鞘內(nèi)注射納洛酮對術(shù)后痛大鼠IFN-γ 表達(dá)的影響*

張. 瑜. 趙. 軍. 喻文立. 曹君利. 胡. 南. 杜洪印△

（1 天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院麻醉科，天津 300192；2 徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，徐州 221004；3 天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，天津 300060）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織成員國數(shù)據(jù)統(tǒng)計，每年有接近2.4 億人接受各種類型的手術(shù)，其中接近86%的病人術(shù)后出現(xiàn)中到重度疼痛，其對術(shù)后免疫系統(tǒng)的干擾受到廣泛關(guān)注[1]。研究證實，疼痛作為強烈的傷害性刺激通過應(yīng)激反應(yīng)顯著抑制免疫功能，進(jìn)而影響術(shù)后病人預(yù)后和轉(zhuǎn)歸[2]。因此，術(shù)后疼痛作為重要的免疫抑制因素應(yīng)進(jìn)行深入和系統(tǒng)的研究。

干擾素-γ (interferon, IFN-γ) 是激活的NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞產(chǎn)生的免疫活性因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS) 還有部分由小膠質(zhì)細(xì)胞分泌[3]。血漿中IFN-γ 在細(xì)胞免疫以及腫瘤免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[4]，而在CNS 中，特別是海馬，IFN-γ 與許多腦功能紊亂的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可誘導(dǎo)CNS 小膠質(zhì)細(xì)胞過度反應(yīng)[5]并參與認(rèn)知功能障礙的發(fā)展[6]。因而，IFN-γ 是機體免疫狀態(tài)的重要評估指標(biāo)。一項慢性疼痛研究顯示，關(guān)節(jié)痛病人血漿IFN-γ 水平下降，而有效鎮(zhèn)痛后IFN-γ 水平顯著提升，提示慢性疼痛存在免疫抑制作用[7]。而術(shù)后急性疼痛對IFN-γ 表達(dá)的影響尚未見報道。

納洛酮作為經(jīng)典阿片受體拮抗劑，主要通過拮抗mu 受體逆轉(zhuǎn)阿片物質(zhì)的鎮(zhèn)痛并參與解毒作用。很多研究也顯示，納洛酮的生物學(xué)作用與劑量相關(guān)，小劑量納洛酮不抑制阿片藥物鎮(zhèn)痛作用，并可增強其鎮(zhèn)痛效果，且具有穩(wěn)定胃腸功能及降低呼吸抑制的積極作用[8,9]。然而，不同劑量納洛酮鞘內(nèi)單獨應(yīng)用對術(shù)后痛介導(dǎo)的免疫抑制影響及其機制尚未見報道。本研究觀察不同劑量納洛酮鞘內(nèi)給藥對術(shù)后痛大鼠海馬和血漿IFN-γ 表達(dá)的影響，從中樞及外周整體評估免疫狀態(tài)并揭示其內(nèi)在機制，為改善術(shù)后痛介導(dǎo)的免疫抑制提供研究依據(jù)。

方 法

1.實驗材料

本實驗動物進(jìn)行的研究行為均嚴(yán)格遵守相關(guān)動物保護(hù)及使用規(guī)定。SPF 級健康雄性SD 大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，每籠5 只飼養(yǎng)，自然照明，自由攝食、飲水。參照St?rkson 等[10]的方法，對152 只大鼠行L5～6間隙鞘內(nèi)置管，置入PE10 導(dǎo)管（寧波安來軟件科技有限公司）。大鼠蘇醒后24 h 觀察其活動情況，剔除8 只運動功能障礙大鼠，隨后鞘內(nèi)注射2%利多卡因20 μl，大鼠出現(xiàn)雙后肢麻痹為置管造模成功共144 只，采用隨機數(shù)字表法分為6 組：生理鹽水組（C 組）、術(shù)后痛組（P 組）、小劑量納洛酮組（N1 組，1 ng/kg）、大劑量納洛酮組（N2 組，100 ng/kg）、術(shù)后痛 + 小劑量納洛酮組（PN1 組，1 ng/kg）、術(shù)后痛 + 大劑量納洛酮組（PN2 組，100 ng/kg），每組24 只。

