唾液腺腺樣囊性癌中外泌體功能的研究進展

于晶晶，孟 穎，葉金海

唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是一種臨床常見的唾液腺惡性腫瘤，每年報道的發(fā)病率為3.0/100萬～4.5/100萬例，約占頭頸部惡性腫瘤的1%，約占唾液腺腫瘤的10%。除了最常累及小唾液腺(minor salivary glands,MSGs)外，還可累及大唾液腺(包括腮腺、下頜下腺和舌下唾液腺)，少數(shù)甚至?xí)奂榜袈溝佟I腺等頭頸部其他部位[1]。與其他惡性腫瘤相比，SACC往往生長緩慢，具有高度嗜神經(jīng)特性，侵襲性強并易入侵血管，導(dǎo)致血行轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞如侵襲進入神經(jīng)束膜，則單純手術(shù)并不能完全切除干凈。唾液腺樣囊性瘤遠期預(yù)后不良，文獻報道后5年生存率為89.0%，10年生存率為67.0%，15年生存率為39.6%[2]。對其治療方法包括手術(shù)治療、放化療、生物治療等[3]。近年來，對該病的發(fā)病機制和分子表型的研究取得了一些進展[4]，細胞的劃痕實驗、增殖實驗和侵襲實驗等體外實驗方法的運用，使研究人員逐漸認(rèn)識到外泌體在實體腫瘤的增殖、遷移和侵襲中起重要作用，進一步探究關(guān)于外泌體在腺樣囊性癌中的功能具有重要意義，可為腺樣囊性癌的發(fā)病機制研究開拓新思路。本文就外泌體在SACC中的功能研究進展作一綜述，從而為臨床治療SACC提供新的理論基礎(chǔ)。

1 外泌體(exosomes)

外泌體(exosomes)最初由Johnstone等于1985年從綿羊網(wǎng)織紅細胞上清液中分離而得[5]。外泌體的直徑在40～100 nm，這種囊泡廣泛分布在體液中[6-7]，可由多種類型的細胞分泌并釋放到細胞外間隙。最初外泌體的特性未被揭露，后隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)這種雙層膜性囊泡由多種成分組成，包括蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、各種代謝物、RNA和DNA等[8]。外泌體常用的純化和檢測方法包括超速離心技術(shù)、蔗糖密度梯度離心法、聚乙二醇(ployethyleneglycol，PEG)沉淀法、超濾分離法、免疫親和捕獲方法[9]。每項技術(shù)都具備各自明顯的優(yōu)缺點，故應(yīng)根據(jù)實際實驗需要選取適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行外泌體的分離。通過透射電鏡、蛋白免疫印跡實驗以及納米粒子追蹤分析儀(nanoparticle tracking analysis, NTA)粒徑分析實驗聯(lián)合證明用上述方法從體液和細胞上清中分離出來的物質(zhì)是外泌體。外泌體是細胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)的一種亞型[10]，經(jīng)核內(nèi)體途徑形成，是由早期核內(nèi)體的向內(nèi)出芽形成的。其通過胞吐作用分泌到胞外，作用于相應(yīng)的靶細胞并產(chǎn)生一系列生理和病理作用。外泌體參與基本的生理過程，如神經(jīng)元通信[11]、抗原遞呈[12]、免疫應(yīng)答[13]、器官發(fā)育[14]和生殖性能[15]。它們還參與了一些病理過程，包括癌癥進展[16]、炎癥[17]、心血管疾病[18]等。同時外泌體可攜帶功能性分子作為關(guān)鍵致病蛋白，與阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[19]。

2 外泌體對腫瘤的調(diào)控

外泌體參與許多機體的生理和病理過程，其中外泌體在腫瘤進展方面產(chǎn)生的作用受到廣泛關(guān)注。外泌體對腫瘤調(diào)控所起的作用是雙向的，即不同類型的外泌體起到促進或抑制腫瘤的作用：大多數(shù)免疫細胞來源的外泌體通過對相應(yīng)特定靶細胞的作用抑制腫瘤生長；而腫瘤細胞來源的外泌體(TEXs)則通過不同的機制促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。外泌體與腫瘤的雙向關(guān)系中后者的研究受到相對多的關(guān)注，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診療及耐藥性中具有重要的研究價值和臨床意義。外泌體參與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，如骨腫瘤、B細胞惡性腫瘤、黑色素瘤、白血病、肺癌、唾液腺樣囊性癌、消化道腫瘤。此外，外泌體在一些非腫瘤疾病中的作用也受到越來越多的關(guān)注。尿液外泌體是一種腎臟疾病的新型生物學(xué)標(biāo)志，在一些非腫瘤性肝臟疾病中外泌體也扮演著重要的角色，可作為肝臟疾病診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志，也可作為載體在細胞間傳遞藥物和靶向基因。

