• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    代謝工程改造大腸桿菌增產(chǎn)酪醇

    2021-12-03 03:09:14曾嬌嬌余世琴周景文
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年22期
    關(guān)鍵詞:脫氫酶過量質(zhì)粒

    曾嬌嬌,余世琴,周景文*

    1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122) 2(未來食品科學(xué)中心(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

    酪醇[2-(4-羥基苯基)乙醇,tyrosol]是一種天然的多酚類物質(zhì),廣泛存在于紅景天、女貞、橄欖等植物中,具有抗氧化、消炎等多種藥理活性[1]。目前酪醇的合成主要有植物提取、化學(xué)合成及微生物代謝生產(chǎn)3種途徑。由于植物提取率低、化學(xué)合成反應(yīng)復(fù)雜等問題的存在,微生物細(xì)胞工廠的優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯。在微生物代謝中,酪醇是酪氨酸代謝途徑的下游產(chǎn)物,是橄欖苦苷、羥基酪醇、紅景天苷等重要天然產(chǎn)物的關(guān)鍵前體。微生物中酪醇的合成途徑主要有3種:(1) SATOH等[2]在大腸桿菌中表達(dá)植物罌粟(Papaversomniferum)來源的酪氨酸脫羧酶(tyrosine decarboxylase,TDC)和藤黃微球菌(Micrococcusluteus)來源的酪胺氧化酶(tyramine oxidase,TYO),并結(jié)合大腸桿菌內(nèi)源的乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH),實(shí)現(xiàn)了酪醇的從頭合成,產(chǎn)量達(dá)到69 mg/L;(2) YANG等[3]在大腸桿菌中過量表達(dá)來源于釀酒酵母的苯丙酮酸脫羧酶(phenylpyruvate decarboxylase,ARO10),得到了800.40 mg/L 酪醇;(3) CHUNG等[4]對(duì)擬南芥(Arabidopsisthaliana)、矮牽牛(Petuniahybrid)和荷蘭芹(Petroselinumcrispum)3種來源的芳香醛合成酶(aromatic aldehyde synthase,AAS)進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)表達(dá)PcAAS菌株的產(chǎn)量最高,達(dá)12.9 mg/L。在這3條途徑中,僅AAS可以將酪氨酸一步轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)酪醇所需的直接前體物質(zhì)。因此,本研究將從此途徑入手開展酪醇的生物合成研究。

    ZHOU等[5-6]在大腸桿菌基因組中挖掘得到一系列梯度強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子,并用于強(qiáng)化己二酸的生產(chǎn)。為了提升酪醇的產(chǎn)量,本研究以E.coliBL21 (DE3)為出發(fā)菌株,使用組成型啟動(dòng)子PcspA[5]取代PT7啟動(dòng)子,并運(yùn)用該質(zhì)粒過量表達(dá)PcAAS來構(gòu)建酪醇合成的生物途徑。將調(diào)控分支代謝途徑基因敲除阻斷競爭途徑和過量表達(dá)乙醇脫氫酶來強(qiáng)化代謝流的方法結(jié)合起來,通過使用高、中、低3種不同強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子對(duì)途徑中的關(guān)鍵酶AAS和ADH進(jìn)行組合調(diào)控,實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌合成酪醇的代謝途徑優(yōu)化。研究結(jié)果為后續(xù)采用發(fā)酵法生產(chǎn)酪醇和相關(guān)的下游產(chǎn)物奠定了良好的基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株及質(zhì)粒

    本研究使用及構(gòu)建的菌株和質(zhì)粒分別見表1和表2。

    表1 本研究使用的菌株

    表2 本研究使用的質(zhì)粒

    1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

    種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母粉5.0,NaCl 10.0。

    發(fā)酵培養(yǎng)基F1(g/L):葡萄糖 25.0,甘油 10.0,(NH4)2SO47.5,K2HPO4·3H2O 3.0,KH2PO42.0,MgSO4·7H2O 1.0,檸檬酸鈉 1.0,維生素B10.1,酵母粉 7.0,微量元素營養(yǎng)液1 mL/L,依據(jù)需求加入適量的抗生素。

