棗瘋病發(fā)生機制與防治研究進(jìn)展

李繼東， 陳立川， 王會魚， 陳鵬， 楊琦琪， 張玉， 李奇承， 馮建燦

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省果樹瓜類生物學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.鄭州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450044；4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

棗(Ziziphusjujuba)是中國重要果樹，已有千余年的栽培和利用歷史[1]，2018年全國干棗產(chǎn)量547.3萬t[2]，是第一大干果樹種。棗瘋病是由棗瘋病植原體(Canidatusphytoplasmaziziphi)引起的一種致死性傳染病害，發(fā)病樹產(chǎn)生叢枝、黃化、小葉、花器變?nèi)~等癥狀，逐漸枯死，對棗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成極大危害[3-4]。近年來，由于紅棗效益下降，棗園缺乏管理，傳統(tǒng)棗區(qū)的棗瘋病發(fā)生日益嚴(yán)重。本文綜述了棗瘋病發(fā)生機制和防治的研究進(jìn)展，就發(fā)病分子機制、精準(zhǔn)施藥和物理防治等研究方向提出了展望，能夠為棗瘋病發(fā)生機制和防治提供參考。

1 棗瘋病發(fā)生機制及研究現(xiàn)狀

1.1 棗瘋病病原及傳播途徑

1.1.1 棗瘋病病原鑒定 1950年，王鳴岐[5]出版的《河南植物病害名錄》中記載了棗“叢葉病”，將其歸為病毒病類，并記載了1939—1941年在新鄭、登封、潭頭、南陽、靈寶等地采集有標(biāo)本。1951年，季良[6]首次正式報道了棗瘋病，描述其病癥為“葉的叢生，與花器的退化，葉的黃變，冬季不落葉等情況”，發(fā)現(xiàn)該病具有傳染性，認(rèn)為可能是一種病毒病害。

HONG等[7]、KIM[8]、翁心桐等[9]、王清和等[10]分別進(jìn)行了病癥觀察、嫁接傳病試驗，證實了棗瘋病可以通過嫁接傳病，認(rèn)為病毒是引起發(fā)病的病原體。王清和等[10]還在病葉表皮細(xì)胞內(nèi)觀察到了五角形結(jié)晶體。

1967年，DOI等[11]從桑樹萎縮病、馬鈴薯叢枝病和泡桐叢枝病病株篩管中發(fā)現(xiàn)了類菌原體(Mycoplasma-like organism, MLO)，后來被證明為植原體(Phytoplasma)。1973年，YI等[12]在感染棗瘋病葉脈篩管中觀察到了植原體。1974年，中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所病毒研究組和山東省果樹科學(xué)研究所棗瘋病研究組[13]用電子顯微鏡在棗瘋病樹葉中檢查到棒狀質(zhì)粒，在健康對照葉片中未見到，認(rèn)為是棗瘋病病原體；此外在棗瘋病樹葉和對照健康葉片中，還觀察到細(xì)纖維狀質(zhì)粒，在感病組織中有增加趨勢，認(rèn)為棗瘋病是由類菌原體和病毒共同引起的。王祈楷等[14]分析了病樹根部和瘋枝韌皮部勻漿提純物，認(rèn)為棗瘋病是由類菌原體單獨引起。

在1994年召開的第十屆國際菌原體組織(International Organization of Mycoplasma，IOM)大會上，植原體被定義為柔膜菌綱的一個屬[15]。雖然有成功培養(yǎng)的報道[16]，但植原體培養(yǎng)條件苛刻，人工培養(yǎng)十分困難，這也限制了對其分類定名和發(fā)病機制的研究。目前植原體仍采用候選種(Candidatus)的分類系統(tǒng)命名，棗瘋病植原體命名為Candidatusphytoplasmaziziphi[17]。

除了通過對植原體的顯微觀察外[13,18]，酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)也曾用于棗瘋病植原體的檢測[19-20]，但這些技術(shù)都較為復(fù)雜。采用二脒基苯基吲哚(DiAmidino PhenylIndole，DAPI)對植原體進(jìn)行熒光染色可以有效對植原體進(jìn)行定性和定量檢測[21]。通過DAPI染色，研究了植原體在病樹上的分布規(guī)律[22-23]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)問世后，LEE等[24]開發(fā)了植原體16SrDNA序列擴增的通用引物，PCR技術(shù)也被用于棗瘋病植原體的檢測上。NAMBA等[25]首先報道了棗瘋病植原體16SrDNA序列的擴增和測序，何放亭等[26]首先在國內(nèi)開展了PCR檢測棗瘋病植原體的研究，TIAN等[27]建立了棗瘋病植原體16SrDNA的巢式PCR和RFLP分子檢測體系，此后PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于棗瘋病的檢測和分析上[28-29]。