3 外泌體參與腫瘤進展

外泌體中富含的腫瘤相關(guān)蛋白、核酸(包括miRNAs、lncRNAs、circRNAs、mRNAs、DNA)以及糖蛋白、糖脂等糖復(fù)合物和脂質(zhì)，是腫瘤診斷的重要特異性標(biāo)志物。隨著外泌體分子生物學(xué)特性和相關(guān)結(jié)構(gòu)功能研究的深入，其在腫瘤患者的血液或者其他體液中開展“液體活檢”，這一獨特功能也逐漸揭露并得到越來越多的認(rèn)可。外泌體在腫瘤微環(huán)境中起到改變腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境、參與血管形成、促進腫瘤轉(zhuǎn)移、影響免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的作用，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。Jang等研究顯示，在小鼠乳腺癌4T1細胞系中，其來源的外泌體具有促癌作用，腫瘤來源的外泌體具有影響巨噬細胞浸潤和M2極化的作用，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20]。Grange等研究發(fā)現(xiàn)，外泌體促進血管形成和腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成，尤其是促進CD105+腎細胞癌發(fā)生肺部的遠處轉(zhuǎn)移。miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)等作為重要的信號分子由外泌體運輸、傳遞給腫瘤微環(huán)境中的受體細胞，改變其正常生理或者病理過程，從而發(fā)揮重要的作用[21]。Zeng等研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腫瘤來源的外泌體通過miR-25-3p靶向于Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(KLF2)和KLF4，調(diào)控內(nèi)皮細胞VEGFR2、ZO-1、occludin和Claudin5的表達，增加血管通透性，促進血管生成，同時也促進了結(jié)直腸癌向肝和肺的遠處轉(zhuǎn)移[22]。Lee等研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中OVCAR-3 EOC細胞螯合作用觸發(fā)的外泌體(chelation-induced exosomes，CI-exosome)由細胞外鈣離子的螯合作用誘發(fā)產(chǎn)生并釋放到細胞外間質(zhì)，不同來源和不同類型的外泌體亞類調(diào)控著腫瘤細胞各異的生物學(xué)行為[23]。

4 外泌體在唾液腺樣囊性癌中的作用

外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中對腫瘤作用的調(diào)控是雙向的。一方面，以自然殺傷(NK)細胞為代表的大多數(shù)免疫細胞來源的外泌體通過激活或殺傷靶細胞的能力對轉(zhuǎn)移性或血液病惡性腫瘤顯示出快速的免疫力，并且臨床上表現(xiàn)出一定的抗腫瘤能力[24]。另一方面，腫瘤來源的外泌體通過miRNA與腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細胞相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤進展、血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸[25]。這里著重于SACC細胞衍生的外泌體(TEXs)在SACC中作用的研究進展，探索SACC來源外泌體在疾病進展中的作用機制，并在一定程度上提示其潛在應(yīng)用于臨床腫瘤治療的意義。

4.1 促進腫瘤增殖

正常細胞增殖與凋亡的平衡維持著體內(nèi)組織器官的生長代謝平衡，而腫瘤細胞中細胞增殖與凋亡的失衡主要表現(xiàn)在腫瘤細胞毫無約束地增長以及凋亡作用的減弱，最終導(dǎo)致腫瘤快速發(fā)展。腫瘤細胞來源的外泌體可促進唾液腺腺樣囊性癌的增殖。Liu等研究表明，通過PKH67綠色熒光標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)SACC-83可以攝取自身來源的外泌體，這表明SACC-83為自身來源外泌體的靶細胞，也意味著腺樣囊性癌細胞可通過外泌體途徑將促瘤因子傳遞給自身，改變自身基因表型，從而影響腫瘤細胞的生物學(xué)功能[26]；此外，MTT細胞增殖實驗證明了SACC-83來源的外泌體作用于SACC-83本身后其增殖能力顯著增強，這提示了在SACC腫瘤進展過程中，自身來源的外泌體扮演著“促瘤因子”的作用，該實驗進一步證實了外泌體促進腫瘤細胞增殖的作用是通過MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的，NDRG2(N-myc downstream-regulated gene 2)基因的下調(diào)與較低的SACC總體生存率和無遠處轉(zhuǎn)移的生存率有一定的關(guān)系；外泌體攜帶的miRNA與SACC腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移也有關(guān)聯(lián)，這提示miRNA可能作為NDRG2基因的重要調(diào)控因子在SACC腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等腫瘤進展中發(fā)揮不可忽視的作用[27]。馬杰等研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸蛋白激酶阻斷劑genistein(4′-5,7-三羥基異黃酮)對SACC-83細胞株具有顯著的抑制效應(yīng)，且該抑制效應(yīng)具有劑量和時間依賴性，隨著劑量和時間的增加而增加[28]，其機制可能為genistein阻斷了細胞周期G2期向M期的轉(zhuǎn)變，并且誘導(dǎo)細胞凋亡，這為利用外泌體裝載genistein途徑治療SACC腫瘤細胞提供了新思路。