2.方法

術(shù)后痛組（P 組）于右足跖肌切口制備術(shù)后痛模型。于鞘內(nèi)置管后7 天，參照Brennan 等[11]的方法制備術(shù)后痛模型。吸入七氟醚麻醉后右足底近端0.5 cm處向趾部作一長約1 cm切口，切開皮膚筋膜，用眼科鑷挑起足底跖肌并縱向切割，但保持肌肉起止及附著完整，皮膚縫合，切口以青霉素藥液沖洗。制備術(shù)后痛模型前20 min 時，N1 組、PN1 組鞘內(nèi)給予納洛酮（批號：h20093199，國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司）1 ng/kg，N2 組、PN2 組鞘內(nèi)給予納洛酮100 ng/kg，各組所用藥液均以生理鹽水稀釋至50 μl，C 組和P 組給予等容量生理鹽水。各組于造模前24 h (T0)、術(shù)后1 h (T1)、6 h (T2)、24 h (T3)、48 h (T4)、72 h (T5) 檢測機械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 和熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)，各組在T0、T2、T3、T5分別取6 只大鼠即刻斷頭處死，取海馬、外周血（血漿），以ELISA 法檢測IFN-γ 表達(dá)。

3. MWT 的測定

將一透明有機玻璃箱 (22 cm×22 cm×12 cm)置于30 cm 高的金屬篩網(wǎng) (1 cm × 1 cm) 上，待大鼠在箱中適應(yīng)30 min 后，采用電子vonFrey 纖維絲（IITC 公司，美國），垂直刺激大鼠右后足與附近第3、4 趾間皮膚，每次持續(xù)4～6 s。大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應(yīng)，并記錄此時的刺激強度，每次間隔15 s 以上，共刺激5 次，計算其平均值為MWT。

4. TWL 的測定

將有機玻璃箱置于3 mm 厚玻璃板上，大鼠在箱中自由活動30 min 以適應(yīng)測試環(huán)境和溫度。室溫穩(wěn)定在24～26℃。采用Model 390 Heated Base 熱痛刺激儀（IITC 公司，美國）照射大鼠足底緊貼玻璃板部位，具體同MWT 測定部位。記錄照射開始至大鼠出現(xiàn)抬足或舔足時間，照射時間不超過20 s，以防止組織損傷。測定5 次，每次間隔至少5 min，取最后3 次刺激的平均值為TWL。

5. IFN-γ 含量測定

取大鼠海馬或外周血（血漿），置于含1 ml濃度為0.2 mol/L 的醋酸溶液勻漿器中勻漿。煮沸10 min，4℃、3500 rpm 離心半徑13.5 cm，離心10 min。取上清放入試管中冰凍、干燥、濃縮后PBS 等容，待測液-80℃保存，采用ELISA 法（試劑盒購自上海藍(lán)基生物科技有限公司提供，檢測限20 pg/ml～480 pg/ml）測定IFN-γ 含量，ELX800酶標(biāo)儀由美國Bio-Tek 公司提供。

6.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，組間和組內(nèi)比較采用雙因素方差分析，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 鞘內(nèi)給予小劑量納洛酮可提高大鼠MWT，大劑量納洛酮可降低大鼠MWT

術(shù)前各組MWT 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與C組相比，P 組術(shù)后1～72 h MWT 降低 (P< 0.05)，表明術(shù)后痛模型建立后72 h 內(nèi)大鼠始終處于機械痛致敏狀態(tài)；N1 組術(shù)后1、6 h MWT 升高 (P< 0.05)，表明單獨給予納洛酮可升高大鼠機械痛閾值，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用；與C 組相比，PN1 組6～72 h MWT 降低 (P< 0.05)，術(shù)后1 h 差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而與P組相比，PN1 組術(shù)后1、6 h MWT 升高 (P< 0.05)，表明小劑量納洛酮可在術(shù)后6 h 內(nèi)有效升高術(shù)后痛大鼠機械痛閾值，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用；與C 組相比，N2組術(shù)后1、6 h MWT 降低，表明大劑量納洛酮可降低大鼠機械痛閾值，產(chǎn)生痛敏，但N2 組MWT 始終顯著高于P 組，表明此作用遠(yuǎn)低于術(shù)后痛產(chǎn)生的致敏程度。與P 組相比，PN2 組在術(shù)后24 h 的機械痛閾更低，表明給予大劑量納洛酮可能加重術(shù)后急性切口疼痛（見圖1A）。

