jié)果分析SH-SY5Y主成分及HUVECs主成分。首先進(jìn)行適用性檢驗(yàn)，判斷能否進(jìn)行主成分分析；確定主成分?jǐn)?shù)目，當(dāng)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率≥70%時(shí)，保留相應(yīng)成分，得出不同配伍組得分順序。

1.4.5最佳配伍比例對(duì)缺氧HUVECs保護(hù)作用的機(jī)制研究 ①最佳配伍比例對(duì)缺氧HUVECs凋亡的保護(hù)作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs，以每孔3×105個(gè)接種于6孔板，細(xì)胞分組及培養(yǎng)操作同“1.4.2②”項(xiàng)下，按Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：取重懸的細(xì)胞離心(1000 r·min-1，5 min)，棄上清液，加入Annexin V-FITC 195μL結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入Annexin V-FITC 5μL，混勻。加入碘化丙啶染色液10 μL，混勻。室溫避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，生成散點(diǎn)圖，記錄數(shù)據(jù)。

②最佳配伍比例對(duì)缺氧HUVECs蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)操作同“1.4.3②”項(xiàng)下，正常對(duì)照組于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，缺氧模型對(duì)照組和給藥組(Gas：Dio=8：2)于三氣培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)12 h。收集細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)量1×107加入1 mL裂解液，重懸細(xì)胞，冰上裂解20 min，13 000 r·min-1離心20 min(r=7 cm)，收集上清液，即HUVECs全蛋白樣品，用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白定量，以RIPA裂解液調(diào)整蛋白濃度，以SDS-PAGE凝膠電泳分離。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，含3%牛血清白蛋白TBST緩沖液(BSA-TBST)封閉，水平搖床孵育30 min。含3%牛血清蛋白的TBST緩沖液(3% BSA-TBST)稀釋一抗，iNOS(1：1000)，VEGF(1：2000)，β-actin(1：10 000)，4 ℃水平搖床孵育過(guò)夜。5% 脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1：10 000，室溫孵育40 min。ECL化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果，膠片曝光，顯影2 min，定影。圖片掃描后，用Gel Image ststem ver.4.00(tanon，China)軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1不同組分配伍比例對(duì)谷氨酸損傷SH-SY5Y細(xì)胞的影響

2.1.1SH-SY5Y細(xì)胞存活率 2 mmol·L-1谷氨酸可以使SH-SY5Y細(xì)胞的存活率降到63%。當(dāng)Gas±Dio=10±0，即Gas的濃度為20 μmol·L-1時(shí)，可以明顯提高細(xì)胞的存活率(P<0.05)，隨著Dio比例升高，存活率隨之下降。見(jiàn)表1。

表1 不同組分配伍比例對(duì)谷氨酸損傷SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

2.1.2SH-SY5Y細(xì)胞凋亡 與正常組比較，模型組的正常細(xì)胞顯著下降，早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞顯著增加；與模型組比較，當(dāng)Gas與Dio的比例分別為6：4，5：5，0：10時(shí)，正常細(xì)胞的比例均明顯提高，晚期凋亡和壞死的細(xì)胞顯著下降(P<0.05)，并且隨著Dio比例的增多，這種下降更為明顯。見(jiàn)表2。

2.2不同組分配伍比例對(duì)缺氧HUVECs的影響

2.2.1HUVECs 形態(tài)學(xué)觀察與免疫熒光法 細(xì)胞鑒定倒置顯微鏡下觀察顯示：6 h 后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，并逐漸伸展，呈單層的扁平三角形或者多角形；貼壁48 h后，細(xì)胞迅速生長(zhǎng)、融合，多數(shù)細(xì)胞聚集成團(tuán)，形成內(nèi)皮細(xì)胞島，逐漸向外擴(kuò)散。貼壁5 d后，細(xì)胞融合成片，嵌入排列，融合成典型的鋪路石狀。

表2 不同組分配伍比例對(duì)Glu損傷SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

免疫熒光法鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原，結(jié)果顯示未標(biāo)記Ⅷ因子一抗的陰性對(duì)照組的細(xì)胞漿不顯示熒光(圖1A)，標(biāo)記了Ⅷ因子一抗的HUVECs的細(xì)胞漿呈明亮的綠色熒光，細(xì)胞核陰染(圖1B)。

