耳聾基因遺傳學(xué)診斷技術(shù)研究進(jìn)展

李惠勤，龍 駒

（欽州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科，廣西 欽州 535099）

耳聾是一種可導(dǎo)致語(yǔ)言交流障礙的遺傳性疾病。研究顯示，我國(guó)殘疾人約占全國(guó)總?cè)丝诘?.34%，其中聽力殘疾個(gè)體2 004萬，占24.16%[1]。聽力殘疾的患者中，由遺傳原因?qū)е碌亩@占比較高，每1 000名新生兒中至少有1名為聽力障礙患兒，其中半數(shù)為遺傳因素所致[2]。新生兒聽力篩查是發(fā)現(xiàn)散發(fā)型聽障兒童的重要方法，耳聾基因檢測(cè)則是遺傳性耳聾防控的有效措施。遺傳性耳聾是一種分子機(jī)制相對(duì)明確的遺傳病，對(duì)遺傳性耳聾基因攜帶者及其家屬成員進(jìn)行準(zhǔn)確的耳聾基因分析，是診斷遺傳性耳聾的重要途徑[3]。隨著遺傳學(xué)診斷技術(shù)的進(jìn)步，遺傳性耳聾的基因診斷技術(shù)也在不斷的提高，本文對(duì)耳聾基因的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)行綜述，旨在為減少遺傳性耳聾的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 耳聾的遺傳學(xué)機(jī)制

遺傳性耳聾分為非綜合征性耳聾（non-syndromic hearing impairment，NSHI）和綜合征性耳聾（syndromic hearing impairment，SHI），大部分NSHI由單純的耳聾相關(guān)基因突變所引起，約占耳聾患者的70%，而SHI則是由各類遺傳綜合征所并發(fā)的聽力障礙，約占耳聾患者的30%[4]。其中大多數(shù)SHI患者發(fā)病率較低，除聽力障礙外，可伴有神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚等其他器官的異常，種類繁多且較為復(fù)雜；NSHI相關(guān)基因的變異是遺傳性耳聾的主要檢測(cè)目標(biāo)，根據(jù)其發(fā)生變異的遺傳物質(zhì)構(gòu)成，主要分為由線粒體DNA變異機(jī)制和由染色體組變異機(jī)制引起的耳聾[5]。

1.1 線粒體DNA變異所致的NSHI 藥物性耳聾是指患者通過口服或者注射特定藥物引起神經(jīng)損害，造成聽力障礙，在藥物性耳聾中，由氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致的藥物性耳聾占比較高，遺傳學(xué)機(jī)制是線粒體DNA變異，其中主要由線粒體12 srRNA基因變異引發(fā)，主要為1 494或1 555堿基變異[6]。此外，線粒體遺傳遵循母系遺傳規(guī)律，可由母系遺傳給下一代[7]。

1.2 染色體組基因變異所致的NSHI 染色體組中存在大量與耳聾相關(guān)的基因，這些基因的突變會(huì)導(dǎo)致耳聾的發(fā)生。至2020年12月，共有122個(gè)NSHI相關(guān)基因被檢出，其中常染色體顯性基因50個(gè)、常染色體隱性基因76個(gè)、X染色體相關(guān)基因5個(gè)[8]。國(guó)內(nèi)的商品化檢測(cè)試劑盒主要針對(duì)GJB2基因、GJB3基因及SLC26 A4基因（與大前庭水管綜合征相關(guān)）的熱點(diǎn)突變?yōu)橹鳌?/p>

2 耳聾的遺傳學(xué)檢測(cè)方法

部分SHI由染色體基因組的大片段堿基缺失或重復(fù)、多基因的聯(lián)合作用引起，因此需借助高通量的DNA分析技術(shù)；而大部分NSHI由堿基突變引起，因此以檢測(cè)基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）的變異為主[9]。由于遺傳性耳聾涉及的SNP變異較多，一般采用能夠批量分析SNP的檢測(cè)方式完成，包括染色體拷貝數(shù)變異測(cè)序（CNV-seq）和高密度SNP基因芯片技術(shù)、全外顯子組檢測(cè)（WES）和二代測(cè)序技術(shù)（NGS）、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）、反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（RDB）、變性高效液相色譜分析法（DHPLC）、微陣列基因芯片檢測(cè)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)、片段分析技術(shù)、飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)、Sanger測(cè)序等。