    微量元素營養(yǎng)液(g/L):Al2(SO4)3·18H2O 2.0,CoSO4·7H2O 0.75,CuSO4·5H2O 2.5,H3BO30.5,MnSO4·H2O 24.0,NiSO4·6H2O 2.5,ZnSO4·7H2O 15.0。

    酵母粉,Oxoid公司;胰蛋白胨及所有使用的抗生素粉末,上海生工有限公司;酪醇標(biāo)準(zhǔn)品,阿拉丁;其余試劑購自國藥集團(tuán)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 基因組編輯方法

    基因組編輯方法參考JIANG等[9]的研究。敲除feaB基因(phenylacetaldehyde dehydrogenase gene)所用的sgRNA序列為5′-CGATCTTTGATCCGGCCACC-3′,其PAM序列為GGG,所用相關(guān)引物如表3所示。

    表3 基因敲除使用的引物

    1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法

    質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)引物如表4所示。質(zhì)粒構(gòu)建采用Gibson組裝的方法進(jìn)行。首先通過簡單PCR獲得目的片段,對(duì)得到的PCR產(chǎn)物純化后使用Gibson組裝酶進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)化E.coliJM109,次日挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR并將得到的陽性克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序。

    表4 質(zhì)粒構(gòu)建使用的引物

    1.2.3 搖瓶發(fā)酵方法

    在LB平板上劃線分離得到單菌落,將其接種于LB培養(yǎng)基中并加入適量抗生素,在37 ℃,220 r/min的搖床中過夜培養(yǎng)(10~14 h)。以3%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基F1中,將裝有20 mL培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶置于30 ℃,220 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng),適時(shí)取樣。

    1.2.4 樣品處理及HPLC檢測(cè)方法

    由于酪氨酸微溶于水,利用酪氨酸的官能團(tuán)—NH2和H+可進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)這一特性,用2 mol/L的HCl將發(fā)酵液樣品按體積比2∶1稀釋,以確保酪氨酸完全溶解。用去離子水將發(fā)酵液樣品進(jìn)一步稀釋,使最終產(chǎn)物濃度適宜分析方法的檢測(cè)范圍。稀釋完成后,12 000 r/min離心10 min。收集上清液并過濾處理得到用于HPLC測(cè)定的樣品。

    HPLC測(cè)定的色譜柱為C18柱ODS-2 Hypersil(250 mm×4.6 mm,5 μm),紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長為280 nm,A相為含有0.1%的三氟乙酸的去離子水,B相為含有0.1%三氟乙酸的乙腈,使用1.0 mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,柱溫40 ℃, 進(jìn)樣量10 μL。酪氨酸和酪醇的出峰時(shí)間分別約為10.0、12.5 min。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酪醇合成途徑的構(gòu)建

    本研究采用的代謝調(diào)控策略如圖1所示,選擇E.coliBL21 (DE3)作為出發(fā)菌株,利用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRSFCP-P(攜帶有芳香醛合成酶PcAAS的基因)導(dǎo)入其中,得到菌株BL2101,以轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pRSFDuet-1的菌株作為對(duì)照菌株(菌株BLCK)。結(jié)果表明,24 h時(shí)菌株BL2101發(fā)酵液中有酪醇產(chǎn)生,但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,產(chǎn)量并未有明顯增加,菌株BL2101的最終產(chǎn)量為105.97 mg/L。液相-質(zhì)譜分析結(jié)果表明該產(chǎn)物為酪醇(圖2)。

    圖1 本研究相關(guān)代謝工程策略示意圖

    A-發(fā)酵24 h樣品及分析標(biāo)準(zhǔn)品液相檢測(cè)圖;B-從頭合成發(fā)酵產(chǎn)生的酪醇產(chǎn)量;C-發(fā)酵樣品質(zhì)譜圖

