不同護色處理對山藥多糖的結(jié)構(gòu)和免疫活性的影響

2021-11-29 11:24:12嚴(yán)靜曾麗萍李俊健黃達榮黎攀杜冰

食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年22期

嚴(yán)靜，曾麗萍，李俊健，黃達榮，黎攀,2，杜冰,2*

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東廣州，510642) 2(嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室，廣東廣州，510642)

山藥又稱為懷山藥、淮山、薯蕷等，為薯蕷科薯蕷屬植物，是傳統(tǒng)的藥食同源原料，因其有較好的藥用價值和可口的風(fēng)味而深受喜愛[1]。山藥富含多糖、氨基酸、淀粉、脂肪酸、多酚和皂苷等活性成分[2]，其中多糖為山藥最主要成分之一。山藥多糖具有降血糖、抗腫瘤、心肌細胞保護和抗氧化等多種生物活性，具有廣闊的應(yīng)用前景和商業(yè)價值[3-6]。

山藥中的含水量較高，難以長期保存，因此人們往往將其進行深加工或干制處理，以延長其保質(zhì)期[7-8]。但由于山藥中的多酚氧化酶和多酚類物質(zhì)的含量較高[9]，在加工過程中極易發(fā)生褐變。褐變不僅會影響山藥的外觀，還會使山藥的營養(yǎng)價值降低。目前對山藥褐變的護色措施較多采用的是含硫護色劑，亞硫酸鈉等含硫護色劑不僅可以抑制褐變，還具有一定的漂白抑菌效果。盡管采用含硫護色劑能取得較好的護色效果，但可能會使山藥中的殘硫量超標(biāo)，導(dǎo)致出現(xiàn)食品安全問題，影響人體健康[10]。故研究者也在嘗試采用無硫護色劑護色，如檸檬酸、D-異抗壞血酸、氯化鈣等，但相關(guān)研究表明三者復(fù)配時護色效果較好，單一使用時護色效果較差[11]。本課題組將產(chǎn)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液和亞硫酸鈉溶液作為護色劑對山藥進行護色處理，比較二者護色能力和對山藥粗多糖免疫活性的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液護色(fermentation color-protection，CYF)不僅能有效抑制山藥中過氧化物酶(peroxidase，POD)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)的活性，且抑制能力強于亞硫酸鈉護色(sodium nitrite color-protection，CYN)，發(fā)酵液護色還能提高山藥多糖的免疫活性，說明產(chǎn)乳酸芽孢桿菌護色液是一種有效的非硫護色方法，有一定的應(yīng)用價值[12]。

不同的加工或提取方式均會使多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響多糖的活性[13]，研究者較多研究不同提取工藝對山藥多糖活性的影響[14]。而護色作為山藥加工中的重要環(huán)節(jié)，不同護色處理對山藥多糖結(jié)構(gòu)和免疫活性的影響卻鮮見報道。在之前的研究基礎(chǔ)上，對山藥粗多糖進行分離純化得到3個組分：清水組分、0.1 mol/L NaCl組分、0.3 mol/L NaCl組分，采用CYF、CYN等不同處理方式，進一步探究不同護色處理的同一組分和同一護色處理的不同組分的山藥多糖的結(jié)構(gòu)特性和免疫活性，為山藥的新型護色工藝進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)三角市；乳酸芽孢桿菌(Bacillussp.)DU-106，篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪，現(xiàn)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源食品及功能性原料評價及研究中心鑒定及保藏，并委托廣州市微生物所制成1×1012CFU/g 的菌粉，作為發(fā)酵實驗使用；RAW264.7細胞，中大細胞庫。

間羥基聯(lián)苯，廣州化學(xué)試劑廠；葡萄糖醛酸，廣東光華化學(xué)廠有限公司；牛血清蛋白，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品，廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司；胎牛血清，法國Biowest公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，Gibco公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，齊云生物試劑有限公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；細胞因子試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SH型CO2細胞培養(yǎng)箱，上海善志儀器設(shè)備有限公司；LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；GC6890型氣相色譜-質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇友聯(lián)儀器研究所；Laborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國 Heidolph 公司；DGG-9070B型鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；UV759型紫外分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；ANKE TDL-5-A型離心機，上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司；Labserv K3型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵護色液的制備