2.1 CNV-seq和高密度SNP基因芯片技術(shù) CNV-seq和SNP基因芯片檢測(cè)技術(shù)是兩種較為成熟的檢測(cè)拷貝數(shù)變異（CNV）的技術(shù)，其中CNV-seq是一種采用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合低深度全基因組測(cè)序?qū)截悢?shù)變異（CNV）進(jìn)行檢測(cè)的方法，SNP基因芯片技術(shù)則是使用高密度芯片對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行分型，進(jìn)而判斷CNV的技術(shù)。CNV-seq可以檢出大于100 kb的染色體片段的缺失或者重復(fù)變異[10]。MORGAN等[11]采用CNV-seq技術(shù)研究了686名耳聾患者，其中15.2%的患者至少攜帶1個(gè)CNV，而在已經(jīng)明確由遺傳因素導(dǎo)致的耳聾患者個(gè)體中，所涉及的STRC和OTOA基因中CNV最為常見。有相關(guān)研究顯示，對(duì)225例NSHI患者進(jìn)行SNP基因芯片技術(shù)檢測(cè)，初篩中找到有明確致聾基因患者111例，占比49.3%，接近理想目標(biāo)（60.0%），耳聾基因攜帶者30例；篩查結(jié)果均為陰性者84例，SNP基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，符合率高達(dá)100.0%，故SNP基因芯片檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確度較高[12]。但SNP基因芯片技術(shù)操作相對(duì)復(fù)雜，且CNV-seq的檢測(cè)平臺(tái)（如illumina測(cè)序儀）也已經(jīng)被廣泛部署于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實(shí)驗(yàn)室，因此新檢測(cè)方案的研發(fā)多以CNV-seq平臺(tái)為主。

2.2 WES和NGS WES和NGS的分析均是基于二代測(cè)序平臺(tái)完成的檢測(cè)。WES是一種只針對(duì)外顯子區(qū)域DNA的新型基因組分析技術(shù)，首先將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并收集，再進(jìn)行高通量測(cè)序，然后結(jié)合生物信息學(xué)分析鑒定罕見和常見的與疾病相關(guān)的致病基因。NGS能一次對(duì)幾十萬甚至幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，就耳聾基因研究和基因診斷而言，基于靶向捕獲和高通量測(cè)序，可針對(duì)絕大多數(shù)已知耳聾基因進(jìn)行一次性全序列突變檢測(cè)[13]。所不同的是，WES是對(duì)人類所有已知基因的外顯子進(jìn)行檢測(cè)，而NGS則是針對(duì)特定的基因進(jìn)行檢測(cè)。兩種檢測(cè)技術(shù)類似，但WES主要是針對(duì)未知致病原因的篩查，而NGS則更具有針對(duì)性。 DANA等[14]采用NGS和WES對(duì)有耳聾癥狀的個(gè)體進(jìn)行了篩查，其中發(fā)現(xiàn)STRC的變異最為常見，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)MYO15 A、LOXHD1、TMPRSS3、OTOG及OTOF基因突變。此外，也在部分患者中發(fā)現(xiàn) AIFM1、CABP2、DIAPH1、PTPRQ、RDX、SLC26 A4、TBC1D24、TECTA 及 TMC1 突變導(dǎo)致個(gè)體耳聾的證據(jù)。但由于WES檢測(cè)費(fèi)用的逐年降低，且WES的檢測(cè)范圍較大，可有效提示基因組中未知的SNP基因變異，因此基于高通量測(cè)序的WES技術(shù)逐步被使用于排查未知基因變異的原因所導(dǎo)致的遺傳性耳聾。

2.3 MLPA MLPA是一種使用特定的探針和引物進(jìn)行雜交，對(duì)待測(cè)的DNA片段進(jìn)行定量或定性的檢測(cè)技術(shù)。部分遺傳性耳聾患者是由于染色體的微缺失變異而引起，而這類變異用常規(guī)測(cè)序手段檢測(cè)較為困難。 MARKOVA等[15]使用MLPA結(jié)合SNP芯片技術(shù)，對(duì)患者中STRC基因突變進(jìn)行了研究，結(jié)果表明， STRC基因突變是聽障患者隱性遺傳性耳聾的重要致病原因。 KURTULGAN等[16]使用MLPA的方法，篩查了土耳其錫瓦斯人群中涉及的GJB2、GJB3、 GJB6基因變異，對(duì)錫瓦斯聽障患者在這幾個(gè)基因變異的致病性進(jìn)行了評(píng)估。 MLPA在檢測(cè)特定位置的CNV的使用中較為有效，但由于特定位置的變異在人群中檢出不高，因此多使用該技術(shù)作為驗(yàn)證或者備用檢測(cè)方案。

