天然免疫在非酒精性脂肪性肝病中的作用研究進(jìn)展

李威，夏豪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430060)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種在全球范圍內(nèi)高度流行的慢性肝病。據(jù)報(bào)道，全球成年人NAFLD的患病率約為25%，且多合并有肥胖癥、糖尿病、代謝綜合征等代謝紊亂疾病[1]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，有學(xué)者提出“二次打擊”假說[2]，但目前認(rèn)為NAFLD的發(fā)病及進(jìn)展是一個(gè)多因素復(fù)雜過程，肥胖癥、胰島素抵抗以及腸道微生物穩(wěn)態(tài)紊亂導(dǎo)致的炎癥激活、代謝紊亂在NAFLD的疾病進(jìn)展過程中起著關(guān)鍵作用[3]。盡管目前對(duì)NAFLD病理機(jī)制的研究取得了一定進(jìn)展，但臨床仍缺乏有效延緩和逆轉(zhuǎn)慢性炎癥導(dǎo)致肝臟實(shí)質(zhì)性損傷的藥物[4]。天然免疫為非特異性的宿主防御反應(yīng)，越來越多的證據(jù)顯示，天然免疫在代謝紊亂、炎癥以及纖維化的調(diào)控中具有重要作用，同時(shí)也是NAFLD進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)力[5-8]。隨著研究的深入，天然免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的一些重要分子靶標(biāo)可能成為NAFLD治療的新靶點(diǎn)?，F(xiàn)就天然免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在NAFLD中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 肝臟的天然免疫系統(tǒng)

肝臟是人體內(nèi)功能最復(fù)雜的器官，血液循環(huán)豐富。與其他器官的動(dòng)脈供血不同，3/4的肝臟血供來源于由胃、腸、脾、胰等臟器靜脈匯集而成的門靜脈，其中包含了大量來自腸道的微生物相關(guān)分子模式、病原相關(guān)分子模式以及各種毒素和抗原分子[9-10]。豐富的血液供應(yīng)和獨(dú)特的循環(huán)結(jié)構(gòu)使肝臟內(nèi)存在著強(qiáng)大的免疫網(wǎng)絡(luò)，大量易位病原體可通過門靜脈直接流向肝臟，但并不會(huì)引起全身感染，說明肝臟具有強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別并清除這些病原微生物[11]。在生理?xiàng)l件下，肝臟的免疫耐受能有效防止免疫系統(tǒng)的過度激活，但當(dāng)腸道微生物菌群失調(diào)、腸壁完整性受損時(shí)，大量腸道微生物及毒性產(chǎn)物移位至肝臟，根據(jù)肝臟的血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，這些腸源性微生物、毒素產(chǎn)物流經(jīng)肝血竇時(shí)破壞肝臟的天然免疫穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)過度激活，引起炎癥、纖維化以及代謝紊亂等，導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷[9-10,12]。

肝臟不僅是一個(gè)代謝器官，也是一個(gè)重要的免疫器官。一些重要的天然免疫細(xì)胞(如庫(kù)普弗細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及肥大細(xì)胞)與同樣具有免疫功能的肝細(xì)胞和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞共同組成肝臟的天然免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)[6]。生理?xiàng)l件下，天然免疫網(wǎng)絡(luò)處于協(xié)調(diào)穩(wěn)態(tài)，當(dāng)肥胖、胰島素抵抗或代謝綜合征等代謝紊亂導(dǎo)致肝臟的代謝失衡時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度堆積導(dǎo)致的脂毒性可激活肝細(xì)胞的免疫反應(yīng)及炎癥應(yīng)答。同時(shí)，腸-肝微生物軸穩(wěn)態(tài)的破壞造成腸道微生物及毒性產(chǎn)物移位，使肝內(nèi)天然免疫過度活化，進(jìn)一步促進(jìn)肝細(xì)胞啟動(dòng)炎癥、凋亡、自噬、纖維化等過程，加重非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)的進(jìn)展，最終導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌[8]。綜上，天然免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)紊亂、細(xì)胞內(nèi)天然免疫信號(hào)通路過度激活、炎癥和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)紊亂是NAFLD進(jìn)展的重要原因。因此，了解代謝應(yīng)激條件下肝臟中天然免疫信號(hào)的調(diào)控機(jī)制對(duì)于NAFLD的防治有重要意義。

