肺炎支原體感染診斷方法的研究進展

孫國磊，王一民

(1.天津市津南醫(yī)院急診科，天津300052； 2.中日友好醫(yī)院呼吸中心呼吸與危重癥醫(yī)學科二部，北京100029)

肺炎支原體是社區(qū)獲得性肺炎的常見病原體，我國肺炎支原體肺炎發(fā)病率較高，全國性多中心社區(qū)獲得性肺炎流行病學調(diào)查顯示，肺炎支原體肺炎占20%～30%，且兒童及青年人群的發(fā)病率可能更高[1-2]。肺炎支原體肺炎缺乏特異性臨床表現(xiàn)、影像學表現(xiàn)復雜多樣，早期快速診斷困難，導致肺炎支原體肺炎初始治療失敗風險及后續(xù)治療難度的增加。因此，了解肺炎支原體檢測的進展對提高肺炎支原體肺炎的診治水平十分重要。

肺炎支原體是一種非典型病原體，無細胞壁，大小(0.1～0.3 nm)介于細菌及病毒之間，多可獨立存活，經(jīng)呼吸道飛沫傳播。肺炎支原體感染引起的感染性疾病可發(fā)生于任何年齡人群，兒童感染率高于成人，且患病率逐年增加。有研究報道，約50%的肺炎支原體感染患者的臨床表現(xiàn)明顯，大多數(shù)成人感染者僅出現(xiàn)上呼吸道感染癥狀[3]。但隨著疾病進展，肺炎支原體感染不僅引起成人肺部嚴重疾病，還常導致心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等肺外并發(fā)癥。近年來，難治性肺炎以及耐藥性肺炎支原體感染病例逐年增加，每隔3～7年肺炎支原體感染會發(fā)生一次地方性流行或大流行，嚴重威脅居民身體健康[4]。肺炎支原體感染缺乏特異性臨床表現(xiàn)和影像學表現(xiàn)，且缺少微生物確診檢測方法，臨床診斷困難，易錯過最佳治療時機，因此提高肺炎支原體檢測的準確性對減輕患者疾病負擔尤為重要。

病原體培養(yǎng)是目前公認的肺炎支原體診斷“金標準”，但存在檢測方法局限、靈敏度低等缺點，其對臨床診斷和治療的幫助有限?，F(xiàn)就肺炎支原體感染診斷方法的研究進展予以綜述，以期提高肺炎支原體感染的診療水平。

1 臨床表現(xiàn)

人群對肺炎支原體普遍易感，尤其是兒童。由于小兒呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，故臨床表現(xiàn)復雜多樣，且易出現(xiàn)肺內(nèi)外并發(fā)癥。肺炎支原體的常見臨床表現(xiàn)為干咳、胸悶氣促、發(fā)熱、頭痛、肌痛和胃腸道癥狀。大多數(shù)單純肺炎支原體感染者無明顯肺部體征，若感染波及其他系統(tǒng)可引發(fā)腦梗死、腦炎、腦膜炎、心動過緩、急性腎小球腎炎、多形性紅斑或溶血性貧血等疾病[5-6]。此外，肺炎支原體感染者體溫變化較大，可出現(xiàn)低熱或超高熱，發(fā)熱前常出現(xiàn)畏寒癥狀?？傊?，肺炎支原體感染者缺乏特異臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者發(fā)病初期可表現(xiàn)類似于普通上呼吸道感染的癥狀，故單純依據(jù)臨床癥狀診斷較困難，需借助其他輔助檢查加以鑒別。

2 影像學表現(xiàn)

近年來，影像學檢查在肺部感染診治中發(fā)揮著不可忽視的作用，以X線和CT檢查最常見，CT檢查的分辨率和定性診斷準確率均高于X線，在肺部感染早期診斷中具有重要意義[7]。趙志勇等[8]比較細菌性、病毒性和支原體肺炎患者的CT影像學資料發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體肺炎主要以雙下肺居多(62.0%)；肺炎支原體肺炎與病毒性肺炎均存在間質(zhì)增厚、磨玻璃影等征象，但支氣管壁增厚是肺炎支原體肺炎區(qū)別于細菌性肺炎、病毒性肺炎的典型影像學。肺炎支原體肺炎的影像學表現(xiàn)復雜多樣，除上述特點外，還可見小葉中心結(jié)節(jié)(伴或不伴樹芽征)，肺泡腔內(nèi)滲出改變等，上述表現(xiàn)可先后出現(xiàn)或同時出現(xiàn)。另有研究顯示，重癥肺炎支原體肺炎病例CT影像常表現(xiàn)為葉段實變，類似于細菌性肺炎[9]。日本一項回顧性研究顯示，39%的重癥暴發(fā)性肺炎支原體肺炎患者肺部存在葉段實變，其中25%以葉段實變?yōu)槲ㄒ挥跋駥W表現(xiàn)[10]。此外，影像學檢查可及時觀察肺內(nèi)病灶范圍及形態(tài)變化。因此，可通過CT聯(lián)合流行病學、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查等，對肺炎支原體感染進行早期診斷和治療。