2. 鞘內(nèi)給予小劑量納洛酮可提高大鼠TWL，大劑量納洛酮可降低大鼠TWL

術(shù)前各組TWL 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與C 組相比，P 組術(shù)后1～72 h TWL 縮短 (P< 0.05)，表明術(shù)后痛模型建立后72 h 內(nèi)大鼠始終處于熱痛致敏狀態(tài)；N1 組TWL 術(shù)后1～6 h 延長 (P< 0.05)，表明單獨給予小劑量納洛酮即可產(chǎn)生針對熱輻射的鎮(zhèn)痛作用；與P 組相比，PN1 組術(shù)后1～6 h TWL延長 (P< 0.05)，表明在術(shù)后6 h 內(nèi)小劑量納洛酮具有鎮(zhèn)痛效果；與C 組相比，N2 組術(shù)后1～6 h TWL縮短，表明大劑量納洛酮可降低大鼠熱輻射痛閾值，產(chǎn)生痛敏，但N2 組TWL 始終顯著高于P 組，表明此作用遠(yuǎn)低于術(shù)后痛產(chǎn)生的致敏程度。與P 組相比，PN2 組在術(shù)后24 h 的熱輻射痛閾更低，表明大劑量納洛酮造成急性術(shù)后痛模型大鼠更強的痛敏狀態(tài)（見圖1B）。

圖1 大鼠各時點MWT 和TWL 比較 (n = 6,±SD)(A)各時點MWT；(B)各時點TWL*P<0.05, 與C組相比；#P <0.05,與P 組相比Fig. 1 Comparison of MWT and TWL at different time points in 6 groups of rats (n = 6,±SD)(A) MWT level at different time points; (B) TWL level at differenttimepoints*P<0.05,comparedwith group C, #P < 0.05, compared with group P.

3.術(shù)后痛模型鞘內(nèi)給予納洛酮對中樞海馬IFN-γ 表達(dá)無顯著影響

各組組內(nèi)、組間各時點海馬IFN-γ 表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖2），表明術(shù)后痛模型、鞘內(nèi)給予納洛酮對中樞海馬IFN-γ 表達(dá)無顯著影響。

圖2 大鼠各時點海馬INF-γ 比較 (n = 6,±SD)Fig. 2 Hippocampal INF-γ expression at different time points in 6 groups of rats (n = 6,±SD)

4.術(shù)后痛模型鞘內(nèi)給予納洛酮對血漿IFN-γ 產(chǎn)生影響

術(shù)前各組IFN-γ比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P> 0.05)。與C 組相比，P 組術(shù)后各時點血漿IFN-γ 表達(dá)下調(diào)，6 h 為下調(diào)程度最低點，72 h 為下調(diào)幅度最低點，提示術(shù)后痛模型可使大鼠72 h 內(nèi)血漿IFN-γ 表達(dá)下調(diào)，隨著時間的延長，IFN-γ 水平逐漸接近生理狀態(tài)。與C 組相比，N1 組在鞘內(nèi)給藥后6 h，血漿IFN-γ 水平升高，提示小劑量納洛酮注射后6 h 內(nèi)可促進(jìn)IFN-γ表達(dá)上調(diào)。與C 組相比，N2 組在鞘內(nèi)給藥后24 h 內(nèi)，血漿IFN-γ 表達(dá)下調(diào)，提示大劑量納洛酮在給藥后24 h 內(nèi)，可抑制IFN-γ 表達(dá)；與C 組相比，PN1 組術(shù)后72 h 內(nèi)各時點血漿IFN-γ 表達(dá)下調(diào)，但與P 組相比，PN1 組術(shù)后72 h 內(nèi)各時點血漿IFN-γ 表達(dá)上調(diào)，提示術(shù)后痛模型 + 小劑量納洛酮也可使IFN-γ水平降低，但下降幅度明顯低于術(shù)后痛模型組。與C 組相比，PN2 組術(shù)后72 h 內(nèi)各時點血漿IFN-γ 表達(dá)下調(diào)，但與P 組相比，PN2 組術(shù)后72 h 內(nèi)各時點血漿IFN-γ 表達(dá)也下調(diào)，提示術(shù)后痛模型+大劑量納洛酮顯著抑制IFN-γ 表達(dá)，下降幅度顯著高于術(shù)后痛模型組。以上結(jié)果表明，兩種劑量納洛酮都參與了生理狀態(tài)及術(shù)后痛模型大鼠IFN-γ水平的調(diào)節(jié)，但作用相反，鞘內(nèi)小劑量納洛酮可上調(diào)血漿IFN-γ水平，而大劑量納洛酮則產(chǎn)生相反結(jié)果（見圖3）。

圖3 大鼠各時點血漿IFN-γ 表達(dá)比較(n=6,±SD)*P<0.05，與C 組相比；#P<0.05，與P組相比Fig. 3 Plasma IFN-γ expression at different time points in 6 groupsof rats(n= 6,x±SD)*P <0.05, compared withgroupC; #P < 0.05, compared with group P.

