外泌體：心肌缺血再灌注損傷干預(yù)新靶點(diǎn)▲

胡夢(mèng)弦 何貴新 秦偉彬 吳成強(qiáng) 林 琳 王明遠(yuǎn) 馮雨菲 鄭國(guó)坤

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧市 530299，電子郵箱：2836923992@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管二區(qū)，南寧市 530023)

【提要】 缺血再灌注損傷作為影響冠狀動(dòng)脈介入術(shù)預(yù)后的常見(jiàn)影響因素，其嚴(yán)重程度與心臟功能的恢復(fù)息息相關(guān)，但目前對(duì)于該損傷尚無(wú)特別的防治手段。外泌體的出現(xiàn)，揭開(kāi)了其新的治療領(lǐng)域。外泌體由多種細(xì)胞分泌，廣泛存在于各種組織細(xì)胞和體液中，對(duì)機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有調(diào)節(jié)作用，能夠通過(guò)調(diào)控各種因子改善受損的心肌細(xì)胞，對(duì)恢復(fù)心臟功能具有重要的作用。本文通過(guò)外泌體對(duì)心肌組織缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞的修復(fù)、巨噬細(xì)胞表型的調(diào)控、心肌纖維化及新生血管的增生等方面的影響進(jìn)行綜述，望為心肌組織缺血再灌注損傷的治療干預(yù)提供新的思維方向。

冠狀動(dòng)脈狹窄或栓塞是心肌組織缺血的主要原因之一，長(zhǎng)期缺血將導(dǎo)致心肌細(xì)胞不同程度的功能代謝紊亂、損傷甚至死亡。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)是目前治療冠心病的有效方式，其通過(guò)植入導(dǎo)管、球囊、支架等方式使狹窄或栓塞的血管再度通暢，恢復(fù)血流對(duì)心肌細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供給。但在恢復(fù)血供的同時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致已受損的心肌細(xì)胞出現(xiàn)缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)，擴(kuò)大心臟損傷的范圍，加重心肌重塑，或?qū)е滦牧λソ叩漠a(chǎn)生。如何規(guī)避或降低該損傷對(duì)提高手術(shù)療效具有重要的意義。外泌體是一種可由多種細(xì)胞分泌的囊泡小體，其在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，可操作性強(qiáng)，能夠通過(guò)減輕心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、抑制心肌纖維化、促進(jìn)心肌細(xì)胞的修復(fù)及新生血管的生成等方面減輕IRI。故本文針對(duì)外泌體對(duì)心肌IRI的干預(yù)機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體簡(jiǎn)介 外泌體是一類由多種細(xì)胞分泌的，富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA及各種RNA[例如mRNA、微小RNA(microRNA,miRNA) 和環(huán)狀RNA]的囊泡小體，直徑為30～150nm。目前公認(rèn)的外泌體形成模式是：由細(xì)胞膜內(nèi)陷形成多囊泡體，多囊泡體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞質(zhì)膜融合形成一種管腔內(nèi)囊泡從而釋放出胞外形成外泌體。研究表明，外泌體在機(jī)體的細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答、抗原呈遞等生命代謝過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。其作用方式可能包括：(1)外泌體直接作用于靶細(xì)胞膜表面信號(hào)分子進(jìn)行信息傳遞交流[1]；(2)外泌體通過(guò)釋放信號(hào)分子作用于靶細(xì)胞膜表面的信號(hào)受體，從而進(jìn)行細(xì)胞間的信號(hào)傳遞[2]；(3)外泌體囊泡膜與靶細(xì)胞細(xì)胞膜識(shí)別融合后，通過(guò)外泌體內(nèi)容物的轉(zhuǎn)輸進(jìn)行信息的轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。

