DNA 甲基化預測宮頸病變研究進展

陳叢，趙敏

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響婦女健康。由于宮頸癌病因明確，且疾病的發(fā)展需要數(shù)十年的時間[1]，作為可防可治的腫瘤，預防宮頸癌的有效措施依然是宮頸病變的篩查。目前宮頸病變篩查采用“三階梯的方式”，而用于普查的宮頸薄層液基細胞學檢查（thin-prep cytology test，TCT）具有特異度高、敏感度低的特點，高危型人乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）檢測具有敏感度高、特異度低的特點，在臨床中的作用受限。眾所周知惡性腫瘤的發(fā)生與抑癌基因雜合性丟失、基因突變和異常甲基化等導致正常細胞功能喪失、增殖失控有關。其中，DNA 甲基化是抑癌基因功能失活和轉(zhuǎn)錄抑制的關鍵機制之一，基因啟動子過甲基化已被證實在宮頸癌等腫瘤中普遍存在[2]。隨著對宮頸病變研究的深入，特異性的DNA 甲基化標志物檢測成為一種新興的篩查策略，可預測宮頸病變進展的風險。

1 宮頸病變篩查現(xiàn)狀

宮頸病變篩查始于宮頸脫落細胞學檢查，現(xiàn)階段用于普查的TCT 檢測方式受取材方式、人工閱片等主觀性影響，導致檢測結(jié)果易出現(xiàn)偏差。細胞學P16/Ki67 檢測是目前預測宮頸病變的研究熱點。P16INK4a（P16）是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，已被證明在致癌型HPV 的轉(zhuǎn)化感染中過表達，并被認為是宮頸癌前病變的替代標志物[3]。Klaes等[4]的研究表明，P16 免疫組織化學染色可以精確識別小的宮頸癌前病變及宮頸癌。Ki67 是一種核抗原和細胞增殖生物標志物，在細胞周期的G0 階段不表達，在細胞有絲分裂期間表達達到峰值，一直是測量和監(jiān)測腫瘤細胞增殖的標志物。宮頸病變的相關研究發(fā)現(xiàn)，Ki67 的陽性表達隨著宮頸病變程度的加重而增加[5]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，P16/Ki67 雙重染色對CIN2 的陽性檢出率低于對CIN3+的陽性檢出率（41.1%vs.86.9%）[6]。

HR-HPV 持續(xù)感染被認為是宮頸癌前病變進展到宮頸癌的主要因素，21 世紀初，HPV DNA 檢測由于其高敏感度被用于宮頸病變篩查。但隨后研究發(fā)現(xiàn)，臨床上HPV 陽性患者多為“一過性感染”，可在1～2 年內(nèi)清除，不會引起前驅(qū)病變或惡性腫瘤，故HPV 檢測結(jié)果的假陽性率較高。HPV 致癌的關鍵在于基因組整合入宿主細胞發(fā)生病毒癌基因E6、E7的過表達，刺激細胞進入無限增殖狀態(tài)，導致癌變。以HPV 的致癌基因E6、E7 轉(zhuǎn)錄的mRNA 為靶點，根據(jù)轉(zhuǎn)錄情況來判斷HPV 的感染及病毒活性狀態(tài)，可以區(qū)別感染性質(zhì)，排除“一過性感染”，更有效地反映病變的進展，減少不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診。

宮頸病變篩查的目的在于及時篩查出高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL），但是基于我國國情，大部分宮頸病變篩查仍選用單一的TCT 檢查或用HPV DNA 檢測分流TCT 結(jié)果異常的方式，造成了臨床工作中宮頸HSIL 的漏診或過度診斷。

2 DNA 甲基化與宮頸病變

惡性腫瘤通常是由遺傳和表觀遺傳改變的積累引起的，最近的證據(jù)表明，特定基因的表觀遺傳變化可能介導或預測致癌進展?；虻谋碛^遺傳學調(diào)控包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA調(diào)控等，其中基因啟動子區(qū)的異常DNA 甲基化是癌前和惡性階段中公認的最常見的表觀遺傳學標志。它通常發(fā)生在腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)錄因子和細胞周期調(diào)節(jié)因子基因的CpG 二核苷酸中的胞嘧啶上，通過啟動子沉默抑制基因表達導致整體低甲基化和基因特異性高甲基化，在包括宮頸癌在內(nèi)的致癌機制中起關鍵作用[7]。宮頸組織中DNA 甲基化包括宿主基因甲基化和HPV DNA 甲基化，可采用甲基化特異性定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測、焦磷酸測序以及最近發(fā)現(xiàn)的各種基于芯片的深度測序等方法進行檢測。目前在宮頸組織中已檢測出超過100 種甲基化標志物，近20 種在文獻中被報道，其中約有10 種基因的甲基化水平在宮頸HSIL 和宮頸癌中升高[8]。DNA 甲基化異常不僅被證實與宮頸癌治療后的隨訪及遠期預后密切相關[9]，由于其具有較高特異度，故現(xiàn)階段也正被開發(fā)作為宮頸病變篩查策略的附加工具。

