濃縮生長因子的作用及其在組織修復(fù)領(lǐng)域應(yīng)用的研究進展

王耀金 李永林

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453100；2.鄭州市第一人民醫(yī)院整形外科，河南 鄭州 450000）

組織修復(fù)與創(chuàng)面愈合的過程復(fù)雜而有序，在修復(fù)的過程中有多種細胞生長因子的參與。生長因子是一類由細胞所分泌的、類似于激素的信號分子，在組織修復(fù)過程中，各種修復(fù)細胞所產(chǎn)生的生長因子能夠調(diào)節(jié)機體的生長發(fā)育，也能調(diào)控淋巴細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞等修復(fù)細胞的表達、增殖分化和遷移。目前已發(fā)現(xiàn)生長因子可來源于多種不同組織，其靶細胞也各不相同。臨床研究證實，單一的生長因子很難充分發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，濃縮生長因子（CGF）作為新一代血小板衍生物，無論在難愈性創(chuàng)面修復(fù)還是醫(yī)學(xué)整形美容領(lǐng)域都能發(fā)揮重要作用，成為近年來研究的熱點?，F(xiàn)對CGF的作用及其在組織修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用進展綜述如下。

1 CGF的來源

1.1 CGF的生理學(xué)背景 人體血液成分包括紅細胞、血小板、白細胞以及其他有機成分。在血小板眾多的活性物質(zhì)和活性因子的研究中，細胞生長因子越來越成為研究的熱點。生長因子及纖維蛋白原從活化血小板的α顆粒中釋放出來，在止血、炎癥反應(yīng)以及組織再生重建方面發(fā)揮重要作用，其中生長因子參與細胞的增殖分化并促進細胞外基質(zhì)的生物合成。人們對血小板的研究最初只是發(fā)現(xiàn)其具有凝血功能，之后經(jīng)歷了很長的時間才發(fā)現(xiàn)其分泌生長因子的功能。自體血小板濃縮物中富含內(nèi)源性生長因子和纖維蛋白。纖維連接蛋白促進細胞與基質(zhì)的連接，交聯(lián)成網(wǎng)狀支架后可形成纖維蛋白支架，這種支架結(jié)構(gòu)中可儲存機體組織修復(fù)過程中所需要的紅細胞、炎性細胞及干細胞等，可作為臨時基質(zhì)保留和緩慢釋放生長因子，避免“瀑布”效應(yīng)，從而充分發(fā)揮這些成分的生物學(xué)效應(yīng)[1]，降低由高濃度生長因子引起的組織水腫和炎癥反應(yīng)風(fēng)險，促進組織修復(fù)與再生。

1.2 CGF的發(fā)展歷程 根據(jù)不同的離心參數(shù)，迄今為止血小板濃縮物經(jīng)歷了3代，第1代是富血小板血漿（PRP），第2代是富血小板纖維蛋白（PRF），第3代是CGF。30年前第一代血小板濃縮物PRP開始應(yīng)用于臨床，其富含的血小板濃度是自體血液的4～7倍[2]，已在組織修復(fù)、創(chuàng)面愈合、骨科及醫(yī)學(xué)美容等多個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，其安全性和臨床效果得到證實。然而在PRP的制備離心過程中需要添加外源性激活劑（通常是氯化鈣和凝血酶）激活，經(jīng)過3次左右的梯度離心才制得，在一定程度上存在提取率低的問題；由于添加了外源性激活劑，還存在著機體過敏反應(yīng)和感染的風(fēng)險；在應(yīng)用于機體的早期（24 h），高濃度的生長因子在濃度差的作用下釋放明顯，后期生長因子的釋放速度較慢。組織修復(fù)是一個長期的過程，然而PRP無法在組織修復(fù)的整個過程持續(xù)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，甚至有一些負向治療效果的報道[3]。為了保證治療效果，以血小板為基礎(chǔ)的治療方法應(yīng)該有一個定義明確和標(biāo)準(zhǔn)化的方案。1999年Anitua[4]對這一方案進行了標(biāo)準(zhǔn)化：用鈣或自體凝血酶代替牛凝血酶制備出了富含細胞生長因子血漿（PRGF）。然而有報道PRGF中所含白細胞比貧血小板血漿（PPP）少[5]。