3 病原學檢測

3.1肺炎支原體分離培養(yǎng) 肺炎支原體繁殖速度緩慢，1～6 h分裂一代。肺炎支原體分離培養(yǎng)以鼻咽拭子、痰標本、口咽分泌物、肺泡灌洗液和胸腔積液等作為培養(yǎng)標本，以SP4作為培養(yǎng)基，一般在37 ℃、濕度60%～80%環(huán)境下，在瓊脂內(nèi)加入5%的CO2進行培養(yǎng)[11]，這是肺炎支原體應用最廣泛、最成功的培養(yǎng)手段。不同標本的培養(yǎng)陽性率不同，培養(yǎng)過程中需每天觀察培養(yǎng)基菌落的顏色和形態(tài)改變。劉金榮等[12]對比分析咽拭子和支氣管肺泡灌洗液標本肺炎支原體培養(yǎng)的差異發(fā)現(xiàn)，兩者熒光聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測的陽性率均為86.2%(25/29)，結(jié)果一致率為93.1%(27/29)；其中，肺泡灌洗液培養(yǎng)陽性率為65.5%(19/29)，標本污染率為6.9%(2/29)，咽拭子標本陽性率為51.7%(15/29)，污染率51.7%(15/29)；故認為咽拭子可作為熒光PCR定性檢測標本，但不適合用于病原體定量研究，而肺泡灌洗液更適合用于肺炎支原體分離培養(yǎng)研究。因此，可根據(jù)患者耐受程度、標本獲取難度、臨床表現(xiàn)等具體情況選擇標本種類，并在留取標本后及時保存運輸，以免影響檢測準確性。隨著耐藥性及難治性肺炎支原體感染的增多，分離培養(yǎng)法的應用率明顯升高，但尚缺乏統(tǒng)一的肺炎支原體分離培養(yǎng)測定標準。分離培養(yǎng)法可有效確定肺炎支原體的致病性及藥物敏感性，被稱為診斷肺炎支原體的金標準之一，但存在培養(yǎng)長、培養(yǎng)基昂貴、培養(yǎng)陽性率較低等缺點，臨床應用受限。分離培養(yǎng)與鑒定技術相對復雜，臨床難以開展，且無法滿足臨床極危重癥病例的需要。

3.2抗原檢測 肺炎支原體抗原檢測方法包括直接免疫熒光法、蛋白印跡法、對流免疫電泳等，但靈敏度低，易與呼吸道其他病原出現(xiàn)交叉反應，診斷準確率較低，臨床應用受阻，故通常該檢測結(jié)果不作為診斷依據(jù)[13]。

3.3抗體檢測 人體感染肺炎支原體后產(chǎn)生特異性抗體，包括免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M、IgG和IgA，臨床常采用IgM和IgG抗體進行檢測。血清IgM抗體出現(xiàn)較早，臨床癥狀出現(xiàn)1周后可被檢出，10～30 d達高峰，12～26周消失；IgG在IgM之后產(chǎn)生，1個月左右達高峰，持續(xù)時間長。抗體檢測方法有冷凝集試驗(cold agglutination test，CAT)、免疫熒光試驗(immunofluorescence assay，IFA)、間接血凝試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和補體結(jié)合試驗等。

冷凝集是機體對肺炎支原體感染產(chǎn)生的非特異性反應，其冷凝集素為IgM抗體，可在0～5 ℃內(nèi)凝集紅細胞，但CAT不能直接用于肺炎支原體檢測。研究表明，約75%的患者在肺炎支原體感染后7～10 d冷凝集素滴度≥1∶32，并常于6～8周后逐漸恢復正常，因此冷凝集素滴度越高，提示肺炎支原體感染的可能性越大[14]。由于支原體感染抗體與巨細胞病毒感染、自身免疫性疾病等存在交叉，故CAT的特異性較低。李觀穎[15]比較CAT和ELISA早期檢測肺炎支原體的價值顯示，CAT檢測的陽性率明顯低于ELISA，但兩種方法的檢測陽性率均隨發(fā)熱時間的延長而增高。