1.1.2 基于16SrDNA的棗瘋病植原體分類 16SrDNA編碼微生物核糖體上的16SrRNA，序列具有相對保守性，常用于細(xì)菌等微生物鑒定、進(jìn)化分析和分類。LEE等[24]根據(jù)16SrDNA的RFLP分析，將北美的40種植原體分為9組14個亞組。ZHU等[30]用PCR擴增并測序了棗瘋病植原體的16SrDNA序列，認(rèn)為棗瘋病與櫻桃致死黃化病的植原體親緣關(guān)系緊密，與榆樹黃化病植原體關(guān)系較近但有差別，這兩者在分類上應(yīng)屬于榆樹黃化組(第V組)的一個新亞組。JUNG等[17]通過對來自日本和韓國4個地區(qū)的病棗樣本，及GeneBank中其他44個植原體16SrDNA序列進(jìn)行對比，認(rèn)為棗瘋病植原體為一個單獨的種，定名為CandidatusPhytoplasmaziziphi，屬榆樹黃化組。隨著越來越多的植原體被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在植原體屬已經(jīng)有36個組，棗瘋病植原體仍屬于榆樹黃化組[31-32]。

1.1.3 媒介昆蟲 植原體病害靠刺吸式昆蟲傳播，主要是葉蟬類。中國葉蟬科有94屬220種[33]，在棗樹上寄生的有片突菱紋葉蟬(Hishimonuslamellatus)、凹緣菱紋葉蟬(Hishimonussellatus)、小綠葉蟬(Empoascaspp.)、斑葉蟬(Erythroneurasp.)、橫帶葉蟬(Scaphoideusfestivus)、大青葉蟬(Cicadellaviridis)、新縣長突葉蟬(Batracomorphusxinxianensis)、紅閃小葉蟬(Zyginasp.)、白邊大葉蟬(Kollapaulula)、桃一點葉蟬(Singaporashinshana)、一點木葉蟬(Phlogotettixcyclops)、條沙葉蟬(Psammotettixstriatus)、窗耳葉蟬(Ledraauditura)等[34]，以及橙帶擬菱紋葉蟬(Hishimonoidesaurifascialis)[35]，目前已證實為棗瘋病植原體介體昆蟲的有凹緣菱紋葉蟬(Hishimonussellatus)[34]、橙帶擬菱紋葉蟬(Hishimonoidesaurifascialis)[35]，片突菱紋葉蟬(Hishimonuslame-llatus)、大青葉蟬(Cicadellaviridis)和白邊大葉蟬(Kollapaulula)等[36]。

1.2 棗瘋病發(fā)病過程中植株生理生化變化

關(guān)于棗瘋病發(fā)生后植株生理生化變化的研究，集中于營養(yǎng)物質(zhì)、次生代謝物、激素含量和光合作用變化等方面。莽克強等[37]研究表明，棗瘋病葉中游離氨基酸總量高出健康葉10～15倍，谷酰胺和天門冬酰胺含量高出健康葉4～5倍，精氨酸也出現(xiàn)不正常的積累，瘋枝上的健康葉也有不正常的變化。趙錦等[38]研究了棗瘋病樹中內(nèi)源激素含量變化，結(jié)果表明，健康和發(fā)病樹葉內(nèi)IAA、GA3和ABA的含量沒有區(qū)別，生長后期病葉中玉米素的含量顯著高于健康株。

劉雅倩等[39]研究了植原體侵染對棗樹葉綠素含量的影響，結(jié)果表明，大田條件下，‘贊皇大棗’病葉的葉綠素含量及葉綠素a/b值顯著低于健康葉片，在培養(yǎng)基中添加IBA、6-BA可以提高發(fā)病‘婆棗’組培苗的葉綠素含量，促進(jìn)病苗的光合作用。LIU等[40]研究了抗病品種‘星光’與感病品種‘婆棗’在植原體侵染后的光合作用相關(guān)指標(biāo)變化，結(jié)果表明，感病品種的葉綠素和類胡蘿卜素含量在植原體侵染后期顯著降低，而抗病品種在侵染初期顯著升高。與未感染植株相比，抗病品種在侵染初期的主要光化學(xué)參數(shù)(Fv/Fm、ΦPSII和qP)顯著降低，而這種情況在感病品種中在侵染后期才會出現(xiàn)。