PRF是第二代血小板濃縮制品，相比于PRP，其制備不需要添加使用外源性激活劑，使整個離心過程更加簡化。PRF的纖維蛋白支架可以保護生長因子免受蛋白酶水解[6]，為細胞的黏附、遷移和增殖分化提供三維空間結(jié)構(gòu)，一些聚集在纖維蛋白支架中的干細胞也可激發(fā)再生潛能，可維持生長因子的緩慢釋放并在修復(fù)的過程中有效發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。由于制備PRF時不一致的離心力可能會導(dǎo)致血液濃縮物成分和效能的改變，且最初開發(fā)出來PRF無法在臨床工作中進行注射操作，應(yīng)用范圍較窄。a-PRF是在低離心速度概念下發(fā)展而來[7]，具有松散的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，可刺激生長因子在10 d內(nèi)持續(xù)釋放。后期又研究出注射型PRF，并將其應(yīng)用于牙槽骨種植及慢性難愈性創(chuàng)面愈合領(lǐng)域，進一步拓寬了PRF的臨床應(yīng)用范圍，治療效果良好。

1.3 CGF的制備 為了提高治療效果，人們在PRP、PRF的基礎(chǔ)上制備出第3代血液濃縮物，即CGF。其獲取方法一般包括冷沉淀、過濾及離心，其中離心是一種簡便、經(jīng)濟和重復(fù)性強的技術(shù)。2006年學(xué)者Sacco 開發(fā)出CGF，CGF最初被命名為PRF衍生物，其制備需要利用特制的變速離心機(Silfradent意大利），由于變速離心機本身的特點，交替改變離心速度與時間是離心機自動按照既定程序調(diào)節(jié)的[8]，一般來說，歷時大約14 min的離心后，會建立3層血液成分：上層為貧血小板血漿，又稱PPP；中間層含豐富的生長因子和纖維蛋白凝膠；下層為紅細胞層。這種依靠物理性加速和減速切換的制備方式優(yōu)于固定離心力的方式，交替的離心力使血小板與離心管發(fā)生碰撞的機會增加，進一步促進血小板裂解和生物活性分子發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。較前兩代相比，CGF中含有更高濃度的CD34+，CD34+分子在造血干細胞移植過程中發(fā)揮運輸作用，它能夠參與炎癥反應(yīng)以及促進微循環(huán)系統(tǒng)的重建。由于CGF可在局部逐漸降解，臨床一般采用冰融和凍干方法來減少其降解。CGF有著良好的促進組織修復(fù)與再生功能,已在骨科、牙槽骨種植、燒傷后瘢痕修復(fù)等領(lǐng)域得到應(yīng)用。

2 CGF的生物學(xué)特性及功能

2.1 CGF的生物學(xué)特性 組織修復(fù)與再生的關(guān)鍵是干細胞、生物活性分子和支架結(jié)構(gòu)，第1代血小板濃縮物PRP需要外源性激活劑（氯化鈣及牛凝血酶混合）才能激活α顆粒釋放生長因子，但使用外源性凝血酶可能會導(dǎo)致凝血因子Ⅴ和（或)Ⅵ抗體形成，進而影響機體正常凝血功能，甚至威脅生命。第2代血小板濃縮物PRF在制備時不一致的離心力可能會導(dǎo)致濃縮物成分和效能的改變。CGF作為第3代血小板濃縮制品，富含多種生物活性分子、抗炎介質(zhì)和干細胞。其優(yōu)點是：①CGF是自身來源的血液濃縮制品，不添加任何生物化學(xué)制劑，能有效避免外源性生長因子進入機體引起的免疫排斥反應(yīng)及傳播疾病風(fēng)險；②CGF的制作流程更加簡單，通過反復(fù)切換離心速度可釋放更多的生長因子，CGF的結(jié)構(gòu)類似于天然纖維蛋白，成為修復(fù)細胞的良好支架；③CGF含有較高濃度的白細胞，在抗感染、抑制細菌生長繁殖方面更具有優(yōu)勢；④CGF可制備成凝膠狀態(tài)，為創(chuàng)面組織提供濕潤環(huán)境，阻止細菌入侵，還能增加作用時間，促進創(chuàng)面愈合，CGF中還富含高濃度的CD34+細胞，在創(chuàng)面修復(fù)的過程中與炎性細胞協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。