IFA基于抗原-抗體反應，包括直接IFA和間接IFA，目前間接IFA較常用。于艷紅等[16]通過間接IFA、被動凝集法、化學發(fā)光法對沈陽兒童醫(yī)院162例呼吸道感染患兒進行肺炎支原體IgM檢測發(fā)現(xiàn)，間接IFA和被動凝集法的檢測靈敏度、特異度、準確度高于化學發(fā)光法，且間接IFA的檢測特異度高于被動凝集法、化學發(fā)光法。梅方超等[17]的研究提示，培養(yǎng)法檢測肺炎支原體感染的特異度高，但靈敏度較低，對操作者技術要求較高，同時IFA檢測靈敏度和特異度均較高，可作為早期篩查的方法。

顆粒凝集法是使用肺炎支原體體細胞膜成分致敏乳膠或明膠顆粒，在室溫下共同培養(yǎng)待檢血清和致敏顆粒，若血清內(nèi)存在特異性抗體，易發(fā)生顆粒凝集，肉眼可見抗體反應，主要是共同檢測抗體IgG及IgM。該方法操作方便、快捷，但不同抗體滴度條件下的診斷靈敏度及特異度存在差異，抗體滴度≥1:160時，診斷效力最強。嚴華杰等[18]發(fā)現(xiàn)，被動顆粒凝集法檢測肺炎支原體IgM的陽性率高于間接IFA。李勝兵[19]報道，被動顆粒凝集法、間接IFA檢測肺炎支原體的陽性率分別為33.06(81/245)和28.98%(71/245)，兩種方法檢測一致性Kappa值為0.733，具有中等程度的診斷一致性，故兩者聯(lián)合檢測可為肺炎支原體感染提供全面診斷依據(jù)。因此，顆粒凝集法可用于肺炎支原體感染診斷，但其與間接IFA聯(lián)合應用仍需進一步探討。

ELISA是將酶標記抗人IgM及IgG單克隆抗體，可分別檢測血清抗體IgM、IgG，并進行定量分析，可與PCR技術相比擬，不需要特殊設備，但個別患者需采集雙份血清。黃象維等[20]研究顯示，ELISA檢測肺炎支原體的陽性率高于CAT，且發(fā)熱1～3 d、4～7 d、8～14 d、≥15 d采用ELISA檢測肺炎支原體的陽性率均明顯高于CAT。岳曉紅等[21]報道稱，實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術、膠體金法及ELISA可用于發(fā)病初期肺炎支原體檢測，膠體金法和ELISA可用于疾病痊愈期肺炎支原體的檢測。由此可見，ELISA可用于疾病早期及疾病痊愈期的肺炎支原體檢測。另外，補體結(jié)合試驗主要檢測抗體IgM，但容易與生殖道支原體、人體組織等產(chǎn)生交叉反應，且操作繁雜，不適宜在臨床應用。

在肺炎支原體感染急性期和恢復期，肺炎支原體抗體滴度升高4倍以上，是臨床診斷的金標準，發(fā)病1周左右IgM陽性率約為80%，且血清IgM抗體滴度隨癥狀的持續(xù)而增高，其診斷靈敏度隨之增高[22]，IgM陽性提示近期感染；因此，IFA和(或)顆粒凝集法、ELISA可用于肺炎支原體感染的早期診斷。IgG抗體陽性并不提示肺炎支原體的現(xiàn)癥感染，可用于回顧性診斷及流行病學調(diào)查。目前我國肺炎支原體抗體試劑盒的靈敏度及特異度參差不齊，有學者曾經(jīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR的檢測結(jié)果對臨床普遍使用的12種商用肺炎支原體IgM試劑盒進行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肺炎支原體肺炎發(fā)病6 d內(nèi)，多數(shù)肺炎支原體IgM試劑盒的陽性率低于10%，陽性率最高者低于30%[23]。可見，絕大多數(shù)醫(yī)院僅通過血清學抗體檢測不能實現(xiàn)肺炎支原體肺炎的及時確診。

3.4分子診斷技術 分子診斷技術自20世紀60年代出現(xiàn)以來，大致經(jīng)歷了基于分子雜交的分子技術、核酸測序技術、基于分子構(gòu)象的分子診斷技術、定量PCR技術等階段。目前，分子診斷技術檢測的靈敏度、準確度、特異度得到了快速提升。

3.4.1核酸雜交 通過檢測使用生物素、酶等標記的探針和核酸片段得到的特異雜交信號確定病原體是最先出現(xiàn)的核酸雜交技術。探針是核酸雜交的關鍵，1987年Hyman[24]用載體構(gòu)建支原體基因文庫，并從中篩選制備出特異性DNA探針，通過斑點雜交，可檢測僅含0.1 ng的特異性支原體DNA，其檢測的特異度和靈敏度接近100%，尤其是隨后的熒光原位雜交，在分子診斷技術早期發(fā)揮了關鍵性作用，但該技術主要應用于生殖道支原體(如人型支原體)感染的診斷。