1.2 外泌體提取方式 根據(jù)外泌體的體積、密度及表面特征性標(biāo)志物，目前提取的方法可分為：(1)超速離心法，其根據(jù)外泌體的體積及密度在離心力作用、磷酸鹽緩沖液沖洗等流程后收集，適用于體積較大外泌體的收集，其工藝成熟，是目前外泌體收集的常用方法。(2)密度梯度離心法，是一種較超速離心法更為嚴(yán)格、純度更高的一種提取方式，通常將待分離溶液滴入至不同溶度梯度的蔗糖等小分子溶劑中，不同密度物質(zhì)間存在沉降系數(shù)差，在離心力的作用下各物質(zhì)以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶[4]。(3)超濾法，是一種根據(jù)外泌體體積進(jìn)行分離的方法，其原理是利用半透膜的微孔結(jié)構(gòu)，在一定外界推動(dòng)力的作用下將外泌體選擇性回收；該方法的缺點(diǎn)是較大的囊泡和蛋白質(zhì)被濾膜吸附，可能導(dǎo)致濾孔堵塞，影響外泌體的收集[5]。(4)免疫磁珠法，是運(yùn)用核—?dú)さ暮铣煞椒ê铣蓛?nèi)含超順磁性物質(zhì)、外裹特異性表面標(biāo)記物的高分子免疫磁珠，這些免疫磁珠能結(jié)合相應(yīng)的外泌體，在外加磁場(chǎng)的吸引下可做定向移動(dòng)。

2 心肌細(xì)胞IRI的機(jī)制

IRI的發(fā)生涉及多種復(fù)雜的機(jī)制。目前，已知的機(jī)制包括：(1)氧化自由基增多。缺血心肌區(qū)域內(nèi)的氧化自由基顯著增多，其能攻擊細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)各種生物膜成分中的不飽和脂肪酸，破壞膜的完整及通透性、提高生物膜流動(dòng)性，導(dǎo)致細(xì)胞水腫，細(xì)胞質(zhì)疏松及細(xì)胞順應(yīng)性降低。(2)線粒體穩(wěn)態(tài)失衡。線粒體功能正常是減少I(mǎi)RI的關(guān)鍵因素。當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生再灌注損傷后，細(xì)胞內(nèi)能量失衡，心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和(或)三磷酸腺苷耗盡，隨后線粒體鈣負(fù)荷達(dá)到病理高水平，誘導(dǎo)線粒體內(nèi)膜滲透率過(guò)渡孔開(kāi)放，各種因子流入線粒體內(nèi)，使得線粒體腫脹進(jìn)而導(dǎo)致三磷酸腺苷的產(chǎn)生減少，細(xì)胞迅速死亡[6]。另一方面，來(lái)源于線粒體的超氧化物陰離子大量產(chǎn)生，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重[7]。(3)鈣離子超載。Ca2+作為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的第二信使，在IRI發(fā)生時(shí)，由于心肌細(xì)胞膜上的Ca2+通道相關(guān)酶的活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活磷脂酶進(jìn)而溶解細(xì)胞內(nèi)的生物膜，最終使得心肌細(xì)胞損傷或凋亡[8]。(4)炎癥反應(yīng)。缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥在心肌細(xì)胞損傷和心功能障礙中起重要作用[9]。心肌缺血再灌注能誘導(dǎo)核因子κB信號(hào)通路的激活以及淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子表達(dá)。而細(xì)胞因子可直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，淋巴細(xì)胞可進(jìn)一步加重心臟損傷。