乳酸芽孢桿菌發(fā)酵護色液：分別稱取乳清粉20 g、硫酸鎂1 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸錳0.5 g和葡萄糖10 g溶解于一定量的水中，加水定容至1 L，分裝滅菌，得發(fā)酵培養(yǎng)基。將乳酸芽孢桿菌粉接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為0.1%，置于180 r/min，37 ℃的搖床中發(fā)酵，采用0.22 μm濾膜過濾，得乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液，將所得的乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液按照一定比例加水混合均勻，得乳酸芽孢桿菌發(fā)酵護色液[12]。

亞硫酸鈉對照組護色液：配制0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的亞硫酸鈉溶液。

清水護色(water color-protection, CYH)液：對照組，采用等量一級水。

1.3.2 不同護色處理山藥的粗多糖提取

挑選無病蟲斑的山藥塊莖，用清水沖洗，切成薄片，分別用不同護色液護色后，置于烘箱烘干，得干山藥片。將干山藥片粉碎后過20目篩，按料液比1∶60(g ∶mL)，沸水浸提2 h 2次，抽濾，用3倍體積的95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇沉淀，4 ℃靜置過夜，沉淀物用少量75%乙醇沖洗2遍后，3 000 r/min離心10 min，得到的沉淀用少量水溶解。按4∶1的體積比加入Sevage試劑去蛋白，采用2 000 Da透析袋在4 ℃ 下用一級水透析，每12 h換1次水。透析后的多糖溶液真空冷凍干燥48 h，得到粗多糖樣品。其中，清水浸泡處理的山藥所得到的粗多糖命名為清水山藥粗多糖(CYH)；同理，亞硫酸鈉溶液護色處理的山藥所得到的粗多糖為亞硫酸鈉山藥粗多糖(CYN)，發(fā)酵護色液處理的山藥所得到的粗多糖為發(fā)酵液山藥粗多糖(CYF)。

1.3.3 不同護色處理山藥的粗多糖純化

3種山藥粗多糖(CYH、CYN、CYF)經(jīng)過陰離子交換柱DEAE-Sepharose Fast Flow，在不同濃度NaCl洗脫液下進行分離純化。分別采用清水洗脫、0.1 mol/L NaCl溶液洗脫、0.3 mol/L NaCl溶液洗脫下得到了3個組分：清水組分、0.1 mol /L NaCl組分、0.3 mol/L NaCl組分，分別命名為CYHA-1、CYNA-1、CYFA-1；CYHA-2、CYNA-2、CYFA-2；CYHA-3、CYNA-3、CYFA-3，重復(fù)收集后將其凍干。9種不同的山藥多糖(CYHA-1、CYHA-2、CYHA-3、CYNA-1、CYNA-2、CYNA-3、CYFA-1、CYFA-2、CYFA-3)經(jīng)過葡聚糖凝膠柱純化后，分別命名為CYH-1、CYH-2、CYH-3、CYN-1、CYN-2、CYN-3、CYF-1、CYF-2、CYF-3。

1.3.4 山藥多糖的結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.4.1 山藥多糖分子質(zhì)量測定

采用高效凝膠滲透色譜法測定山藥多糖的分子質(zhì)量。測定條件為：流動相為磷酸緩沖液；進樣量20 μL；流速為0.5 mL/min；洗脫時間80 min；色譜柱：TSK-GelG5000PWXL與G3000PWXL串聯(lián)使用。選用標(biāo)準(zhǔn)品的重均分子質(zhì)量分別為：1 000、5 000、25 000、 150 000、270 000 Da，根據(jù)分子質(zhì)量和色譜圖保留時間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以保留時間為橫坐標(biāo)，以相對分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-0.281 2x+8.503 8，R2=0.978 9。根據(jù)線性回歸方程計算山藥多糖的分子質(zhì)量。