2.4 RDB RDB是一種采用特定的生物素結(jié)合探針于生物膜上，經(jīng)過擴(kuò)增、雜交等一系列方法檢測(cè)目標(biāo)片段的技術(shù)。結(jié)合PCR-RDB是檢測(cè)已知單核苷酸變異的有效手段，在以單核苷酸變異為主的NSHI基因檢測(cè)中較為有效。采用RDB技術(shù)開發(fā)的檢測(cè)試劑盒比較多，但操作相對(duì)繁瑣，若操作人員失誤就可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)物產(chǎn)生污染。但RDB法判讀基因型相對(duì)簡(jiǎn)單，在基層實(shí)驗(yàn)室的部署相對(duì)容易，因此比較適合小規(guī)模的患者檢測(cè)使用；但目前二級(jí)防控實(shí)驗(yàn)室在前期開展遺傳性耳聾基因檢測(cè)時(shí)，大部分選擇PCR-RDB檢測(cè)技術(shù)用于前期探索[17]。相關(guān)研究顯示，從本質(zhì)上，PCR-RDB和PCR- 導(dǎo)流雜交法的原理類似，判讀方法和適用范圍也類似[18]。

2.5 微陣列基因芯片檢測(cè)技術(shù) 微陣列基因芯片檢測(cè)技術(shù)是較早被用于檢測(cè)遺傳性耳聾的技術(shù)，主要被用于單堿基變異的檢測(cè)。其技術(shù)特點(diǎn)為檢測(cè)流程、判讀方法均較為簡(jiǎn)單，并且能實(shí)現(xiàn)單次檢測(cè)10～20個(gè)熱點(diǎn)突變。目前已經(jīng)有較成熟的商品化基因芯片檢測(cè)試劑盒，單次可完成GJB2、GJB3、12 srRNA、SLC26 A4基因中 15個(gè)熱點(diǎn)突變的篩查，在實(shí)際應(yīng)用中效果顯著[19-20]。巫靜帆等[21]應(yīng)用可檢測(cè)GJB2、SLC26A4、12 srRNA及GJB3基因中9個(gè)熱點(diǎn)突變的微陣列基因芯片檢測(cè)技術(shù)，完成了33 810例新生兒足跟血的檢測(cè)，共檢出1 145例攜帶突變等位基因的個(gè)體，因此微陣列基因芯片檢測(cè)技術(shù)也可以使用于大規(guī)模人群的耳聾基因篩查。由于微陣列基因芯片面世相對(duì)較早，雖然其能檢測(cè)的熱點(diǎn)突變數(shù)量有限，但也有一部分二級(jí)實(shí)驗(yàn)室一直沿用該技術(shù)作為常規(guī)耳聾基因檢測(cè)手段。

2.6 實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù) 在耳聾基因檢測(cè)中，采用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)方案包括采用多色溶解探針檢測(cè)技術(shù)（MMCA）、基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)。MMCA的原理為針對(duì)突變位置設(shè)計(jì)引物和標(biāo)記探針，根據(jù)探針結(jié)合時(shí)的溶解曲線溫度對(duì)目標(biāo)位置進(jìn)行基因分型。采用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)操作可以有效避免PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，若配合自動(dòng)化判讀軟件，則判讀結(jié)果相對(duì)簡(jiǎn)單[22]。但是該方法單管檢測(cè)SNP具有局限性，當(dāng)檢測(cè)的目標(biāo)熱點(diǎn)突變較多時(shí)，需要使用較多的檢測(cè)管方可完成單樣本分析。若單批次的待測(cè)樣本較多時(shí)，需要多臺(tái)的PCR儀同時(shí)參與檢測(cè)，該方法檢測(cè)通量相對(duì)較低，因此更適合小型實(shí)驗(yàn)室采用[23-24]。與MMCA相比，基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)通量更低，因此基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)更適合用于特定突變點(diǎn)的驗(yàn)證[25]。

2.7 DHPLC DHPLC又被稱為溫度調(diào)節(jié)的雜合雙鏈分析（TMHA），是一種自動(dòng)化、高通量的基因突變篩查新技術(shù)，利用該技術(shù)可以對(duì)目標(biāo)片段DNA的差異進(jìn)行檢測(cè)[26]。在高通量測(cè)序普及之前， DHPLC已被證明是一種精確、快速、高效的檢測(cè)已知突變和篩查未知突變的方法，但由于該技術(shù)成本較低，也常用于人群等位基因頻率的研究[27]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的普及和成本的降低，且目前該設(shè)備大部分被醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室購(gòu)置，有注冊(cè)證的試劑較少，因此DHPLC技術(shù)在耳聾基因檢測(cè)的應(yīng)用尤其是臨床上的應(yīng)用逐步減少，目前主要被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究中[28]。