    2.2 分支代謝途徑的阻遏

    酪醇合成依賴的莽草酸途徑是苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸以及相關(guān)衍生物合成的重要代謝途徑。下調(diào)支路表達(dá)可以有效增強(qiáng)流向產(chǎn)物的代謝流。首先,在缺失反饋抑制基因(transcriptional regulatory protein gene,tyrR)的菌株BER中轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pRSFCP-P獲得重組菌株BER01,酪醇產(chǎn)量為60.97 mg/L。在菌株BER的基礎(chǔ)上,繼續(xù)敲除在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程中會(huì)使磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸岬幕騪tsG和crr(均為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程相關(guān)基因),并通過質(zhì)粒過量表達(dá)PcAAS獲得的菌株BETR01,酪醇產(chǎn)量為76.24 mg/L。在此基礎(chǔ)上,敲除苯丙氨酸競爭途徑的基因pheA(prephenate dehydratase gene)以及會(huì)使磷酸烯醇式丙酮酸流向丙酮酸的基因pykF(pyruvate kinase),并表達(dá)重組質(zhì)粒pRSFCP-P獲得菌株BE01,其酪醇產(chǎn)量達(dá)131.22 mg/L,相比其他2株重組菌株,酪醇產(chǎn)量分別提升了115.22%及72.11%。另外,通過敲除會(huì)使代謝流流向副產(chǎn)物對(duì)羥基苯乙酸的基因feaB,并在該菌株中過量表達(dá)PcAAS獲得菌株BEKOF01,酪醇產(chǎn)量達(dá)到1 055.36 mg/L(圖3)。相比菌株BE01,酪醇產(chǎn)量提升了704.2%;相比在E.coliBL21 (DE3)中過量表達(dá)PcAAS,酪醇產(chǎn)量提升了896.23%。

    A-feaB敲除電泳圖;B-基因缺失對(duì)酪醇產(chǎn)量的影響

    2.3 乙醇脫氫酶的篩選

    對(duì)羥基苯乙醛的還原反應(yīng)是酪醇合成代謝途徑的最后一步,對(duì)酪醇生產(chǎn)具有重要影響。本研究利用大腸桿菌內(nèi)源的乙醇脫氫酶實(shí)現(xiàn)該步反應(yīng),酪醇產(chǎn)量達(dá)到1 055.36 mg/L。為了深入研究乙醇脫氫酶活性對(duì)酪醇積累的影響,本研究考察了4種來源于大腸桿菌的乙醇脫氫酶(AdhE[10]、AdhP[11]、YahK[12]及FrmA[13])及1種來源于釀酒酵母的乙醇脫氫酶(Adh6)[14-15](圖4)。結(jié)果表明,過量表達(dá)大腸桿菌來源的乙醇脫氫酶效果不佳;過量表達(dá)FrmA僅獲得516.92 mg/L的酪醇;過量表達(dá)YahK僅產(chǎn)生了96.33 mg/L的酪醇;過量表達(dá)AdhE的菌株發(fā)酵液及過量表達(dá)AdhP的菌株發(fā)酵液并未檢測(cè)到酪醇;過量表達(dá)釀酒酵母來源的Adh6效果顯著(菌株BEKOF02),酪醇產(chǎn)量達(dá)1 516.86 mg/L。 相比于未表達(dá)Adh6的菌株(菌株BEKOF01),酪醇產(chǎn)量提升了43.73%。