2.1 宿主細胞甲基化預測宮頸病變宿主細胞DNA 甲基化是來自宿主的細胞防御機制，沉默入侵的外來病毒基因組并抑制病毒復制。由于其檢測具有自動化、客觀性，不依賴于分子形態(tài)學及主觀解釋，且對宮頸HSIL+的檢出有較高特異度，既可以用作分流HPV DNA 陽性患者，又可以用在缺乏專業(yè)病理醫(yī)生的地區(qū)。目前已知可以預測宮頸病變的宿主細胞甲基化的基因包括配對盒家族基因1（PAX1）、性別決定區(qū)域Y 盒1（SOX1）、鋅指蛋白582（ZNF582）和細胞周期調(diào)節(jié)蛋白1（CCNA1）等。

2.1.1 PAX1 PAX 基因編碼一個由9 個轉(zhuǎn)錄因子組成的家族，這些轉(zhuǎn)錄因子在正常表達的組織中充當細胞譜系特異性調(diào)節(jié)劑，被認為是惡性腫瘤進展的重要因素。PAX 基因家族根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分為4 組，包括PAX1/9、PAX2/5/8、PAX3/7 和PAX4/6。PAX1位于染色體20p11.2 上，是PAX 家族中甲基化最頻繁的基因[10]。PAX1 可能參與浸潤性或侵襲性惡性腫瘤的癌變和腫瘤進展，如宮頸癌、口腔癌和卵巢癌。Lai 等[11]首次報道了PAX1 異常甲基化與宮頸癌相關。Nikolaidis 等[12]的薈萃分析納入了1 385 例不同級別的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）患者和正常對照者，發(fā)現(xiàn)CIN3+與正常對照樣本中PAX1 甲基化的敏感度和特異度分別為77%和92%。Liu 等[13]研究認為，當鑒別宮頸惡性與非惡性病變的臨界值（△Cp 值）的截斷值為13.28 時，PAX1 甲基化檢測的敏感度、特異度和受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）分別可達92.30%、78.60%和0.902，其陽性預測值為80.00%，陰性預測值為91.67%。在檢出CIN3+方面，與HPV 檢測相比，PAX1 甲基化檢測的特異度及陽性預測值顯著增高（93.3% vs.60.0%，87.0% vs.57.1%）[14]。因此，若PAX1 甲基化與HPV 聯(lián)合檢測或分流HPV DNA 陽性患者可以提高宮頸病變篩查的準確性，避免臨床工作中過度轉(zhuǎn)診陰道鏡。

2.1.2 SOX1 SOX 基因是一類Y 染色體性別決定區(qū)（sex determination region of Y chromosome，SRY）相關基因構(gòu)成的基因家族，其參與胚胎發(fā)育和凋亡過程中轉(zhuǎn)錄因子的編碼，與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路有關。SOX 基因的異常表達可以激活β-連環(huán)蛋白信號通路，促進β-連環(huán)蛋白分解，抑制β-連環(huán)蛋白的活性，從而影響胚胎發(fā)育和腫瘤形成。SOX1 基因是SOX 基因家族的成員，參與多種腫瘤的發(fā)生和進展。例如，SOX1 甲基化水平在肝癌、口腔鱗狀細胞癌和宮頸癌組織中顯著升高[15]。Lai 等[16]研究認為，SOX1甲基化是CIN3+檢測的一個潛在的生物學標志物，在CIN3+患者中SOX1 甲基化發(fā)生率為100%。一項薈萃研究納入了918 例CIN3+患者和2 193 例CIN2-患者共14 項相關研究，發(fā)現(xiàn)SOX1 啟動子的高甲基化在區(qū)分CIN3+患者和CIN2-患者時的AUC為0.838，敏感度和特異度分別為75%和71%，用于評估綜合敏感度和特異度數(shù)據(jù)準確性的診斷優(yōu)勢比（diagnostic odds ratio，DOR）為11.12（＞1），表明SOX1甲基化對CIN3+的篩查具有重要的診斷價值[17]。在與HPV 相關的研究中發(fā)現(xiàn)，HPV 陽性聯(lián)合SOX1 甲基化檢測較單獨HPV 陽性診斷CIN3+的準確性顯著升高（69.8%vs.27.9%）[18]。

2.1.3 ZNF582 KRAB-鋅指蛋白家族參與調(diào)節(jié)DNA 修復、細胞周期和組織轉(zhuǎn)化等生理過程。既往研究表明，ZNF582 甲基化與宮頸癌有關，且ZNF582甲基化檢測提高了目前宮頸病變篩查的有效性，并將不必要的陰道鏡檢查和活檢轉(zhuǎn)診減少了60%[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，當截斷值為0.62 時，ZNF582 檢測CIN3+的敏感度和特異度分別為70%和82%，AUC可達到0.80[20]。對未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）人群進行研究發(fā)現(xiàn)，ZNF582 甲基化檢測CIN3+的敏感度為91.4%，特異度為95.0%，且AUC 大于PAX1 甲基化檢測和HPV 檢測（0.96 vs.0.92 vs.0.67）[21]。在HPV相關研究中發(fā)現(xiàn)，當ZNF582 的截斷值≤11 時，ZNF582 聯(lián)合HPV16/18是檢出CIN3+的最佳組合，其敏感度為85.4%，特異度81.1%[22]。