A.未標(biāo)記Ⅷ因子；B.標(biāo)記了Ⅷ因子。

2.2.2不同組分配伍比例對(duì)缺氧HUVECs存活率的影響 如表3所示，在Gas：Dio=10：0，9：1，8：2，7：3時(shí)，可以明顯提高缺氧損傷的HUVECs的存活率(P<0.05)。

2.2.3不同組分配伍組對(duì)缺氧HUVECs中活性氧(ROS)含量的影響 缺氧12 h后可刺激HUVECs產(chǎn)生大量ROS，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥組的7種比例均可顯著減少缺氧細(xì)胞中ROS含量(P<0.01)。見(jiàn)表4。

2.3主成分分析結(jié)果

2.3.1用谷氨酸損傷SH-SY5Y細(xì)胞 確定最佳配伍比例以表1、表2結(jié)果分析SH-SY5Y主成分。進(jìn)行適應(yīng)性檢驗(yàn)，KMO度量=0.370，Bartelett值=86.385，P=0.000，即相關(guān)矩陣不是一個(gè)單位矩陣，因此考慮進(jìn)行因子分析(表5)。當(dāng)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率≥70%時(shí)，則保留相應(yīng)成分。如表5所示，前兩個(gè)的累計(jì)貢獻(xiàn)率為90.580%，因此可以用前兩個(gè)主成分代替原來(lái)的檢測(cè)指標(biāo)。經(jīng)過(guò)主成分分析后計(jì)算得出，最終7個(gè)配伍組的得分由高到低為：Gas：Dio=10：0，9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，0：10。

表3 不同組分配伍比例對(duì)缺氧損傷HUVECs存活率的影響

2.3.2用缺氧HUVECs確定最佳配伍比例 以表3，表4結(jié)果分析HUVECs主成分。進(jìn)行適用性檢驗(yàn)，KMO度量=0.500，Bartelett值=4.074，P=0.000，即相關(guān)矩陣不是一個(gè)單位矩陣，因此考慮進(jìn)行因子分析。如表6所示，第一個(gè)成分的貢獻(xiàn)率為72.230%，因此可以用第一個(gè)主成分代替原來(lái)的檢測(cè)指標(biāo)。經(jīng)過(guò)主成分分析后計(jì)算得出，最終7個(gè)配伍組的得分由高到低為：Gas：Dio=8：2，10：0，9：1，7：3，6：4，5：5，0：10。

表4 不同組分配伍比例對(duì)缺氧HUVECs內(nèi)ROS含量的影響

表5 SH-SY5Y主成分的特征值和貢獻(xiàn)率

2.3.3優(yōu)選最佳配伍比例 綜合“2.3.1”項(xiàng)和“2.3.2”項(xiàng)的結(jié)果，當(dāng)Gas和Dio的比例為10：0，8：2和9：1時(shí)，效果較好。當(dāng)Dio存在時(shí)，可以抑制細(xì)胞的凋亡，增加正常細(xì)胞的比例，通過(guò)降低ROS的含量參與調(diào)控氧化應(yīng)激，表明Dio具有一定的積極作用，因此，本研究中Gas和Dio最佳配伍比例可能為8：2[12]或9：1。

2.4最佳配伍組對(duì)缺氧HUVECs凋亡的影響 與正常組比較，模型對(duì)照組的正常細(xì)胞的比例顯著降低，早凋和晚凋、壞死細(xì)胞的比例顯著增加(P<0.05)。給藥后，正常細(xì)胞的比例由59.17%增加到68.80%(P<0.01)；早期凋亡細(xì)胞比例由17.97%降低到14.23%(P<0.05)，晚期凋亡和壞死的細(xì)胞比例由21.8%下降到16.3%(P<0.01)。見(jiàn)表7。

表6 HUVECs主成分的特征值和貢獻(xiàn)率

2.5最佳配伍組對(duì)缺氧誘導(dǎo)后HUVECs的VGEF、HIF-1α、iNOS、eNOS表達(dá)的影響 如表8、圖2所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組HUVECs的VEGF增加，無(wú)顯著性差異，HIF-1α、iNOS的表達(dá)顯著增加，eNOS的表達(dá)顯著減少(P<0.05)，給藥后，VEGF、HIF-1α、iNOS的表達(dá)顯著減少，eNOS的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