    A-乙醇脫氫酶篩選;B-酪醇產(chǎn)量

    2.4 關(guān)鍵酶PcAAS和ScADH6的組合調(diào)控

    酶表達(dá)量的調(diào)節(jié)是代謝工程改造過程中的重要方法。在本研究中,通過調(diào)整質(zhì)粒拷貝數(shù)的方法,嘗試平衡酪醇生產(chǎn)的代謝流。質(zhì)粒pRSFDuet-1、pETDuet-1、pACYCDuet-1和pCDFDuet-1含有的復(fù)制子分別是RSF、pBR322、p15A和CDF,其拷貝數(shù)分別為100、40、20和10[16]。由于本研究已使用pRSFDuet-1作為載體,因此將PcAAS及ScADH6的表達(dá)框克隆至其余3個(gè)質(zhì)粒中,獲得菌株BEKOF-pET、BEKOF-pACYC及BEKOF-pCDF。3株菌株產(chǎn)量均低于50.00 mg/L (圖5、表5)。

    因此,為了進(jìn)一步優(yōu)化代謝流,選擇具有不同表達(dá)強(qiáng)度的啟動(dòng)子PyjeFE(低強(qiáng)度)、PcspA(中強(qiáng)度)、Pinfc-rplT(高強(qiáng)度)[5]分別用于調(diào)節(jié)PcAAS及ScADH6的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果表明,A2B1(使用啟動(dòng)子PcspA表達(dá)PcAAS,啟動(dòng)子PyjeFE表達(dá)ADH6)的組合產(chǎn)量較BEKOF02(使用啟動(dòng)子PcspA表達(dá)PcAAS,啟動(dòng)子PcspA表達(dá)ADH6)產(chǎn)量提升了293.60 mg/L,酪醇產(chǎn)量達(dá)到1 810.46 mg/L(圖5、表5)。

    表5 復(fù)制子或啟動(dòng)子對(duì)酪醇產(chǎn)量的影響

    A-酪醇產(chǎn)量;B-復(fù)制子篩選;C-啟動(dòng)子組合表達(dá)篩選

    2.5 最佳菌株BEKOF-A2B1的發(fā)酵優(yōu)化

    葡萄糖和甘油是大腸桿菌培養(yǎng)過程中常用的碳源,在細(xì)胞生長過程中發(fā)揮著重要作用。此外,葡萄糖和甘油也是細(xì)胞糖酵解途徑的底物,其含量的高低直接決定了代謝所產(chǎn)生的產(chǎn)物含量。本研究中的出發(fā)培養(yǎng)基中含有葡萄糖25 g/L及甘油10 g/L,以此為基礎(chǔ),進(jìn)行了葡萄糖和甘油濃度的調(diào)整。圖6表明了不同配比下發(fā)酵60 h時(shí)酪醇的產(chǎn)量、菌體OD600以及發(fā)酵液pH。25 g/L葡萄糖和20 g/L甘油的組合具有優(yōu)勢(shì)(圖6-A),但發(fā)酵液pH較低,導(dǎo)致大腸桿菌難以進(jìn)行正常的代謝活動(dòng)。因此,通過提高培養(yǎng)基中氮源濃度的方法或外源添加來調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH,結(jié)果表明外源添加5 g/L碳酸鈣效果最佳,酪醇產(chǎn)量達(dá)到2 120.58 mg/L。