討 論

有報道小劑量納洛酮及其類似物納曲酮[12]可興奮內(nèi)源性阿片生長因子，增加內(nèi)源性阿片釋放[13]，如腦啡肽等，增強阿片類藥物鎮(zhèn)痛作用[14,15]。本研究結(jié)果表明，鞘內(nèi)注射1 ng/kg 納洛酮可使切口痛大鼠術(shù)后6 h 內(nèi)MWT 升高、TWL 延長，產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛效果。小劑量納洛酮可能通過局部下調(diào)TNF-α、IL-1β 及IL-6 等促炎因子表達(dá)及上調(diào)抗炎標(biāo)志物IL-10 的表達(dá)抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與疼痛緩解[13]。本研究與既往報道不同的是，小劑量納洛酮不依賴外源性阿片類藥物，單獨應(yīng)用即可對術(shù)后痛大鼠產(chǎn)生顯著鎮(zhèn)痛效果。另外，本研究單純鞘內(nèi)注射小劑量納洛酮，與生理鹽水組相比也表現(xiàn)出了提升痛閾的積極作用，再次證實這一點。然而，單純鞘內(nèi)注射大劑量納洛酮后，顯著降低了術(shù)后1～6 h 大鼠疼痛閾值，而術(shù)后痛模型大鼠術(shù)前給予100 ng/kg 納洛酮后，大鼠出現(xiàn)持續(xù)大于24 h 的疼痛加劇，提示高劑量納洛酮給藥存在致痛敏作用，這與Brennum等和Corder 等[16,17]研究結(jié)論一致。有研究顯示高劑量納洛酮可通過抑制內(nèi)源性阿片系統(tǒng)，導(dǎo)致痛覺過敏的再次出現(xiàn)[17,18]。手術(shù)損傷后中樞敏化可被傷害性疼痛刺激所誘發(fā)的μ-opioid 受體固有活性物質(zhì)所掩蓋，可長達(dá)數(shù)月。但此時的中樞敏化仍然存在，由于MORCA的抑制而形成動態(tài)平衡，故稱為潛在高敏。術(shù)后晚期炎癥消退階段，給予高劑量μ 阿片受體拮抗劑（納洛酮/納曲酮）可通過抑制MORCA的內(nèi)源性鎮(zhèn)痛機制，導(dǎo)致傷害性刺激的潛在高敏復(fù)現(xiàn)，從而出現(xiàn)痛敏的臨床表現(xiàn)。潛在高敏的存在可能是慢性術(shù)后疼痛的激痛點，需引起重視[17]。本研究結(jié)果提示鞘內(nèi)高劑量納洛酮可引發(fā)術(shù)后疼痛加劇，而鞘內(nèi)小劑量納洛酮則可以緩解術(shù)后疼痛，提高痛閾。

本研究還探討了術(shù)后痛模型不同劑量納洛酮，對中樞海馬及外周血漿IFN-γ 表達(dá)水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后痛模型、鞘內(nèi)不同劑量納洛酮對中樞海馬的IFN-γ 水平均未產(chǎn)生顯著影響。其可能原因為CNS 具有完整的血腦屏障，可使CNS 免于外界環(huán)境損傷因素的傷害。CNS 內(nèi)完善的免疫抗炎機制，例如細(xì)胞水平T，B 調(diào)節(jié)細(xì)胞和M2 型少突膠質(zhì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[19～21]；以及分子水平IL-10和miR124 和基因水平等一系列調(diào)節(jié)機制，是維持CNS 免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素[22]。因此，本研究認(rèn)為在術(shù)后痛模型、鞘內(nèi)給予不同劑量納洛酮，海馬IFN-γ水平始終維持生理水平，可能受上述中樞免疫平衡機制的自主調(diào)節(jié)，但具體機制尚需進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，術(shù)后疼痛顯著抑制血漿IFN-γ表達(dá)，隨疼痛閾值降低而下降；術(shù)后72 h 疼痛自然緩解，痛閾提升，IFN-γ 水平回升。本研究證實，鞘內(nèi)納洛酮對血漿IFN-γ 可產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)，鞘內(nèi)小劑量納洛酮可改善術(shù)后痛大鼠的疼痛程度，明顯上調(diào)術(shù)后痛對IFN-γ 的抑制；單純鞘內(nèi)注射小劑量納洛酮與對照組比較也可提高痛閾并增加外周IFN-γ的表達(dá)，而后隨著痛閾回降IFN-γ 的表達(dá)也逐漸向生理值降低。有報道稱小劑量納曲酮可促進(jìn)NK 細(xì)胞分泌IFN-γ，增強免疫[13]，與本實驗鞘內(nèi)小劑量納洛酮的結(jié)果一致?？赡茉驗?，疼痛作為不愉快傷害性刺激感受會增加機體應(yīng)激引發(fā)免疫細(xì)胞的抑制，本課題組前期研究證實[23]術(shù)后痛引發(fā)疼痛閾值下降，外周血中NK 細(xì)胞數(shù)量也隨之下降，并且NK 細(xì)胞是IFN-γ 的重要細(xì)胞來源，這可能是本研究術(shù)后痛IFN-γ 表達(dá)下降的原因之一。有文獻(xiàn)報道術(shù)后合理鎮(zhèn)痛可加速NK 細(xì)胞活性恢復(fù)[24]，另外，腔鏡手術(shù)后小劑量納洛酮可增加術(shù)后NK 細(xì)胞水平和CD4+/CD8+T-cell ratio[25]。本研究術(shù)后痛大鼠通過給予鞘內(nèi)小劑量納洛酮很可能通過顯著改善疼痛，提升疼痛閾值，進(jìn)而降低疼痛介導(dǎo)的應(yīng)激負(fù)荷，改善NK 和T 細(xì)胞數(shù)量和活性發(fā)揮上調(diào)IFN-γ 表達(dá)和提高機體免疫的作用。其次，文獻(xiàn)證實小劑量阿片受體拮抗劑引發(fā)反射性CNS 內(nèi)源性阿片物質(zhì)增加（如β-內(nèi)啡肽[26]和腦啡肽[27]等），后者在CNS通過阿片受體介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)降低和外周免疫細(xì)胞功能增強。