3.4.2實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR技術的出現(xiàn)彌補了臨床肺炎支原體等非典型病原體病原分離培養(yǎng)困難的缺陷。Morozumi等[25]采用實時定量PCR檢測429例成人和兒童肺炎臨床標本中的肺炎支原體16S核糖體RNA，整個檢測過程僅耗時2 h，且較傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法的靈敏度和特異度大大提高，PCR技術檢測快、靈敏度和特異度高，可用于肺炎支原體感染的早期診斷。劉君麗[26]研究顯示，實時熒光定量PCR檢測可作為診斷前期肺炎支原體感染的可靠、有效方法。馮志山等[27]報道，熒光定量PCR與多重PCR檢測肺炎支原體的一致性高于被動凝集法，且熒光定量PCR的肺炎支原體陽性檢出率與患者病程相關。此外，肺炎支原體感染易合并病毒和細菌混合感染，難以區(qū)分攜帶者或感染者，因此PCR陽性結(jié)果仍需進一步分析才能確診。

在病原耐藥性檢測中，PCR也起到了重要作用。近年來，全球范圍內(nèi)肺炎支原體大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率呈上升趨勢，調(diào)查顯示，北美地區(qū)肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率已經(jīng)超過10%，東亞地區(qū)是全球肺炎支原體大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥情況最嚴重的地區(qū)，其中日本和中國肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率均已接近90%，我國肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥水平普遍為高水平耐藥[28]。大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療失敗不僅導致支原體肺炎退熱時間和抗感染療程延長，少數(shù)患者也因未得到及時有效治療而進展為重癥肺炎，甚至危及生命[29]。研究發(fā)現(xiàn)，1/3經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療支原體感染者23S核糖體RNA基因出現(xiàn)了點突變[30]，其核糖體蛋白質(zhì)L4和L22沒有變化，核糖體RNA基因選擇性突變，造成了對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥。Stakenborg等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體對應的16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感菌株的最低抑菌濃度只有0.03～0.125 μg/mL，耐藥菌株的最低抑菌濃度為8～16 μg/mL；對應的15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感菌株僅0.06～0.5 μg/mL，耐藥菌株的最低抑菌濃度>64 μg/mL。應用PCR技術進行耐藥檢測，減少了培養(yǎng)、藥敏試驗等復雜的檢驗步驟。

3.5其他指標 為進一步提高肺炎支原體感染的診斷準確性，吳素麗等[32]對328例疑似肺炎支原體感染患者進行分析，根據(jù)DNA結(jié)果分為肺炎支原體陽性組和肺炎支原體陰性組，并選取健康兒童作為對照發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體感染患者外周血白細胞、C反應蛋白、D-二聚體水平升高，各指標對肺炎支原體感染具有一定的診斷價值，聯(lián)合運用有助于肺炎支原體的臨床篩查及早期診斷。張玲玲等[33]利用ELISA檢測對比肺炎支原體肺炎、非肺炎支原體肺炎患兒和健康兒童的血清標志物發(fā)現(xiàn)，血清七肽TVNFKLY和LPQRLRT可作為診斷兒童肺炎支原體肺炎的潛在標志物，兩者聯(lián)合診斷兒童肺炎支原體肺炎的靈敏度為92.5%(111/120)，特異度為90.83%(218/240)，準確度為91.39%(329/360)。另有研究發(fā)現(xiàn)，重癥暴發(fā)性支原體肺炎患兒血清C反應蛋白、白細胞介素-6、白細胞介素-8及腫瘤壞死因子-α表達水平均顯著升高，提示上述細胞因子參與了重癥肺炎的發(fā)生、發(fā)展[34]，但缺乏診斷特異性。

4 小 結(jié)

近年來，肺炎支原體感染的患病率處于較高水平，缺乏特異性臨床特征，無法快速診斷且存在病原菌耐藥給肺炎支原體肺炎的臨床治療帶來很大困難，嚴重威脅患者健康，甚至威脅重癥患者生命安全。深入研究肺炎支原體檢測方法和診斷標志物對肺炎支原體肺炎的及時診斷具有重要的臨床意義。與分離培養(yǎng)、血清抗原抗體檢測相比，分子診斷技術具有檢測快、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，可用于肺炎支原體感染的早期診斷，也可用于耐藥性檢測以及肺炎支原體感染者與攜帶者的鑒別。