    A-碳源濃度優(yōu)化;B-氮源濃度優(yōu)化及CaCO3濃度優(yōu)化

    3 討論

    酪醇因具有顯著的抗氧化、抗腫瘤等功能藥效成為近年來的研究熱點(diǎn)[17]。釀酒酵母由于具有完整的Ehrlich途徑,成為研究者們較為青睞的表達(dá)宿主。但是,由于較長的發(fā)酵周期使得釀酒酵母作為生產(chǎn)菌株具有了一定的局限性,如LIU等[18]改造的對(duì)香豆酸生產(chǎn)菌株1個(gè)發(fā)酵周期需要96 h,GUO等[19]改造獲得的具有酪醇生產(chǎn)能力的釀酒酵母的發(fā)酵周期為196 h。大腸桿菌因發(fā)酵周期較短且易于基因工程改造等優(yōu)點(diǎn)成為了另一種選擇。研究表明,在宿主細(xì)胞中表達(dá)來源荷蘭芹的芳香醛合成酶可以構(gòu)建酪醇生物合成途徑[4,19-20]。本研究將經(jīng)密碼子優(yōu)化的PcAAS在E.coliBL21 (DE3)中過量表達(dá),酪醇產(chǎn)量達(dá)到105.97 mg/L。此外,在缺失了不同分支代謝途徑調(diào)控基因的菌株中過量表達(dá)PcAAS,以及敲除對(duì)酪醇積累具有顯著抑制作用的feaB基因,酪醇積累量達(dá)到1 055.36 mg/L,而未缺失feaB基因的菌株產(chǎn)量僅為131.22 mg/L,研究結(jié)果與此前的報(bào)道類似[3, 13, 21]。

    在多數(shù)研究中,醛基到羥基的還原反應(yīng)依賴于大腸桿菌中天然存在的醇脫氫酶[4, 13]。過量表達(dá)乙醇脫氫酶可以強(qiáng)化酪醇合成途徑的代謝流。GUO等[20]在釀酒酵母中表達(dá)來自大腸桿菌的乙醇脫氫酶,提高了酪醇的產(chǎn)量。本研究過量表達(dá)ScADH6使得酪醇的產(chǎn)量由1 055.36 mg/L提高至1 516.86 mg/L。另外,LIU等[18]通過同時(shí)優(yōu)化生物合成途徑中關(guān)鍵酶的啟動(dòng)子,顯著提高了對(duì)香豆酸的產(chǎn)量。在本研究使用中等強(qiáng)度啟動(dòng)子啟動(dòng)PcAAS與低強(qiáng)度啟動(dòng)子啟動(dòng)ScADH6的組合表現(xiàn)出較大潛力,酪醇產(chǎn)量達(dá)1 810.46 mg/L。 在此基礎(chǔ)上,通過優(yōu)化碳氮源初始濃度以及加入CaCO3改善發(fā)酵過程pH穩(wěn)定性,酪醇產(chǎn)量提高至2120.58 mg/L。在搖瓶發(fā)酵水平上,較XU等[13]研究中大腸桿菌YMG5A*R的產(chǎn)量1 506.96 mg/L及LIU等[22]研究中釀酒酵母LYTY16的產(chǎn)量702.30 mg/L,酪醇分別提升了40.72%和201.95%。但是,在發(fā)酵罐水平上,對(duì)比XU等[13]研究中的3.90 g/L和LIU等[22]研究中的9.90 g/L,仍存在一定差距。因此,在后續(xù)研究中,可以結(jié)合對(duì)前體供給途徑的系統(tǒng)改造和發(fā)酵過程優(yōu)化,使其成為羥基酪醇等高價(jià)值化合物合成的良好平臺(tái)菌株。