3 討論

當(dāng)腦組織嚴(yán)重缺血缺氧時(shí)，Na+-K+-ATP酶功能減弱導(dǎo)致胞外Cl-和Na+內(nèi)流，K+外流，細(xì)胞膜電位隨之下降，激活電壓依賴(lài)性的Ca2+通道，Ca2+內(nèi)流，囊泡內(nèi)的谷氨酸被釋放出來(lái)，谷氨酸濃度增加會(huì)激活其受體，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞離子流動(dòng)性改變，線(xiàn)粒體功能紊亂，進(jìn)一步引發(fā)NO和自由基的氧化損傷、蛋白酶釋放，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死和自噬[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著Dio比例增加，Glu損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的存活率降低，猜測(cè)Dio可能通過(guò)以下兩點(diǎn)發(fā)揮對(duì)Glu損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用：①可以抑制細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體脫氫酶的活性，降低細(xì)胞內(nèi)氧化還原能力，通過(guò)降低損耗對(duì)損傷細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用；②影響Na+-K+-ATP酶功能，使細(xì)胞凋亡壞死。

血管內(nèi)皮細(xì)胞沿血管壁呈單層分布于血管腔內(nèi)表面，具有多種生理功能，可以參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，調(diào)控凝血、血栓等，對(duì)缺氧較為敏感，成為缺氧時(shí)的首要受累細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞缺氧時(shí)，ROS的含量明顯增多，并且引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等，加速細(xì)胞的凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)在研究Gas與Dio不同配伍比例對(duì)缺氧HUVECs內(nèi)ROS含量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，各配伍比例均可不同程度地降低缺氧細(xì)胞中ROS的含量，且均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著Dio比例增加，ROS的降低更為明顯。由以上結(jié)果推測(cè)，Dio可以通過(guò)降低細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)的脫氫酶活性，減少氧化還原反應(yīng)的發(fā)生，減少細(xì)胞內(nèi)ROS的含量發(fā)揮對(duì)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

表7 最佳配伍組對(duì)缺氧HUVECs凋亡的影響

表8 Western blotting掃描結(jié)果

A.VEGF；B.HIF-1α；C.iNOS；D.eNOS；①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

氧化應(yīng)激在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的病理進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用，缺氧導(dǎo)致的氧化還原失衡會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或退化[15]。eNOS正常狀態(tài)下僅產(chǎn)生少量的NO，可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的功能，當(dāng)細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí)，iNOS的表達(dá)增加，產(chǎn)生大量NO，誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，最終導(dǎo)致血管新生[16]。HIF-1α作為血管生成的刺激因子，在缺氧條件下表達(dá)顯著增加，血管生成增加，可部分恢復(fù)缺血部位的供血情況，在缺氧適應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，而HIF-1α一旦過(guò)度表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致血管生成過(guò)度增加，對(duì)病理性部位造成進(jìn)一步損傷。給藥后，HIF-1α和VEGF表達(dá)降低，表明最佳配伍組能夠有效控制血管新生，避免血管新生過(guò)度造成的不良影響；最佳配伍組可以降低缺氧HUVECs中iNOS的表達(dá)，增加eNOS的表達(dá)，使二者趨于正常水平，表明Gas和Dio配伍之后能夠通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激水平，降低細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，使細(xì)胞氧化還原處于平衡狀態(tài)。因此，最佳配伍組可以降低缺氧HUVECs的凋亡，控制缺氧造成的血管新生，并且通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激，使缺氧細(xì)胞的氧化還原恢復(fù)正常水平。

遵循本課題組前期提出的民族藥組方優(yōu)化基本原則[17]，本實(shí)驗(yàn)利用基線(xiàn)等比增減設(shè)計(jì)法確定了Gas和Dio的7種配伍比例，并利用主成分分析方法確定Gas和Dio可能的最佳配伍比例為8：2或9：1，Dio可能通過(guò)作用于線(xiàn)粒體內(nèi)的脫氫酶和細(xì)胞的Na+-K+-ATP酶發(fā)揮其對(duì)Glu損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用，將Gas和Dio的配伍比例8：2作用在缺氧HUVECs，可以通過(guò)抑制凋亡、氧化應(yīng)激、血管新生途徑參與對(duì)缺氧HUVECs的保護(hù)作用。