3 外泌體對(duì)心肌IRI的影響

3.1 外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞的作用 當(dāng)發(fā)生IRI時(shí)，心肌細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序，外周血管中的單核細(xì)胞逐漸向炎癥區(qū)域募集，在各種促分化因子的作用下，分別轉(zhuǎn)化成M1、M2型巨噬細(xì)胞，發(fā)揮促炎或抗炎等作用。研究表明，在急性心肌梗死出現(xiàn)后的3 d內(nèi)，M1型巨噬細(xì)胞大量增加，在第3天達(dá)到高峰，且白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、IL-8等細(xì)胞因子水平增高；在3 d后，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，在5～7 d時(shí)，M1型巨噬細(xì)胞逐漸被M2型巨噬細(xì)胞所代替，且促進(jìn)愈合因子水平增高，如成纖維生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子IL-10等[10]。此外，在心肌損傷的同時(shí)，血液循環(huán)中的單核細(xì)胞被招募至受損心肌組織，取代原有的M2型巨噬細(xì)胞，然后分化為具有診斷性意義的M1型巨噬細(xì)胞，加重心肌損傷[11-12]。在心肌損傷的修復(fù)過(guò)程中，調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞的水平確實(shí)能夠減輕心肌組織的損傷范圍，但不意味著要完全抑制M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)。Jia等[13]發(fā)現(xiàn)，完全抑制心肌組織中M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)并不能有效減輕心肌細(xì)胞的纖維化，而通過(guò)增加M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量，并減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞數(shù)量，才能夠有效減輕小鼠心肌纖維化程度。因此，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生對(duì)減輕心肌纖維化水平、降低IRI的嚴(yán)重程度具有重要的意義。外泌體作為一類由多種細(xì)胞分泌的囊泡物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，減輕炎癥反應(yīng)。有學(xué)者將來(lái)源于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體與單核巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)外泌體能夠有效促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的增長(zhǎng)，在一定水平上抑制M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)，并促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，同時(shí)可提高IL-10的表達(dá)水平，而降低炎性因子IL-8、IL-12的分泌水平，且這種作用效果與外泌體的溶度呈正比[14]。這對(duì)減輕心肌細(xì)胞炎癥、緩解IRI具有重要作用。

3.2 外泌體對(duì)心肌纖維化的抑制作用 當(dāng)炎癥因子被抑制后，促纖維化信號(hào)增強(qiáng)，心肌組織進(jìn)入纖維增殖期。成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞在心肌纖維化的形成中發(fā)揮著主要作用，正常的心肌組織中不存在肌成纖維細(xì)胞，當(dāng)心肌纖維化開(kāi)始時(shí)，成纖維細(xì)胞在信號(hào)因子的作用下大量增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。心臟組織的纖維增殖期可分為兩大過(guò)程，即修復(fù)性纖維化(梗死區(qū)心肌重塑)和反應(yīng)性纖維化(非梗死區(qū)心室壁重塑)。修復(fù)性心肌纖維化對(duì)于維持心室的功能、保護(hù)心臟的完整性至關(guān)重要，但過(guò)度的心肌纖維化將引起心室收縮力進(jìn)行性下降，甚至導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。因此，控制肌成纖維細(xì)胞水平對(duì)減少心肌瘢痕組織至關(guān)重要。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β,TGF-β)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)是多效性細(xì)胞因子，對(duì)肌成纖維細(xì)胞的形成具有促進(jìn)作用，研究表明,外泌體源性miRNA-425和miRNA-744能夠抑制TGF-β受體蛋白的表達(dá)而減少肌纖維的表達(dá)，從而抑制心肌纖維化[15-16]。方碩[17]通過(guò)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體的蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)行裂解，發(fā)現(xiàn)外泌體的核酸成分是抑制心肌細(xì)胞纖維化的主要物質(zhì)，且核酸的主要成分是miRNA；在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，其發(fā)現(xiàn)miRNA-23a和miRNA-125b通過(guò)抑制TGF-β/Smad通路來(lái)減少肌成纖維細(xì)胞的形成。研究顯示，miRNA-133a通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1和CTGF的表達(dá)水平來(lái)抑制心肌纖維化，而轉(zhuǎn)染miRNA-133a的心房組織TGF-β1和CTGF的表達(dá)水平下降，而敲除miRNA-133a的成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞中CTGF的表達(dá)水平上升，心肌纖維化水平也隨之改變[18-19]。由此可見(jiàn)，外泌體或通過(guò)miRNA抑制心肌細(xì)胞纖維化，從而減輕IRI的嚴(yán)重程度。