2.1.4 CCNA1 CCNA1 是一種腫瘤抑制基因，在HPV E6 和E7 蛋白嵌入宿主細胞后被激活，導致惡性腫瘤發(fā)生。2014 年Khunamornpong 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，正常宮頸、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）和HSIL 的CCNA1 甲基化水平不同，分別為0、2.88%、83.33%。Oranratanaphan 等[24]研究顯示，CCNA1 甲基化的陽性預測值高達80.0%，可以用于分流ASCUS 陽性患者。診斷宮頸HSIL 時，盡管CCNA1 甲基化檢測的敏感度低于HPV 檢測（83.33%vs.100%），但特異度顯著高于HPV 檢測（96.88%vs.21.88%），可以用于與HPV 聯(lián)合篩查或分流HPV 陽性患者[25]。

此外，還有其他基因啟動子甲基化被認為是預測宮頸病變的標志物。Bu 等[26]研究發(fā)現(xiàn)趨化因子成員A4（FAM19A4）與細胞學分級呈正相關，甲基化率由低到高依次為正常宮頸組織、LSIL、HSIL、宮頸癌（10.61%、35.48%、56.14%和93.44%）。細胞黏附分子1（CADM1）和T 淋巴細胞成熟相關蛋白（MAL）啟動子的甲基化可能與宮頸病變進展相關。有研究表明，宮頸炎癥標本中CADM1 和MAL 啟動子的甲基化水平是正常宮頸組織的1.5 倍（P＜0.05）[27]。由于持續(xù)炎癥與宮頸病變進展風險升高相關，推測CADM1 和MAL 啟動子的甲基化水平升高可能出現(xiàn)在組織破壞中，推動宮頸病變進展。連接黏附分子3（JAM3）通過細胞間的黏附及相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長，能夠顯著提高特異度和陽性預測值，對于ASCUS 患者，尤其是小于30 歲的患者有一定的分流效能[28]。

2.2 HPV 病毒基因甲基化預測宮頸病變目前認為，HR-HPV 持續(xù)感染是宮頸癌前病變進展到宮頸癌的主要因素，HPV 病毒基因分型以及病毒癌蛋白E6/E7 的轉(zhuǎn)錄水平已被用作預測宮頸病變進展的重要生物學標志。HPV 感染進展也與HPV DNA 甲基化模式有關，宮頸HSIL+中HPV DNA 甲基化水平更高，因此HPV DNA 甲基化正被用作宮頸病變篩查的新標志物。HR-HPV 病毒通過宮頸上皮的微傷口進入，HPV 病毒衣殼蛋白L1 和L2 附著在基底膜上，2～4 h 后被內(nèi)化，導致基底上皮細胞感染。病毒基因組是作為染色體外環(huán)狀附加體建立的，可以參與細胞轉(zhuǎn)錄和復制。HPV DNA 甲基化可能是宿主對感染的反應，但也可能是病變向腫瘤進展的表現(xiàn)。目前研究主要集中在HPV L1、L2 區(qū)域CPG 位點的甲基化。有研究指出，HPV31、HPV18 和HPV45 在L2 和L1具有高甲基化區(qū)域，且在CIN3 病毒CpG 位點甲基化增加[29]；HPV16 晚期啟動子內(nèi)病毒CpG 位點的甲基化率可能隨著病變（炎癥-LSIL-HSIL-癌）的程度變化而增加，在宮頸LSIL、HSIL 及宮頸癌樣本中，甲基化率分別為13.6%、31.9%和83.1%。與TCT 檢查相比，HPV DNA 甲基化檢出宮頸HSIL 的敏感度（80.0% vs.76.6%）及約登指數(shù)（0.46 vs.0.31）均較高，且不需要細胞學標本制備設備，表現(xiàn)出HPV DNA 甲基化檢測即時分診CIN3+的潛力[30]。

3 結(jié)語與展望

選擇最優(yōu)的聯(lián)合篩查技術進行宮頸病變篩查，是為了使低級別病變與高級別病變完全分化。既要避免自然消退的HPV 感染患者不必要的手術所導致不良影響，同時也要及時檢測疾病進展防治癌前病變進展到癌。DNA 甲基化是臨床研究中改進診斷、分期和預測的良好生物學標志物，對于檢出宮頸HSIL+有潛在作用。但是DNA 甲基化作為單一篩選工具的效用有限，聯(lián)合HPV 檢測或分流HPV DNA陽性患者，既可以彌補TCT 檢查的主觀性，又可以避免HPV 檢查假陽性造成的過度轉(zhuǎn)診陰道鏡，可能是一種合理的篩查選擇。