2 NAFLD中的天然免疫信號(hào)通路

脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致的代謝應(yīng)激是NAFLD最直接的病因，而代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥由天然免疫系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)。駐留在肝臟的天然免疫細(xì)胞以及肝細(xì)胞和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)感知持續(xù)產(chǎn)生的損傷相關(guān)分子模式和代謝產(chǎn)物，觸發(fā)一系列天然免疫信號(hào)通路，產(chǎn)生多種加重慢性炎癥、脂質(zhì)代謝紊亂的效應(yīng)分子，從而加重NAFLD的疾病進(jìn)展[13-14]。

2.1PRR 在代謝壓力下，肝內(nèi)PRR過度激活在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。隨著營(yíng)養(yǎng)過剩導(dǎo)致的代謝壓力增大，大量脂質(zhì)分子在肝內(nèi)堆積，脂毒性導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及自噬等一系列過程，肝細(xì)胞凋亡或壞死釋放大量的損傷相關(guān)分子模式，從而導(dǎo)致肝內(nèi)PRR過度激活，天然免疫平衡遭到破壞[15]。

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是目前研究最為深入的天然免疫PRR。TLR1、2、4、5和6定位在細(xì)胞膜表面，能夠識(shí)別并結(jié)合不同病原體表面的病原相關(guān)分子模式；而TLR3、TLR7～13在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜上被發(fā)現(xiàn)[16]。TLR的結(jié)構(gòu)及定位決定了其PRR的功能，如經(jīng)典的TLR4通路可以識(shí)別革蘭陰性菌的脂多糖，并激活一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而激活炎癥、免疫應(yīng)答。TLR是一種Ⅰ型跨膜蛋白，包含定位于細(xì)胞外的富亮氨酸重復(fù)域和跨膜域以及定位于胞質(zhì)的Toll/白細(xì)胞介素-1R(Toll/interleukin-1 receptor，TIR)域，前者的主要功能是胞外信號(hào)識(shí)別和細(xì)胞膜定位，TIR域的主要作用是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]。研究表明，TLR參與正向或負(fù)向調(diào)控NASH進(jìn)展，其中TLR2、TLR4、TLR9敲除小鼠的肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥以及胰島素抵抗減輕，而TLR5敲除小鼠則表現(xiàn)出對(duì)NASH敏感性增加[18]。Mridha等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，TLR9在NASH患者和NASH小鼠中表達(dá)上調(diào)，TLR9敲除小鼠的高脂飲食導(dǎo)致的脂肪肝和代謝性炎癥明顯改善，這可能是通過抑制M1型巨噬細(xì)胞極化和中性粒細(xì)胞趨化發(fā)揮作用。綜上，靶向TLR受體以干擾相關(guān)的代謝性炎癥激活有望成為一種有效地改善NASH病理過程的治療手段。

其他家族的PRR亦有報(bào)道能調(diào)控NASH的發(fā)生發(fā)展。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體主要位于胞質(zhì)，在代謝壓力下，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域1激活可誘導(dǎo)下游促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路活化、核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)活化，同時(shí)通過增加趨化因子CC趨化因子配體5和CXC趨化因子配體1的表達(dá)促進(jìn)炎癥反應(yīng)[20]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2不能單獨(dú)激活炎癥，但可協(xié)同TLR通路共同激活炎癥[21]。Wree等[22]研究表明，敲除小鼠的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域3能改善膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的肝損傷、炎癥以及肝纖維化。PRR作為天然免疫信號(hào)激活的起始部分，感知脂質(zhì)應(yīng)激和代謝紊亂產(chǎn)生的損傷相關(guān)分子模式和代謝產(chǎn)物等的刺激后過度激活，并通過一系列細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起持續(xù)性的慢性炎癥損傷，從而導(dǎo)致NASH的發(fā)生發(fā)展以及各種肝外并發(fā)癥的產(chǎn)生。因此，干擾天然免疫信號(hào)的過度激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能對(duì)NASH和肝外并發(fā)癥的預(yù)防和治療有一定意義。

2.2銜接蛋白 當(dāng)代謝壓力導(dǎo)致PRR過度活化后，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將PRR接收到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給下游的激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而調(diào)控多種促炎因子和脂質(zhì)代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生各種調(diào)控炎癥以及脂質(zhì)代謝的效應(yīng)分子。部分銜接蛋白充當(dāng)信號(hào)傳遞伴侶蛋白的作用。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)C端的TIR域可與TLR相互作用，N端的DD域是人白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶家族識(shí)別并結(jié)合的同源域，通過蛋白相互作用將TLR接收的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游，磷酸化激活人白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶并激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]。含有TIR域的銜接子誘導(dǎo)β干擾素(TIR domain-containing adaptor inducing interferon β，TRIF)也是天然免疫中的一種重要銜接蛋白，在MyD88依賴的TLR3通路中起重要作用[24]。Yamamoto等[25]研究表明，TRIF與MyD88同時(shí)敲除小鼠受到TLR4配體相應(yīng)刺激后無法激活下游NF-κB通路。TRIF相關(guān)接頭分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)是一個(gè)包含TIR域的接頭蛋白，在天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。敲除TRAM基因能特異性阻斷TLR4介導(dǎo)的下游信號(hào)通路激活以及細(xì)胞因子的釋放[26]。