1.3.4.2 山藥多糖的單糖組成

參考黃曉蘭等[15]的方法并稍作修改。將山藥多糖水解并乙?；笥?GC-MS分析其單糖組成，將核糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖等單糖對照品同時乙?；M行對照。

程序升溫條件為：180 ℃保留1 min，20 ℃/min升溫至280 ℃保留10 min，40 ℃/min升溫至300 ℃保留10 min。載氣(氮氣/空氣)，柱流速1.8 mL/min，壓力150 kPa；色譜柱：Agilent HP-5MS。

1.3.4.3 山藥多糖的紅外光譜分析

稱量9種山藥多糖樣品各5 mg，分別與200 mg溴化鉀在干燥環(huán)境下充分混合研磨，模具中壓片，在4 000～400 cm-1進行紅外光譜掃描，對所得的紅外圖譜進行分析。

1.3.4.4 山藥多糖的糖醛酸含量

采用硫酸-間羥基聯(lián)苯法[16]測定糖醛酸含量，葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.021 6x+0.021 4，R2=0.999 3。

1.3.4.5 山藥多糖的剛果紅實驗

多糖樣品溶液與剛果紅溶液混合后，加入不同濃度的NaOH溶液，濃度梯度從0～0.5 mol/L，混合體系在室溫下反應(yīng)25 min后，采用紫外分光光度計在400～600 nm波長內(nèi)進行掃描[17]。

1.3.5 山藥多糖的免疫調(diào)節(jié)活性研究

1.3.5.1 RAW264.7細胞的培養(yǎng)

RAW264.7細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

1.3.5.2 CCK-8法檢測細胞增殖活性

參照CHEN等[18]的方法，略有更改。采用CCK-8法檢測細胞增殖活性，將RAW264.7細胞以密度1.0×105個/mL 在96孔板中每孔加入100 μL的細胞懸浮液，將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。然后按不同組別加入100 μL梯度質(zhì)量濃度(1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL)的山藥多糖培養(yǎng)液孵育24 h。孵育24 h后，在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，搖動4 h。在450 nm處測定吸光度，計算RAW264.7細胞增殖率。

實驗分為試驗組、空白對照組和LPS對照組，試驗組為在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度梯度(1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL)的山藥多糖；空白對照組為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；LPS對照組為LPS濃度為1 μg/mL，采用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基溶解。

細胞增殖率按式(1)計算：

(1)

式中：OD實驗組為實驗組在450 nm下的OD值；OD空白對照組為空白對照組在450 nm下的OD值。

1.3.5.3 不同護色處理的山藥多糖對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響

根據(jù)制造商的說明使用ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)基中腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)、細胞白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、細胞白介素-6(interleukin-6, IL-6)的含量。

1.3.5.4 不同護色處理的山藥多糖對RAW264.7細胞釋放NO的影響

根據(jù)制造商的說明采用NO檢測試劑盒測定細胞上清液中NO的水平，試劑盒采用的是Griess法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel2016、Origin9.1、DPS 7.0和GrapPad Primsm8等統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析并作圖。與空白對照組對比顯著用*表示，P<0.05，極顯著用**表示，P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同護色處理對山藥多糖的結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 不同護色處理對山藥多糖的分子質(zhì)量的影響

分子質(zhì)量的測定是分析多糖特點和結(jié)構(gòu)的重要手段，多糖的分子質(zhì)量大小與其性質(zhì)如溶解度、黏性有關(guān)，同時也與其生物活性密切相關(guān)[19]。不同護色處理的山藥多糖的分子質(zhì)量如表1所示。由表1可知，9種山藥多糖的分布寬均較小，即分布寬度較窄，說明多糖的分子質(zhì)量均一性較好，由此也說明多糖的純度較高。同一護色處理的山藥所制備的3種不同組分的多糖(如CYF-1、CYF-2、CYF-3)中，清水組分CYF-1的分子質(zhì)量最小，而0.3 mol/L NaCl洗脫所得的組分(CYF-3)的分子質(zhì)量最大。說明在同一護色處理的山藥中，隨著洗脫液濃度的增大，其洗脫下來的組分的分子質(zhì)量也隨之增大。