4.2 促進腫瘤嗜神經(jīng)侵襲(PNI)

嗜神經(jīng)侵襲(perineural invasion，PNI)特性是SACC顯著的生物學(xué)特征之一，并且被認(rèn)為是不利的預(yù)后因素。Amit等調(diào)查了1985年至2011年間在全球9個癌癥中心接受過ACC治療的所有患者，在239例(48%)神經(jīng)侵犯患者中，有174例(73%)發(fā)生神經(jīng)周侵犯，65例(27%)發(fā)生神經(jīng)內(nèi)侵犯，37例(15%)發(fā)生神經(jīng)周圍炎癥(癌細胞浸潤到神經(jīng)周圍間隙中，并伴有淋巴細胞浸潤)[29]。郭佳等研究發(fā)現(xiàn)，施萬細胞作為神經(jīng)周圍腫瘤微環(huán)境的一個關(guān)鍵因素，能通過NT-3/TrkC信號通路影響腫瘤微環(huán)境的變化，對SACC嗜神經(jīng)侵襲(PNI)起到促進作用[30]，在NT-3的作用下，SACC細胞的TrkC特異性受體發(fā)生酪氨酸磷酸化，激活下游Ras、Erk1/2、Ark和Bcl信號通路，提高SACC的侵襲能力。這一過程中神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的可溶性小分子蛋白NT-3作為外泌體可能攜帶的物質(zhì)促進腫瘤的嗜神經(jīng)侵襲，且腫瘤和神經(jīng)周圍的微環(huán)境有助于施萬細胞早期主動向腫瘤細胞的遷移[31-32]。最近對ACC中神經(jīng)周侵襲的存在進行系統(tǒng)評價表明，它與遠處轉(zhuǎn)移或生存率無關(guān)，但與局部復(fù)發(fā)和切緣累及有關(guān)[33]，這一特征影響患者的治療及預(yù)后。對患者進行長期隨訪，隨訪過程中監(jiān)測腫瘤的臨床表現(xiàn)，對于更好地了解ACC并進行進一步臨床病理評估，以及改善預(yù)后至關(guān)重要。

4.3 促血管生成作用

血管生成對于實體腫瘤生長和遠處轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[34]，SACC也不例外。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是極為重要的血管生成介質(zhì)因子[35-36]。血管生成的關(guān)鍵是促血管生成細胞因子的VEGF家族與其各自受體的相互作用，其中VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤生長因子(PIGF)，VEGF受體家族包含VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3。其中VEGFR2的表達通常僅限于血管內(nèi)皮細胞，被廣泛認(rèn)為是驅(qū)動血管生成的主要受體[37]。劉佳等研究發(fā)現(xiàn)，一些基因和蛋白通過調(diào)節(jié)VEGF的水平來調(diào)節(jié)SACC的侵襲和轉(zhuǎn)移[38]，這些基因包括抑癌基因P53、PTEN、融合基因MYB-NFIB；蛋白包括缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha, HIF-1α)、癌胚抗原相關(guān)粘附因子-1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-1, CEACAM-1)、整合素連接激酶(integrin-linked kinase, ILK)、黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)、DNA結(jié)合分化抑制蛋白(inhibitor of DNA-1, Id-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、STAT3(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、CD147(EMMPRIN)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)。這些蛋白因子和基因之間也存在相互作用，共同調(diào)節(jié)VEGF水平。