    猜你喜歡
    脫氫酶過量質(zhì)粒
    過量食水果會(huì)加速衰老
    中老年保健(2021年7期)2021-08-22 07:43:44
    B3M4 Sandstorms in Asia Teaching Plan
    請(qǐng)勿過量飲酒
    人11β-羥基類固醇脫氫酶基因克隆與表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究
    吃糖過量也會(huì)“醉”?
    遵義(2018年15期)2018-08-28 12:20:14
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    乙醇脫氫酶的克隆表達(dá)及酶活優(yōu)化
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    BAG4過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的鑒定
    女性生殖器流出的白浆| 亚洲久久久国产精品| 高清av免费在线| 最新中文字幕久久久久| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲美女黄色视频免费看| 交换朋友夫妻互换小说| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 永久网站在线| 永久网站在线| av网站免费在线观看视频| 日本av免费视频播放| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲av中文av极速乱| 国产精品国产三级专区第一集| 成人手机av| 亚洲美女视频黄频| 午夜福利视频精品| av在线app专区| 岛国毛片在线播放| 黄片无遮挡物在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产黄色视频一区二区在线观看| 欧美在线黄色| 男女免费视频国产| 久久久精品94久久精品| 国产 精品1| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲成人av在线免费| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产 一区精品| 99热网站在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 国产精品偷伦视频观看了| 免费高清在线观看视频在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美另类一区| av卡一久久| 美女国产高潮福利片在线看| 丝袜在线中文字幕| 欧美成人午夜免费资源| 欧美97在线视频| 高清在线视频一区二区三区| 在线观看人妻少妇| 美女中出高潮动态图| 久久av网站| 免费高清在线观看日韩| 边亲边吃奶的免费视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产av一区二区精品久久| 男女下面插进去视频免费观看| 一区二区av电影网| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 高清av免费在线| 国精品久久久久久国模美| 综合色丁香网| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 我要看黄色一级片免费的| 欧美日韩精品网址| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 精品人妻在线不人妻| 99国产精品免费福利视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲精品视频女| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品人妻久久久影院| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 黄色配什么色好看| 少妇人妻 视频| 男男h啪啪无遮挡| 18禁观看日本| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品人妻久久久影院| www日本在线高清视频| 免费黄频网站在线观看国产| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www| 看免费av毛片| 97人妻天天添夜夜摸| 人妻系列 视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲少妇的诱惑av| 18禁国产床啪视频网站| 国产欧美亚洲国产| 在线精品无人区一区二区三| 18在线观看网站| 精品一区在线观看国产| 热99国产精品久久久久久7| 久久久久久久久免费视频了| 久久久a久久爽久久v久久| 精品亚洲成a人片在线观看| 蜜桃在线观看..| 国产成人精品福利久久| 国产免费现黄频在线看| 熟女电影av网| 午夜av观看不卡| 1024视频免费在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 国产片内射在线| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久精品人妻al黑| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲精品自拍成人| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲av男天堂| 美女主播在线视频| 国产97色在线日韩免费| 一级片'在线观看视频| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美成人午夜免费资源| 午夜福利一区二区在线看| 久久人妻熟女aⅴ| 午夜av观看不卡| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产乱来视频区| 日韩电影二区| 亚洲成人av在线免费| 久久精品国产自在天天线| 免费观看a级毛片全部| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 亚洲视频免费观看视频| 国产熟女欧美一区二区| 最黄视频免费看| 一级毛片电影观看| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲一区中文字幕在线| 超碰成人久久| 国产黄色视频一区二区在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 久久久久久久久久久免费av| 大话2 男鬼变身卡| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲国产精品999| 青春草视频在线免费观看| 高清视频免费观看一区二区| 不卡视频在线观看欧美| 久久精品人人爽人人爽视色| av网站免费在线观看视频| 免费观看a级毛片全部| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品三级大全| 午夜福利视频精品| www.自偷自拍.com| 伊人亚洲综合成人网| 久久久久人妻精品一区果冻| 高清在线视频一区二区三区| 国产黄频视频在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 伦精品一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件| videossex国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 制服丝袜香蕉在线| 免费观看无遮挡的男女| 日韩精品免费视频一区二区三区| 又大又黄又爽视频免费| 午夜激情av网站| 国产伦理片在线播放av一区| 成人毛片a级毛片在线播放| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久久伊人网av| 精品少妇内射三级| 香蕉精品网在线| 久久av网站| 国产精品国产三级专区第一集| 少妇人妻 视频| 97在线视频观看| 国产1区2区3区精品| 欧美人与性动交α欧美软件| 九色亚洲精品在线播放| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄色一级大片看看| 日韩av免费高清视频| 婷婷成人精品国产| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久久久久久精品精品| 日韩电影二区| 日本vs欧美在线观看视频| 