2.8 片段分析技術(shù) 片段分析技術(shù)主要指基于熒光PCR- 毛細(xì)管電泳法，使用特異性引物擴(kuò)增技術(shù)（AMP-PCR）檢測(cè)單核苷酸變異。通過設(shè)計(jì)的針對(duì)特定SNP特異性標(biāo)記引物，PCR擴(kuò)增后采用毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)，可以達(dá)到分辨1～2個(gè)核苷酸差異的片段，最后通過熒光信號(hào)判斷目標(biāo)SNP的分型[29]。該技術(shù)通量適中，適合于檢測(cè)范圍為10～50個(gè)SNP的多重PCR檢測(cè)?；跓晒鈽?biāo)記的毛細(xì)管電泳技術(shù)在耳聾基因檢測(cè)中已有一定的應(yīng)用[30]。目前也有一些商業(yè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)開發(fā)了基于片段分析技術(shù)的遺傳性耳聾基因檢測(cè)商用試劑，其檢測(cè)范圍與PCR-RDB法的相似，主要優(yōu)勢(shì)在于防止PCR氣溶膠污染能力比PCR-RDB法強(qiáng)，但大部分試劑仍然在做注冊(cè)證申報(bào)中，因此自主使用該檢測(cè)手段的機(jī)構(gòu)較少。在實(shí)際應(yīng)用中，若檢測(cè)機(jī)構(gòu)配備有毛細(xì)管電泳儀，則可以較為靈活地使用該檢測(cè)技術(shù)。

2.9 飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù) 飛行時(shí)間質(zhì)譜在耳聾基因檢測(cè)中已有應(yīng)用，蘭莉等[31]采集了85例貴州省的人工耳蝸植入患兒的樣本，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行了20個(gè)熱點(diǎn)耳聾基因的SNP分型，共檢出25名個(gè)體攜帶熱點(diǎn)耳聾基因突變；闕婷等[32]對(duì)廣西7 100例新生兒使用自動(dòng)判別聽性腦干誘發(fā)電位（AABR）進(jìn)行初篩、復(fù)篩，陽(yáng)性個(gè)體采用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行20個(gè)耳聾基因熱點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，共檢出251例陽(yáng)性攜帶者個(gè)體。因此，飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在耳聾基因的檢測(cè)中也得到了一定規(guī)模的應(yīng)用。

2.10 Sanger測(cè)序 Sanger測(cè)序是目前耳聾基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。在商品化試劑盒的研發(fā)和新耳聾突變的發(fā)現(xiàn)中，均需要以Sanger測(cè)序作為最后的判定標(biāo)準(zhǔn)，如任淑敏等[33]通過使用NGS技術(shù)后，在一個(gè)家系的兩名耳聾患者中找到了GJB2基因的IVS1+2 T ＞ A變異，并采用Sanger測(cè)序進(jìn)行了驗(yàn)證，證明了該變異是GJB2基因新發(fā)現(xiàn)的致病性變異。葉敏南等[34]采用Sanger測(cè)序法為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)一種包含4個(gè)耳聾基因的20種基因突變的PCR-RDB法檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證了該試劑盒的性能指標(biāo)，包括陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率、靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值等，認(rèn)為該試劑盒的性能指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)。因此，Sanger測(cè)序法在當(dāng)前階段的耳聾基因檢測(cè)中仍然具有重要的意義。

3 小結(jié)與展望

在耳聾基因檢測(cè)中，需要遵循患者表現(xiàn)型與基因型檢測(cè)結(jié)果相符的準(zhǔn)則。通常情況下，當(dāng)患者或其家屬有耳聾癥狀時(shí)，首先采集先證者的生物學(xué)樣本，優(yōu)先采用PCR-RDB法、微陣列基因芯片法、溶解曲線法、飛行時(shí)間質(zhì)譜法或者其他檢測(cè)熱點(diǎn)突變的方法，對(duì)受測(cè)者是否攜帶中國(guó)人群常見耳聾熱點(diǎn)突變基因進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)受測(cè)者的表現(xiàn)型與檢出的基因型不符時(shí)，進(jìn)一步采用全外顯子檢測(cè)技術(shù)結(jié)合CNV-seq技術(shù)對(duì)該樣本進(jìn)行分析，若存在疑似變異基因再用Sanger測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。各基層檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身實(shí)際情況選擇篩查熱點(diǎn)耳聾基因的檢測(cè)方案，當(dāng)需要進(jìn)一步驗(yàn)證時(shí)則送至有條件的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室或科研機(jī)構(gòu)完成。耳聾作為一種致殘的遺傳疾病，目前正逐步引起各專業(yè)防控機(jī)構(gòu)的關(guān)注，隨著各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)條件的改善，耳聾基因檢測(cè)技術(shù)在國(guó)內(nèi)各檢測(cè)機(jī)構(gòu)逐漸普及，耳聾基因在人群中的頻率逐步被揭示，各種可導(dǎo)致耳聾的基因變異也被逐漸發(fā)現(xiàn)。未來，在各臨床機(jī)構(gòu)的共同努力下，新發(fā)耳聾在人群中的占比將逐漸降低。