4.4 遠處轉(zhuǎn)移

SACC患者腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移頻繁發(fā)生，主要發(fā)生在治療后的前5年。研究表明遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率為20%～52%，平均時間31.50～46.00個月[39]。而遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大多數(shù)癌癥患者死亡的主要原因。Syn等研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是腫瘤細胞與腫瘤細胞間或腫瘤細胞與間質(zhì)細胞間通信且關(guān)鍵的信使，細胞間借助外泌體來構(gòu)建局部和遠距離的微環(huán)境[40]。腫瘤來源的外泌體(TDE)可能通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、形成轉(zhuǎn)移前腫瘤微生態(tài)以及通過免疫調(diào)節(jié)作用，促進腫瘤逃脫免疫監(jiān)測等機制，以促進腫瘤增殖和擴散而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的開始。鑒于TDE在SACC遠處轉(zhuǎn)移中的重要作用，針對TDE的策略對于改善癌癥患者的結(jié)局至關(guān)重要。一些使用基于RNA的敲除策略提供了TDE抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的概念，可以設(shè)想利用外泌體的組織特異性將這類治療性核酸藥物輸送至腫瘤細胞內(nèi)治療的臨床應(yīng)用[41]。Ni等研究發(fā)現(xiàn)，SACC的血源性轉(zhuǎn)移與NRP1和VEGF-A的高表達以及Sema-3A和Sema-3F的低表達有關(guān)[42]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，由于NRP1和VEGF-A結(jié)合而引起的腫瘤組織中微血管數(shù)量增加，是導(dǎo)致SACC中血源性轉(zhuǎn)移常見的原因之一。

SACC腫瘤遠處轉(zhuǎn)移最常見于肺，其次是骨骼、肝和腦，一些患者會涉及多個部位的腫瘤轉(zhuǎn)移[43]，由于其早期癥狀不明顯，因此在初次就診時容易遺漏血源性轉(zhuǎn)移病灶存在的可能。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，與SACC-2(低肺轉(zhuǎn)移細胞系)和SACC-83(低肺轉(zhuǎn)移細胞系)細胞相比，SACC-M(高肺轉(zhuǎn)移細胞系)細胞中大多數(shù)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)的表達均降低，但磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(Glypican-5,GPC5)表達在SACC-M中分別提高了3.24倍和815.69倍(超過3倍)[44]，HSPG和GPC5可由囊泡包裹至外泌體分泌到細胞外間質(zhì)。免疫組織化學(xué)分析顯示，與無肺轉(zhuǎn)移的SACC相比，有肺轉(zhuǎn)移的SACC中GPC5的表達更高。 盡管GPC5沉默對SACC-M細胞增殖沒有顯著影響，但GPC5沉默后，裸鼠SACC-M細胞的肺轉(zhuǎn)移明顯減少(P<0.05)。這些均提示GPC5可能有助于SACC的肺轉(zhuǎn)移。Kong等[45]研究發(fā)現(xiàn)，癌相關(guān)的成纖維細胞(CAF)分泌的EVs在小鼠中誘導(dǎo)了肺轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位形成，因此增加了SACC肺轉(zhuǎn)移。由CAF分泌的EV促進的肺成纖維細胞活化是肺轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位形成的關(guān)鍵事件。整聯(lián)蛋白α2β1介導(dǎo)肺成纖維細胞攝取CAF分泌的EV，并被TCI-15阻斷，從而阻止了肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成和隨后轉(zhuǎn)移的發(fā)生。攜帶異種移植物并具有高肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險的小鼠血漿EV整合素β1明顯上調(diào)。這表明血漿EV整合素β1可能是早期預(yù)測SACC轉(zhuǎn)移發(fā)生的有前途的生物標(biāo)志物。

ACC患者長期生存率低與發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移直接相關(guān)，針對腫瘤和間質(zhì)細胞的綜合策略對于預(yù)防SACC轉(zhuǎn)移是必要的。針對HSPG、GPC5、CAF EV、血漿EV整合素β1等這些腫瘤來源外泌體的監(jiān)測有望成為進行早期SACC診斷方面可能是有前途的有效候選靶標(biāo)。

5 結(jié) 語

綜上所述，外泌體與SACC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)是明確的。外泌體在多種病理生理過程中發(fā)揮重要的作用，尤其是在SACC的疾病進展中，外泌體促進了腫瘤的增殖、嗜神經(jīng)侵襲、促血管生成作用以及遠處轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移。但是，目前大規(guī)模使用外泌體作為治療工具面臨著實際的挑戰(zhàn)。因為幾微克的外泌體就需要數(shù)十億個間充質(zhì)干細胞(MSC)的培養(yǎng)，目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)的、有效的方法進行外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)和純化；而且外泌體的治療劑量和治療效果有待進一步研究，仍需要大量基于支持科學(xué)和轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)的臨床試驗以便推動外泌體治療的進展。