表1 不同護色處理的山藥多糖的分子質(zhì)量

不同護色處理的山藥在同一濃度的洗脫液洗脫下的多糖組分中(如CYN-1、CYN-1、CYF-1)，經(jīng)過乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液護色和亞硫酸鈉護色處理的山藥多糖的分子質(zhì)量較為接近，但與清水護色處理的山藥多糖的分子質(zhì)量差異較大。而且不同護色處理對山藥多糖分子質(zhì)量的影響在不同組分中影響不同，0.3 mol/L NaCl組分(CYH-3、CYN-3、CYF-3)的山藥多糖經(jīng)不同護色處理分子質(zhì)量差異最大。由此表明，不同護色處理會使得山藥多糖的分子質(zhì)量發(fā)生改變。

2.1.2 不同護色處理對山藥多糖的單糖組成的影響

不同護色處理的山藥多糖的單糖組成如表2所示。由表2可知，山藥多糖主要由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、核糖組成。

表2 不同護色處理的山藥多糖的單糖組成

CYH-1、CYN-1、CYF-1中葡萄糖的含量最高，其次是甘露糖，而鼠李糖、核糖、木糖和阿拉伯糖的含量均較低，不足2%，CYH-1、CYN-1、CYF-1的單糖組成沒有明顯差異。山藥多糖中的葡萄糖含量較高，可能是由于山藥中的淀粉含量高[20]。在CYH-2、CYF-2中，葡萄糖的含量最高，其次半乳糖；而在CYN-2中，葡萄糖的含量最高，其次是甘露糖，說明CYH-2、CYN-2、CYF-2的單糖組成存在差異。而在CYH-3、CYN-3、CYF-3中，不同護色處理對山藥多糖的單糖組成影響更加顯著。CYH-3中，半乳糖含量最高，其次是鼠李糖，甘露糖含量最低；CYN-3中，半乳糖含量最高，其次是阿拉伯糖，木糖含量最低；CYF-3中，半乳糖含量最高，其次是葡萄糖，核糖含量最低。由上可得，不同護色處理會使山藥多糖的單糖組成發(fā)生改變，且不同護色處理對于山藥多糖的單糖組成的影響在個別組分中影響明顯，特別是0.3 mol/L NaCl組分。

2.1.3 不同護色處理對山藥多糖的剛果紅實驗結(jié)果的影響

多糖的生物活性不僅與其分子質(zhì)量和單糖組成有關(guān)，還與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。研究表明多糖的抗腫瘤活性不僅與多糖的一級結(jié)構(gòu)有關(guān)，更與高級結(jié)構(gòu)有關(guān)[21]，在多糖的空間結(jié)構(gòu)中，剛果紅可以與具有3股螺旋結(jié)構(gòu)的多糖進行絡(luò)合，形成絡(luò)合物的最大吸收波長與剛果紅溶液的最大吸收波長相比將會發(fā)生紅移，并且隨著NaOH濃度的增加，其最大吸收波長會先增大后減小[22-23]。不同護色處理的山藥多糖與剛果紅混合后，混合溶液的最大吸收波長隨NaOH濃度的變化曲線如圖1所示。

圖1 不同護色處理的山藥多糖的剛果紅實驗結(jié)果

由圖1可知，剛果紅溶液的最大吸收波長為495 nm，而在不同護色處理的山藥多糖中，CYH-3、CYN-3、CYF-3與剛果紅的混合溶液的最大吸收波長分別為503、502、504 nm，高于剛果紅溶液的最大吸收波長，說明CYH-3、CYN-3、CYF-3具有3股螺旋結(jié)構(gòu)。隨著NaOH的濃度升高，混合溶液的最大吸收波長逐漸降低，表明3股螺旋結(jié)構(gòu)遭到了破壞。其他山藥多糖如CYH-1、CYH-2、CYF-1、CYF-2、CYN-1、CYN-2與剛果紅混合溶液的最大吸收波長與剛果紅溶液的最大吸收波長相似，表明CYH-1、CYH-2、CYF-1、CYF-2、CYN-1、CYN-2不具有3股螺旋結(jié)構(gòu)[24-25]。