然而，鞘內(nèi)大劑量納洛酮則使大鼠術(shù)后疼痛明顯加劇，痛閾下降，增強術(shù)后痛介導(dǎo)的IFN-γ 的表達(dá)抑制。單純鞘內(nèi)給予大劑量納洛酮也明顯下調(diào)生理狀態(tài)疼痛閾值和IFN-γ 表達(dá)。此結(jié)果與小劑量納洛酮在本實驗中的作用完全相反。有文獻(xiàn)支持大劑量靜脈應(yīng)用納曲酮（納洛酮類似物）可引發(fā)多方位的免疫抑制[21]，其中包括免疫因子的表達(dá)不足，支持本實驗結(jié)果。既往研究提示，疼痛作為強應(yīng)激因子是免疫抑制的獨立因素，CNS 內(nèi)源阿片系統(tǒng)在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮積極作用。結(jié)合本研究結(jié)果認(rèn)為，大劑量納洛酮加劇疼痛，降低疼痛閾值，進(jìn)而通過增加應(yīng)激負(fù)荷和CNS 內(nèi)阿片系統(tǒng)相關(guān)免疫調(diào)控機制[26,27]，抑制外周IFN-r 表達(dá)。

本研究的不足之處在于，血漿中IFN-γ 表達(dá)可來自體內(nèi)多種器官，但具體來源無法確定，血漿與全身各器官IFN-γ 表達(dá)的相互調(diào)控機制研究還需近一步研究證實。

綜上所述，從本研究結(jié)果綜合分析得出，鞘內(nèi)注射不同劑量納洛酮可影響術(shù)后痛大鼠血漿IFN-γ的表達(dá)，進(jìn)而參與機體免疫調(diào)節(jié)，而海馬IFN-γ 水平在上述干預(yù)條件下始終維持穩(wěn)定。疼痛閾值的調(diào)節(jié)涉及復(fù)雜的中樞痛覺整合和神經(jīng)調(diào)控機制，后續(xù)實驗可以增加中樞阿片系統(tǒng)作用部位（如海馬、下丘腦[26,27]等處）的內(nèi)源性阿片肽表達(dá)水平檢測，以及外周IFN-γ 產(chǎn)生細(xì)胞如NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞數(shù)量和功能狀態(tài)檢測等實驗內(nèi)容，進(jìn)一步探討不同劑量納洛酮對術(shù)后痛免疫狀態(tài)影響的機制。本研究通過檢測中樞海馬及外周血的IFN-γ 表達(dá)，從整體水平揭示術(shù)后痛和鞘內(nèi)納洛酮干預(yù)下中樞和外周免疫狀態(tài)的不同。外周IFN-γ 在術(shù)后痛和鞘內(nèi)納洛酮應(yīng)用后所表現(xiàn)出的變化規(guī)律提示，應(yīng)盡量避免應(yīng)用大劑量納洛酮鑒于其增加痛敏和抑制免疫的作用；而可以考慮應(yīng)用小劑量納洛酮作為術(shù)后鎮(zhèn)痛和提升外周免疫水平的輔助用藥，其臨床價值有待大樣本臨床研究證實。