1.3 棗瘋病發(fā)病過程中基因表達(dá)變化

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR、抑制消減雜交(Suppressive Subtraction Hybridization, SSH)、基于高通量測序的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等技術(shù)開始應(yīng)用于棗瘋病研究，測定發(fā)病過程中的基因表達(dá)變化，以確定與發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因。

LIU等[41]構(gòu)建了抗棗瘋病品種‘星光’植原體脅迫的抑制消減雜交SSH 文庫，從200個單獨序列標(biāo)簽中注釋了77個基因，RT-PCR表明TLP、PR10、HSP70、ERF和激酶相關(guān)蛋白在不同的植原體侵染時期上調(diào)。在此基礎(chǔ)上，又先后對從SSH雜交中篩選出的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶ZjGSTU1基因[42]和真核生物翻譯延伸因子ZjeEF-1α基因[43]進(jìn)行了克隆、表達(dá)特性和功能分析，初步探討了這些基因在對棗瘋病抗性中的作用。

2014和2016年，LIU等[44]和HUANG等[45]先后完成了灰棗和駿棗的基因組測序，為棗分子生物學(xué)研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。在此基礎(chǔ)上，先后鑒定了棗的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族[46]、分裂源蛋白激酶系列(Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK, MAPKK, MAPKKK)基因家族[47-48]、堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族[49]、堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族[50]，并通過轉(zhuǎn)錄組分析和RT-PCR檢測了這些基因在棗瘋病發(fā)生中的變化，篩選出了一些對植原體侵染有響應(yīng)的基因[51]。

SHAO等[52]用高通量測序技術(shù)分析了健康和感病棗樹的miRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了12個上調(diào)和10個下調(diào)2倍以上的miRNA，對其下游標(biāo)靶基因進(jìn)行了預(yù)測。此外，還鑒定了ZjSPL轉(zhuǎn)錄因子家族的18個成員，其中11個為miR156的靶標(biāo)，8個與植原體侵染響應(yīng)有關(guān)[53]。FAN等[54]通過對比健康和感病棗樹的轉(zhuǎn)錄組，在葉片文庫中篩選出4 266個差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)，在花文庫中篩選出3 800個DEGs，認(rèn)為其中與氨基酸代謝和類胡蘿卜素途徑相關(guān)的基因與棗瘋病導(dǎo)致的營養(yǎng)缺乏、黃化、叢枝和小葉相關(guān)。SUN等[55]鑒定了棗赤霉素響應(yīng)因子(Auxin Response Factor, ARF)基因家族的16個成員，其中5個在植原體侵染后差異表達(dá)，ZjARF4是miR167、miR529和miR2950等miRNA的直接標(biāo)靶，可能與棗瘋病株的花發(fā)育相關(guān)；此前，他們還研究了棗中長末端重復(fù)擬轉(zhuǎn)座子(Long Terminal Repeats, LTR-retrotransposon)對植原體侵染的轉(zhuǎn)錄激活差異[56]。

YE等[57]、WANG等[58]和WANG 等[59]針對健康棗嫁接病芽的棗瘋病發(fā)生過程和用四環(huán)素處理組培棗苗的治愈過程進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白組組合分析，發(fā)現(xiàn)茉莉酸途徑在棗瘋病發(fā)生和治愈過程中起重要作用，此外還鑒定了棗NAC[60]、WRKY[61]、TCP[62]、AP2/ERF[63]等轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，并分析了它們在棗瘋病發(fā)生和治愈過程中的表達(dá)動態(tài)。

1.4 棗瘋病植原體基因組及致病因子研究

1.4.1 棗瘋病基因組核酸分離及測序 由于無法人工培養(yǎng)，在植原體基因組測序時只能將其與寄主植物或昆蟲的DNA一起提取，再進(jìn)行分離。植原體的DNA富含A/T，分子大小比植物或動物寄主小，因此可以用氯化銫密度梯度離心，或雙向脈沖電泳等方法將其與真核生物寄主的DNA分離開來。陳昱圻等[64]、傅強等[65]、劉玲雪等[66]分別報道了用氯化銫密度梯度離心和雙向脈沖電泳分離出棗瘋病植原體DNA。

2018年，WANG等[67]成功測序棗瘋病植原體的NKY株系，其序列總長750 803 bp，G/C含量23.3%，有694個蛋白編碼基因，2個rRNA基因，31個tRNA基因，4個潛在移動元件(Potential Mobile Units, PMUs)。董雅容等[68]報道北京農(nóng)學(xué)院測序了一個冬棗植原體序列(JWB-Dongzao)，但數(shù)據(jù)尚未公開發(fā)表。