3.3 外泌體對(duì)受損心肌的修復(fù)作用 冠狀動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致心肌細(xì)胞長(zhǎng)期處于缺血狀態(tài)，當(dāng)支架植入后心肌組織恢復(fù)血供將會(huì)使心肌細(xì)胞發(fā)生IRI，如何將IRI降至最低是減少經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后遺癥的關(guān)鍵，而外泌體作為修復(fù)受損心肌的“治療劑”發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。產(chǎn)進(jìn)中等[20]發(fā)現(xiàn)，對(duì)大鼠心臟進(jìn)行缺血預(yù)處理后，其血清外泌體含量明顯高于未經(jīng)缺血預(yù)處理的大鼠，此外在IRI發(fā)生前將外泌體注入模型鼠靜脈內(nèi)可使得心肌梗死面積顯著減少。心肌球源性干細(xì)胞(cardiosphere-derived cell，CDC) 是一類可以促進(jìn)心肌細(xì)胞再生的心肌來(lái)源球細(xì)胞，研究表明，CDC分泌的外泌體可以復(fù)制CDC的心臟保護(hù)和再生作用[21]，能夠有效地抑制心肌細(xì)胞的凋亡[22]。 Gallet等[23]發(fā)現(xiàn)，在急性心肌梗死和慢性心肌梗死的豬模型中，將來(lái)源于CDC的外泌體注射到梗死的心肌內(nèi)可明顯減輕IRI，提高左心室射血分?jǐn)?shù)，并抑制心臟不良重塑。Xiao等[24]對(duì)心臟祖細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激處理后發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，心臟祖細(xì)胞能夠分泌更多的外泌體，并且外泌體中miRNA-21表達(dá)水平顯著提高，能夠通過(guò)恢復(fù)miRNA-21/程序性細(xì)胞死亡-4通路阻止心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激相關(guān)性凋亡。

3.4 外泌體對(duì)新生微血管形成的促進(jìn)作用 促進(jìn)新生微血管的形成是外泌體的一項(xiàng)重要功能，其包括促進(jìn)微血管的生成和增殖。這些作用與外泌體的分化、遷移以及原有存在于血管中的外泌體有關(guān)。 Arslan等[25]發(fā)現(xiàn)，來(lái)自間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體可以通過(guò)激活促生長(zhǎng)因子信號(hào)，一定程度上恢復(fù)受損細(xì)胞的生物活性，并且減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而提高心肌活力，抑制心肌IRI后的不良重構(gòu)。同樣有研究顯示，由間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體在微血管內(nèi)內(nèi)化后，對(duì)血管的生成及增殖和心肌細(xì)胞的修復(fù)發(fā)揮重要的作用[26]。研究表明，將來(lái)自間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體注射到卒中大鼠體內(nèi)，可以通過(guò)促進(jìn)血管生成、神經(jīng)突重塑和神經(jīng)細(xì)胞新生來(lái)緩解癥狀[27]。此外，在缺氧條件下來(lái)源于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體不僅能夠促進(jìn)臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生和毛細(xì)血管的生成，還豐富了臍帶毛細(xì)血管網(wǎng)，使得血流得以恢復(fù)[28]。還有研究表明，心臟祖細(xì)胞釋放的外泌體可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌，誘導(dǎo)心肌組織和血管的再生，從而顯著改善心臟功能[29-30]。

4 小結(jié)與展望

心肌IRI是心梗后不可避免的病理過(guò)程，可造成心肌組織微循環(huán)障礙和細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。外泌體作為由多種細(xì)胞分泌的囊泡小體，攜帶各種生物信號(hào)分子，其利用表面特異性膜蛋白與特定靶細(xì)胞結(jié)合，完成細(xì)胞間生物信號(hào)的特異性傳遞。目前大量研究表明外泌體能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)減少心肌細(xì)胞受損，調(diào)節(jié)心肌纖維化、減低心臟瘢痕面積和促進(jìn)新生血管的形成以改善心臟微循環(huán)。因此，以外泌體為研究靶點(diǎn)更深入地研究心肌IRI對(duì)心肌梗死患者的預(yù)后具有重要的意義。