2.2 CGF的功能 CGF的功能主要體現(xiàn)在以下方面：①止血。 作為新一代血小板濃縮物，CGF在機體發(fā)揮著參與生理性止血和促進凝血的功能。②炎癥的調(diào)節(jié)。纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中除了有豐富的免疫細胞，還有如集落刺激因子、干擾素等免疫調(diào)節(jié)因子，這些細胞因子的存在使CGF能夠發(fā)揮抗炎抑菌和免疫防御功能，能夠促進創(chuàng)面修復(fù)和減輕創(chuàng)周炎癥反應(yīng)。③作為纖維蛋白支架。纖維蛋白作為一種基質(zhì)，促進血液中血小板、白細胞以及小分子生物活性物質(zhì)附著、增殖及分化，從而發(fā)揮生物學(xué)作用。CGF中含有纖維結(jié)合蛋白（fibronectin, FN)，F(xiàn)N分為細胞型和血漿型。FN影響細胞的黏附、遷移。CGF可作為一種支架結(jié)構(gòu)維持生長因子的緩慢、持久釋放，對人體創(chuàng)面修復(fù)過程有重要意義。④促進干細胞的遷移和增殖分化。CGF內(nèi)有大量CD34+分子,這也是CGF和PRP的重要區(qū)別，CD34+分子的存在表明CGF中含有造血干細胞，能夠促進組織修復(fù)與再生[9]。⑤調(diào)節(jié)細胞生長因子。在變速離心制備CGF的過程中血液與離心管壁的不斷碰撞會充分激活血小板，并促進生長因子的釋放，生長因子通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)作用。

3 CGF的釋放動力學(xué)

3.1 生長因子的作用 CGF作為第3代血小板濃縮物，含有眾多生長因子。其中胰島素樣生長因子（IGF）被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育時期重要的自分泌和旁分泌信號分子，能夠介導(dǎo)生長激素，調(diào)節(jié)組織生長發(fā)育，加速周圍神經(jīng)再生；轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）能夠雙向調(diào)節(jié)細胞的生長，對平滑肌細胞的促分裂作用較弱,但可增強成纖維細胞生長因子和表皮生長因子的促分裂能力，表明不同生長因子之間存在一定的協(xié)同作用，臨床中多采用聯(lián)合應(yīng)用多種生長因子的方式輔助修復(fù)創(chuàng)面。CGF作為生長因子的集合體，在促進血管增殖、改善局部微循環(huán)及創(chuàng)面愈合方面發(fā)揮著重要作用。

3.2 血小板濃縮物中生長因子的釋放動力學(xué)對其生物活性模式的影響 有文獻報道，PRP在應(yīng)用1 h內(nèi)完全釋放生長因子，在組織再生和重建的早期階段發(fā)揮作用，但這種釋放動力學(xué)決定了其不能與長期復(fù)雜的再生過程相匹配[10]。有研究表明，PRF可持續(xù)釋放生長因子7~10 d，而a-PRF可穩(wěn)定釋放14 d，隨著纖維蛋白支架的降解，血小板團塊逐漸降解，生長因子緩慢釋放到局部微環(huán)境中[11]。CGF的釋放動力學(xué)包括兩個階段[12]：第一階段是大量活化的血小板和生長因子的單純擴散；第二階段由纖維蛋白支架的緩慢降解決定。CGF中每種類型的生長因子在應(yīng)用早期都有其特定的釋放動力學(xué)。研究發(fā)現(xiàn)CGF緩慢釋放TGF-β超過13 d，并在第7天達到高峰。還有報道CGF可累計釋放生長因子14 d后急劇下降。文獻中釋放動力學(xué)的差異可能是由于樣本量和觀察時間的不同而引起，但生長因子的持續(xù)釋放可在再生重建的長期過程中發(fā)揮重要作用。Yu等[13]報道，CGF與纖維內(nèi)礦化膠原結(jié)合可持續(xù)釋放生長因子28 d，并出現(xiàn)兩個濃度峰值日,將CGF與磷酸三鈣結(jié)合也能得到相似的結(jié)果，這些組合構(gòu)成了一個連續(xù)的給藥系統(tǒng)，可適應(yīng)長期的組織修復(fù)與再生過程。