1.4.2 棗瘋病致病因子預(yù)測及效應(yīng) 致病因子是病原微生物分泌的效應(yīng)蛋白，可以和寄主體內(nèi)的標(biāo)靶蛋白互作，進(jìn)而干擾寄主體內(nèi)的轉(zhuǎn)運、基因表達(dá)和防御反應(yīng)等許多細(xì)胞內(nèi)過程[69]。棗瘋病植原體基因組的測序完成，為開展致病因子分析奠定了基礎(chǔ)。唐嫣[70]分析了JWB-NKY株系的基因組序列，從中預(yù)測獲得28個潛在致病因子，其中JWB406和JWB157分別引起叢枝和花變?nèi)~癥狀，通過cDNA文庫初步篩選了與這些致病因子互作的寄主蛋白。屈曉逸[71]也從棗瘋病植原體基因組中預(yù)測了11個潛在的致病因子蛋白。

膜蛋白在植原體的代謝和致病機制中也起著非常重要的作用，高瑞等[72]克隆并分析了棗瘋病植原體免疫膜蛋白(Immunodominant Membrane Protein，IMP)基因，董雅容等[68]從JWB-Dongzao序列中分析并克隆到一個免疫優(yōu)勢膜蛋白基因imp-DZ，去掉跨膜區(qū)域后在大腸桿菌中表達(dá)，為開展植原體與寄主植物互作機制研究提供了依據(jù)。

2 棗瘋病防治研究現(xiàn)狀

2.1 棗瘋病抗病品種的選擇

中國棗種質(zhì)資源豐富，不同品種間對棗瘋病的抗性表現(xiàn)不同。任國蘭等[73]研究發(fā)現(xiàn)，灰棗、扁核酸為感病品種，靈寶棗和九月青抗病，雞心棗、廣洋棗介于中間。田國忠等[74]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，婆婆棗和洪趙小棗有高度抗性，而梨棗和扁核酸則為感病品種。趙錦等[75]從29份抗病種質(zhì)資源中選擇出駿棗、南京木棗、秤砣棗和清徐圓棗等4個高抗單系，肖京等[76]從27個駿棗品系中選擇出4個高抗品系，田國忠等[77]從46個棗品系中選擇出駿棗、壺瓶棗兩個高抗品系，趙進(jìn)紅等[78]選育出4個抗棗瘋病品種，其中岱健棗和岱康棗獲得國家植物新品種權(quán)，泰山圓紅棗和泰山長紅棗通過山東省林木良種審定，劉孟軍等[79]從駿棗變異單株中選擇出來的高抗品種星光，通過河北省林木品種審定委員會審定，將星光嫁接到感病的婆棗砧木上，嫁接后98 d，星光中用PCR檢測不出植原體[80]。

2.2 棗瘋病的物理防治

物理方法截斷植原體傳播途徑，是棗瘋病防治的有效措施。因此，在未闡明棗瘋病病原時，就總結(jié)出了砍伐病株，減少傳染源的防治方法[9-10]，后又發(fā)現(xiàn)，環(huán)剝能阻止病原物的運轉(zhuǎn)，剪除瘋枝能治愈初發(fā)病的病樹[81]。植原體沒有細(xì)胞壁，對環(huán)境變化敏感，因此采用高溫和低溫處理均能對其有殺滅作用[82-83]。戴洪義等[84]開展了熱處理植原體脫毒苗的培育，用50 ℃的熱水處理棗瘋病枝10～20 min后扦插，能生長出健康的苗木。WANG等[85]開展了莖尖超低溫冷凍去除棗瘋病植原體的研究，將帶病莖尖預(yù)培養(yǎng)后，用培養(yǎng)基包埋，然后置于液氮中處理1 h，經(jīng)卸載液處理后，再生的芽PCR檢測不到植原體。

2.3 棗瘋病的化學(xué)防治

植原體是革蘭氏陽性致病微生物，對四環(huán)素類抗生素敏感，因此自20世紀(jì)70年代起，就開展了四環(huán)素類抗生素用于棗瘋病治療的研究。王焯等[86]利用鹽酸四環(huán)素、土霉素堿等進(jìn)行病樹注干治療，取得了明顯療效。王祈楷等[14]利用土霉素和四環(huán)素打孔注藥，也取得了明顯效果。趙錦等[23]對植原體在病樹體內(nèi)的分布特點和周年消長規(guī)律進(jìn)行研究，提出4月底至5月初展葉期是藥物治療的最佳時期。趙進(jìn)紅等[87]開展了棗瘋病大田防治藥物的篩選研究，結(jié)果表明，四環(huán)素、土霉素、螺旋霉素和紅霉素等4種抗生素均能在一定程度上控制棗瘋病情，土霉素的防治效果最好。