2.3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白激酶 在NAFLD代謝紊亂環(huán)境下，PRR持續(xù)激活，隨后一系列與炎癥脂質(zhì)相關(guān)的信號(hào)通路被激活。在MyD88、TRAM、TRIF等銜接蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)下，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子家族(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)作為泛素E3連接酶家族，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過泛素化修飾底物蛋白，招募并激活一些天然免疫信號(hào)通路中的重要激酶[27]。TRAF對(duì)于炎癥、代謝的調(diào)控作用依賴于其本身的E3連接酶屬性[28-30]。TRAF能接收代謝性壓力導(dǎo)致的受體激活信號(hào)，并介導(dǎo)一些關(guān)鍵蛋白激酶的磷酸化，從而啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信號(hào)級(jí)聯(lián)過程。

MAPK家族包括p38、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶及上游的MAPK激酶和MAPK激酶激酶。凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)是MAPK激酶激酶家族成員之一，該激酶在活性氧類、代謝壓力以及各種細(xì)胞因子刺激下激活并同時(shí)激活下游的MAPK。研究發(fā)現(xiàn)，NASH患者體內(nèi)ASK1過度活化，TRAF1、TRAF6等E3泛素連接酶可靶向促進(jìn)ASK1的泛素化修飾，進(jìn)而促進(jìn)ASK1活化，加重NASH疾病進(jìn)展[29-30]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β活化激酶1(transforming growth factor-β activated kinase 1，TAK1)也是MAPK激酶激酶家族成員之一。TAK1被泛素化激活后，下游的JNK/p38也相應(yīng)被激活，加重炎癥損傷和代謝紊亂過程[28,31]。通過去泛素化或去磷酸化抑制TAK1的活化可抑制NASH的進(jìn)展。據(jù)報(bào)道，泛素特異性蛋白酶18可通過去泛素化修飾TAK1抑制TAK1的活化，下調(diào)JNK/p38通路可顯著改善NASH小鼠肝細(xì)胞炎癥和胰島素抵抗[32]。由此可見，在代謝性應(yīng)激誘導(dǎo)的MAPK通路活化過程中，蛋白翻譯后泛素化和去泛素化修飾共同調(diào)控蛋白激酶的磷酸化，調(diào)控這些蛋白翻譯后修飾的關(guān)鍵酶可能是NASH炎癥進(jìn)展過程的重要分子開關(guān)。

NF-κB通路在動(dòng)物或細(xì)胞NASH模型中均處于過度激活狀態(tài)，與代謝紊亂導(dǎo)致的慢性炎癥密切相關(guān)[33]。Dong等[34]用棕櫚酸體外刺激原代肝星狀細(xì)胞模擬脂肪酸代謝紊亂發(fā)現(xiàn)，TLR4-NF-κB信號(hào)通路被激活，且肝星狀細(xì)胞中的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎癥小體活化。在高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的NASH小鼠模型中，抑制TAK1-NF-κB激酶抑制劑/NF-κB信號(hào)通路可明顯改善小鼠的肝脂肪變性、炎癥和氧化應(yīng)激[35]。

在脂質(zhì)代謝紊亂、慢性炎癥過度激活PRR、調(diào)控炎癥脂質(zhì)的效應(yīng)分子產(chǎn)生的過程中，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信號(hào)級(jí)聯(lián)起到至關(guān)重要的作用，一些關(guān)鍵性的銜接蛋白和激酶有望成為新興的治療靶點(diǎn)。