4 CGF的臨床應(yīng)用

4.1 CGF在急慢性創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用 創(chuàng)面修復(fù)的過程分為炎癥反應(yīng)（早期）、細胞增殖和（或）纖維結(jié)締組織形成（中期）、創(chuàng)面重塑和收縮3個階段（晚期）。在機體的調(diào)控下，不同的愈合階段又相互聯(lián)系、相互交叉。整個修復(fù)過程還包括各種炎癥細胞、炎性介質(zhì)、干細胞、生長因子及細胞因子成分。劉磊[14]認為在慢性難愈性創(chuàng)面愈合的過程中需要應(yīng)用適宜濃度的生長因子，如果生長因子濃縮異常也會影響創(chuàng)面的修復(fù)時間和質(zhì)量。王瑩等[15]在創(chuàng)面修復(fù)的研究過程中發(fā)現(xiàn)，慢性創(chuàng)面（尤其是合并基礎(chǔ)疾病的慢性難愈性創(chuàng)面，如糖尿病足）所分泌的生長因子無法滿足正常創(chuàng)面修復(fù)的需求，針對原因，他們分析可能是成纖維細胞、巨噬細胞等修復(fù)細胞表達生長因子減少從而影響創(chuàng)面修復(fù)。付小兵等[16]在慢性難愈合創(chuàng)面的相關(guān)研究中顯示出生長因子濃度比正常時升高的情況，高濃度的生長因子活性下降導(dǎo)致與靶細胞受體無法正常結(jié)合進而影響慢性創(chuàng)面的修復(fù)。CGF在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮著重要作用，血小板被激活后可釋放生長因子和細胞因子。在急、慢性損傷創(chuàng)面中，早期應(yīng)用生長因子對于創(chuàng)面愈合具有很好的臨床效果，不過在應(yīng)用生長因子之前應(yīng)采取必要的抗感染措施如去除創(chuàng)周壞死組織和徹底清創(chuàng)等[17]。處理慢性創(chuàng)面時也應(yīng)注意病因治療，如對于糖尿病慢性潰瘍患者注意控制血糖和改善微循環(huán)[18]。有學(xué)者將CGF制備成凝膠狀態(tài)，并應(yīng)用于糖尿病足創(chuàng)面的治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與常規(guī)換藥治療組相比，CGF組能夠縮短創(chuàng)面愈合時間。由于CGF中含有炎性細胞和修復(fù)細胞，在一定程度上能夠減少瘢痕增生。劉坡等[19]探討自體CGF治療小腿部慢性難愈合創(chuàng)面的可行性和療效，通過對研究中的56例患者行自體CGF纖維蛋白膜移植治療，1~8周后創(chuàng)面完全愈合，研究證實應(yīng)用CGF能夠促進小腿慢性難愈合創(chuàng)面的愈合。有學(xué)者將CGF應(yīng)用于開胸術(shù)后切口愈合不良伴局部骨髓炎患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用CGF治療有助于促進骨和軟組織再生，縮短愈合時間，并有助于減少止痛藥物使用次數(shù)及感染發(fā)作次數(shù)[20]。郭蔚瑩等[21]將CGF應(yīng)用于糖尿病大鼠創(chuàng)面，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGF中的堿性成纖維細胞生長因子成分在糖尿病創(chuàng)面修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。另有研究證實CGF膜可促進創(chuàng)面上皮再生，并提出CGF膜治療慢性創(chuàng)面的可能機制[22]：①在制作CGF凝膠過程中，分離離心可使血小板釋放生長因子和細胞因子，促進創(chuàng)面愈合；②CGF凝膠中的干細胞和單核細胞可移動到創(chuàng)面底部增殖分化為巨噬細胞，進一步促進創(chuàng)面愈合。CGF膜的三維纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及其所含生長因子可促進再上皮化和創(chuàng)面愈合。有學(xué)者提出CGF膜不僅是一層屏障，也是生長因子的來源及上皮細胞附著、遷移、增殖的基礎(chǔ)[23]。