近年來，中草藥在植物病害防治中的應(yīng)用得到發(fā)展，趙偉[88]開發(fā)了以黃芩(Scutellariabaicalensis)、黃檗(Phellodendronamurense)、狼毒(Euphorbiafischeriana)、鬧羊花(Rhododendronmolle)等23味中草藥保護(hù)液，采取樹干注射、花期噴霧、粉劑埋根等方法，治療棗瘋病效果良好。

2.4 棗瘋病綜合防治策略

預(yù)防為主，綜合防治，一直是棗瘋病治理的原則，從園地選擇、苗木和接穗檢驗檢疫、抗病品種應(yīng)用、病樹治療及康復(fù)、防治傳毒昆蟲等多方面來解決問題[3]。除了技術(shù)層面對棗瘋病綜合防治進(jìn)行研究外，對病害發(fā)生的主導(dǎo)因素、病情分級、防疫風(fēng)險等也進(jìn)行了研究。田國忠等[74]對北京、陜西、河南、山西、安徽和浙江等棗區(qū)發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，提出高比例的無癥狀帶菌根蘗苗傳病和不利于棗樹生長的環(huán)境壓力是導(dǎo)致許多地區(qū)病害流行和加重的主導(dǎo)因素。劉孟軍等[89]根據(jù)病原濃度、癥狀表現(xiàn)和病情可控程度等，提出了組織、單枝、單株、棗園和棗區(qū)5個水平的病情分級指標(biāo)，為棗瘋病的防治提供參考。新疆目前是中國最大的棗產(chǎn)區(qū)，張靜文等[90]通過對棗瘋病分布情況、潛在危害性、寄主種類、傳播方式、根除難度等方面定性和定量指標(biāo)的綜合分析評估，認(rèn)為棗瘋病植原體屬于特別危險性林業(yè)有害生物，一旦傳入流行將給新疆棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，并提出了加強檢疫、加強棗園管理、增強樹勢、防蟲治病、控制菌源、手術(shù)和藥物治療的綜合防治措施。韓劍等[91]研究了南疆阿克蘇、喀什地區(qū)的棗瘋病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，分析認(rèn)為，無癥帶菌苗人為傳播是導(dǎo)致棗瘋病傳播的主要原因，并認(rèn)為改善園內(nèi)土壤理化性質(zhì)、清除雜草灌木等潛在寄主有助于棗瘋病防治。

3 棗瘋病研究存在的問題及展望

植原體是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的唯一一類能同時寄生于動物(昆蟲)和植物體內(nèi)的病原體，植原體分泌的致病因子導(dǎo)致植物產(chǎn)生叢枝、花變?nèi)~等幼化癥狀，有利于刺吸式昆蟲的取食，同時有利于植原體的傳播。植原體病害的發(fā)生牽涉寄主植物、葉蟬、植原體三者的協(xié)同進(jìn)化和平衡關(guān)系[92]。棗瘋病植原體基因組的成功測序為從分子水平上深入剖析其致病機制，進(jìn)而開展藥物開發(fā)、抗病品種培育奠定了基礎(chǔ)。目前對棗瘋病植原體致病因子功能的研究已取得初步進(jìn)展，深入對棗瘋病植原體致病因子和其他致病蛋白進(jìn)行研究，對于揭示棗瘋病發(fā)生分子機制和防治都有重要意義。

對癥施藥是病害防治的關(guān)鍵，農(nóng)藥減量化是國家的政策要求，也是生態(tài)環(huán)境保護(hù)的需要，目前對棗瘋病植原體和抗生素之間的定量關(guān)系上尚缺乏研究，利用分子定量技術(shù)，開展棗瘋病定量用藥防治研究，對于減少化學(xué)防治中的抗生素用量，實現(xiàn)精準(zhǔn)施藥有一定價值。

棗瘋病植原體沒有細(xì)胞壁，對環(huán)境變化敏感，目前已有對棗瘋病冷凍處理脫毒研究的報道，國外有報道采用高溫方式培養(yǎng)植原體脫毒苗，開發(fā)更多物理防治的技術(shù)和設(shè)備，對于棗瘋病無公害防治也有現(xiàn)實的意義。