2.1.4 不同護色處理對山藥多糖的紅外圖譜的影響

紅外光譜是分析多糖結(jié)構(gòu)有利的工具，可根據(jù)多糖的特征吸收峰鑒定多糖的結(jié)構(gòu)。不同護色處理山藥多糖的紅外圖譜如圖2所示。3 600～3 200 cm-1處強而寬的吸收峰是O—H的伸縮振動；1 400～1 200 cm-1處是C—H的變角振動，與2 930 cm-1處的C—H的伸縮振動構(gòu)成了糖環(huán)的特征吸收，以上這些特征吸收峰是多糖類物質(zhì)的一般特征，說明該物質(zhì)為糖類物質(zhì)。9種山藥多糖在這些位置均有強吸收峰，說明9種山藥多糖符合糖類物質(zhì)的一般特征[26]。

A-清水對照組；B-亞硫酸鈉對照組；C-發(fā)酵護色組

在CYH-2、CYN-2、CYF-2中，CYH-2在1 736 cm-1處的吸收峰為酯羰基伸縮振動，含糖醛酸的多糖樣品在1 750～1 700 cm-1內(nèi)會產(chǎn)生吸收，說明CYH-2含有糖醛酸。若多糖中糖醛酸殘基含量較低，糖醛酸的特征吸收峰有可能被掩蓋，在紅外圖譜中難以發(fā)現(xiàn)其特征峰，所以仍需采用其他方法探究糖醛酸的存在[27]。CYF-2在853 cm-1處存在特征吸收峰，說明其含有α-型糖苷鍵。CYH-2在1 200～1 000 cm-1出現(xiàn)2個吸收峰，說明其單糖組成中可能含有呋喃糖；而CYF-2、CYN-2在此區(qū)間出現(xiàn)3個吸收峰，則表明其單糖組成中可能含有吡喃糖。在CYH-3、CYN-3、CYF-3中，CYN-3在1 145 cm-1處特征吸收峰分別為羧酸基的對稱伸縮振動引起[28]；CYF-3和CYH-3在890 cm-1附近具有強吸收峰，表明其含有β-型糖苷鍵。由紅外譜圖得，不同護色處理的山藥多糖的結(jié)構(gòu)有一定的差異。

2.1.5 不同護色處理對山藥多糖糖醛酸含量的影響

9種山藥多糖的糖醛酸含量如圖3所示。研究表明糖醛酸具有清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基的作用，故糖醛酸含量的高低可能會影響多糖的生物活性[29]。由圖3可知，由同一護色處理的山藥中分離純化得到的不同組分多糖(如CYF-1、CYF-2、CYF-3)可知，0.3 mol/L NaCl洗脫液洗脫得到的組分多糖的糖醛酸含量最高，而清水組分多糖的糖醛酸含量最低。

圖3 不同護色處理的山藥多糖的糖醛酸含量

而對比不同護色處理的同一組分多糖的糖醛酸含量也具有差異。其中，在0.3 mol/L NaCl的洗脫液洗脫下得到的組分多糖的糖醛酸含量差異最大，發(fā)酵液護色組和亞硫酸鈉護色組的糖醛酸含量顯著高于清水護色組，與HUANG等[30]和張志紅[31]的研究結(jié)果一致。說明不同護色處理對山藥多糖的糖醛酸含量有一定影響。

2.2 不同護色處理對山藥多糖的免疫活性的影響

2.2.1 不同護色處理對山藥多糖刺激細胞增殖的影響

不同護色處理山藥多糖對細胞增殖率的影響如圖4所示。由圖4可知，隨著山藥多糖質(zhì)量濃度的增加(15.625～1 000 μg/mL)，對RAW264.7細胞沒有顯示出明顯的毒性。故將山藥多糖的質(zhì)量濃度選定在15.625～1 000 μg/mL，用于后續(xù)研究。