4.2 CGF在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用 基于不同類型生長因子的生物學(xué)特性，有學(xué)者利用骨髓基質(zhì)細胞提供關(guān)鍵的種子細胞，將骨髓基質(zhì)細胞與CGF結(jié)合形成纖維蛋白生物支架[24]，結(jié)果表明，CGF能夠促進骨髓基質(zhì)細胞增殖分化，對骨形成具有強大的促進作用，并具有輔助血管生成作用。羅婷苑等[25]選擇24只新西蘭兔，觀察CGF聯(lián)合珊瑚羥基磷灰石（CHA）在骨缺損組織修復(fù)方面的治療效果，結(jié)果表明，CGF聯(lián)合CHA能顯著促進骨缺損創(chuàng)面的愈合。吳訓(xùn)等[26]在研究中建立了兔髁突全層軟骨損傷模型，實驗組通過用CGF填塞軟骨缺損，而對照組僅用生理鹽水沖洗，通過測定修復(fù)組織中軟骨成分判定CGF應(yīng)用于骨組織的修復(fù)效果，結(jié)果表明，CGF能夠促進軟骨組織修復(fù)。在一項對12例上頜前牙無牙患者的回顧性分析研究中，實驗組種植體在種植前采用CGF膜覆蓋種植腔，對照組常規(guī)種植，最終顯示，CGF可促進種植體的穩(wěn)定性[27]。有文獻報道CGF能夠促進齒源性間充質(zhì)干細胞的增殖和成骨分化[28]，表明在牙髓再生治療中，CGF是一種很有前途的生物材料。

4.3 CGF在抗衰老中的應(yīng)用 面部衰老是由成纖維細胞增生不良和細胞外基質(zhì)排列改變所致[29]。真皮層中I型膠原占80%。I型膠原在真皮層中交織成網(wǎng)，構(gòu)成皮膚充盈飽滿的基礎(chǔ)。生長因子能有效促進I型膠原的產(chǎn)生，在面部年輕化方面具有良好的作用[30]。常見面部年輕化的治療方法包括注射透明質(zhì)酸和脂肪移植。透明質(zhì)酸費用較高，且只在6~12個月內(nèi)有效。單純性脂肪移植可能引起局部腫脹。應(yīng)用生長因子可能是一種新的有效治療方法。CGF促進內(nèi)皮細胞和成纖維細胞增殖并提高代謝活性，增加成纖維細胞的抗衰老活性，注射CGF能改善眶周皺紋，增加真皮-表皮交界處的厚度[31]。在自體脂肪填充方面，聯(lián)合應(yīng)用CGF可增加移植脂肪細胞存活率，減少細胞液化壞死。CGF作為組織修復(fù)與再生的重要介質(zhì)，在治療雄激素源性脫發(fā)（AGA）領(lǐng)域也有良好的應(yīng)用前景[32]，可增加頭發(fā)密度，優(yōu)化AGA患者的無毛發(fā)外觀。有學(xué)者觀察了CGF聯(lián)合肉毒毒素治療AGA的臨床效果，CGF能夠促進AGA患者毛發(fā)再生。

5 總結(jié)與展望

綜上，自體血小板濃縮制品經(jīng)歷了PRP、PRF和CGF 3個階段。在血小板濃縮制品的提取、制備和臨床應(yīng)用效果方面，CGF有著穩(wěn)定的生物學(xué)性能。在口腔科領(lǐng)域，CGF可輔助修復(fù)牙槽骨種植后的骨缺損及促進牙周組織再生；在醫(yī)療美容領(lǐng)域，CGF可聯(lián)合脂肪顆粒輔助修復(fù)凹陷性瘢痕并減少脂肪液化壞死；以血小板為基礎(chǔ)的自體治療開拓了再生醫(yī)學(xué)新領(lǐng)域。應(yīng)用生長因子促進創(chuàng)面愈合的原理相對清楚,生長因子作用于不同類型創(chuàng)面的效果以及在創(chuàng)面修復(fù)不同階段的特點尚不明確，不同濃度的CGF與創(chuàng)面修復(fù)之間是否存在量效關(guān)系、不同類型的生長因子在不同創(chuàng)面中的療效也缺乏較為全面的比較，不同類型的生長因子協(xié)同發(fā)揮作用的方式尚不明確。CGF被證實含有高濃度的生長因子，由于活化血小板α顆粒和mRNA水平不同，每種生長因子都有其獨特的釋放動力學(xué)，對于不同生長因子的釋放動力學(xué)尚需進一步研究。使用比正常血液中濃度高的生長因子是否能夠引起細胞癌變值得高度重視,有待進一步的研究。