2.4轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子位于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的最下游，可以調(diào)控多種脂質(zhì)代謝和炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)以及釋放。干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor，IRF)主要參與Ⅰ型干擾素和干擾素誘導(dǎo)型基因的表達(dá)調(diào)控，是宿主防御機(jī)制的重要組成部分[36]。IRF在代謝性疾病中也發(fā)揮著重要作用。研究顯示，在高脂飲食喂養(yǎng)的NASH小鼠模型中，IRF3通過抑制NF-κB激酶抑制劑/NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)減輕肝臟炎癥、脂肪變性和胰島素抵抗[37]。Wang等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，IRF3的同家族成員IRF7在高脂喂養(yǎng)模型中能促進(jìn)NASH的炎癥激活及脂質(zhì)代謝紊亂，而IRF敲除小鼠用高脂飲食喂養(yǎng)后，肥胖相關(guān)的代謝紊亂和胰島素抵抗明顯減輕，提示IRF同家族成員在調(diào)控NASH疾病進(jìn)展過程中可能發(fā)揮不同的作用。深入研究并明確IRF家族不同分子在NASH調(diào)控中的作用，對(duì)后期臨床靶向藥物的研發(fā)至關(guān)重要。

NF-κB轉(zhuǎn)錄因子與炎癥和代謝調(diào)控密切相關(guān)，TLR激活后通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF-κB激酶抑制劑/NF-κB通路，導(dǎo)致多種脂質(zhì)和炎癥基因上調(diào)，促進(jìn)飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗，同時(shí)加重肥胖和胰島素抵抗導(dǎo)致的慢性炎癥，更進(jìn)一步促進(jìn)NAFLD以及各種代謝性疾病的進(jìn)展[39]。NF-κB通路與炎癥反應(yīng)激活密切相關(guān)，在NAFLD中，過度炎癥激活導(dǎo)致的肝細(xì)胞不可逆性損傷是單純性脂肪肝進(jìn)展為NASH的重要條件。因此，靶向抑制NF-κB通路，減少相關(guān)促炎因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，有可能延緩單純性脂肪肝向NASH的疾病進(jìn)程。

3 天然免疫與NAFLD治療

調(diào)整飲食和運(yùn)動(dòng)仍是NAFLD的主要治療方式。低熱量飲食結(jié)合中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)是減輕體重和控制肝脂肪變性的最佳策略，但能否改善肝臟的炎癥和纖維化仍不確定[40]。天然免疫中的一些關(guān)鍵信號(hào)分子有望成為治療NAFLD的有效靶點(diǎn)。

ASK1是MAPK激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)中的一個(gè)重要激酶，同時(shí)也是天然免疫調(diào)控代謝性炎癥的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分子。在脂質(zhì)代謝紊亂的環(huán)境下，ASK1激活并驅(qū)動(dòng)下游的JNK/p38通路激活，進(jìn)一步加重代謝性炎癥、細(xì)胞凋亡和纖維化，促進(jìn)NASH甚至肝纖維化進(jìn)展。ASK1成為NASH藥物研發(fā)的主要靶點(diǎn)之一，Selonsertib(GS-4997)是一種小分子ASK1選擇性抑制劑，能夠改善NAFLDⅡ期患者的肝炎和肝硬化[41]，但Selonsertib的Ⅲ期臨床試驗(yàn)未成功。MAPK激酶激酶家族成員TAK1亦在代謝應(yīng)激條件下被激活，代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的泛素化蛋白修飾和自磷酸化激活是TAK1激活的必要條件，通過去泛素化或去磷酸化抑制TAK1的過度活化可能是治療NASH的可行策略之一。去泛素化酶圓柱瘤蛋白可通過與TAK1直接作用并移除TAK1的K63連接的多聚泛素化鏈，有效阻止下游JNK/p38通路的激活，從而改善高脂喂養(yǎng)NASH小鼠和猴體內(nèi)的脂質(zhì)蓄積、胰島素抵抗、炎癥和纖維化[42]。臨床前研究已證實(shí)，抑制ASK1和TAK1的過度激活可有效抑制NASH的進(jìn)展[30-31]，但關(guān)于ASK1和TAK1抑制劑的臨床轉(zhuǎn)化仍需要更多有效臨床研究的證實(shí)。

4 小 結(jié)

天然免疫與NAFLD密切相關(guān)。了解天然免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的性質(zhì)和復(fù)雜性，可為NASH新療法的合理設(shè)計(jì)開辟新的途徑。NAFLD作為一種復(fù)雜的代謝性疾病，肝臟疾病不同進(jìn)展階段(單純脂肪變性、NASH、肝硬化、肝癌)的組織學(xué)表現(xiàn)和分子機(jī)制不同，目前導(dǎo)致疾病進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)機(jī)制尚未完全闡明。天然免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在NAFLD各個(gè)病理階段均發(fā)揮關(guān)鍵作用，靶向天然免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的一些關(guān)鍵分子在臨床前研究中取得了一定成效。因此，需要深入探索NAFLD的潛在病理機(jī)制以及天然免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在NAFLD各個(gè)階段中的作用，以為NAFLD的預(yù)防和治療提供新策略。