国产成人aa在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 国产精品免费大片| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品无大码| 美国免费a级毛片| 亚洲视频免费观看视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲经典国产精华液单| 9色porny在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 中国三级夫妇交换| 如何舔出高潮| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲欧美成人精品一区二区| 一级片'在线观看视频| 晚上一个人看的免费电影| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产在线一区二区三区精| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品二区激情视频| 七月丁香在线播放| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 男女啪啪激烈高潮av片| 最近中文字幕高清免费大全6| 青春草国产在线视频| 黄色一级大片看看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 咕卡用的链子| kizo精华| 日日撸夜夜添| 男人舔女人的私密视频| 一区二区三区精品91| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| kizo精华| 国产精品三级大全| 午夜影院在线不卡| 日韩精品有码人妻一区| 999精品在线视频| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲色图综合在线观看| 尾随美女入室| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产成人精品久久二区二区91 | 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲经典国产精华液单| 大片电影免费在线观看免费| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费黄频网站在线观看国产| 高清在线视频一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| 成人手机av| 国产片内射在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久久久久人妻| 国产在线视频一区二区| 日本午夜av视频| 制服人妻中文乱码| 老司机影院成人| 久久久国产欧美日韩av| 国产一区二区三区综合在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 色婷婷av一区二区三区视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 男人添女人高潮全过程视频| 老鸭窝网址在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产一级毛片在线| 看十八女毛片水多多多| 欧美bdsm另类| 亚洲欧美清纯卡通| 精品人妻一区二区三区麻豆| 叶爱在线成人免费视频播放| 日韩制服骚丝袜av| 老司机亚洲免费影院| 精品国产一区二区三区四区第35| freevideosex欧美| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲五月色婷婷综合| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 免费观看在线日韩| 人人妻人人澡人人看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产xxxxx性猛交| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产极品天堂在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久免费观看电影| a级毛片黄视频| 人体艺术视频欧美日本| 嫩草影院入口| 大香蕉久久网| 亚洲精品国产av蜜桃| 色网站视频免费| 伦理电影免费视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 熟女电影av网| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 在线观看一区二区三区激情| 熟女电影av网| 有码 亚洲区| 老女人水多毛片| 26uuu在线亚洲综合色| 久久久精品区二区三区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 人妻人人澡人人爽人人| videos熟女内射| 午夜日韩欧美国产| 一个人免费看片子| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 不卡av一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 成人二区视频| 大陆偷拍与自拍| 伦理电影免费视频| 久久精品国产a三级三级三级| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久热在线av| 亚洲伊人色综图| 久久人妻熟女aⅴ| 色哟哟·www| 三上悠亚av全集在线观看| 免费观看在线日韩| 黄色怎么调成土黄色| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久久亚洲精品成人影院| 高清不卡的av网站| 国产成人精品一,二区| 国产福利在线免费观看视频| 美女福利国产在线| 少妇的逼水好多| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| av女优亚洲男人天堂| 久久久久精品人妻al黑| 成人国产麻豆网| 国产精品熟女久久久久浪| 1024香蕉在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲色图综合在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 高清视频免费观看一区二区| 中国三级夫妇交换| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 黄频高清免费视频| 国产高清国产精品国产三级| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产又色又爽无遮挡免| 日本wwww免费看| 久久人人爽人人片av| av网站免费在线观看视频| 免费观看无遮挡的男女| 男女无遮挡免费网站观看| 美女主播在线视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 99国产精品免费福利视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久热在线av| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产免费视频播放在线视频| 久热这里只有精品99| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 老司机影院成人| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲美女视频黄频| 国产亚洲一区二区精品| 国产熟女欧美一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 成年动漫av网址| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 热re99久久国产66热| 国产午夜精品一二区理论片| 成人国产av品久久久| 又大又黄又爽视频免费| 最近的中文字幕免费完整| h视频一区二区三区| 久久久久视频综合| 色播在线永久视频| 国产成人一区二区在线| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲精品一区蜜桃| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美xxⅹ黑人| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 熟女av电影| 欧美精品国产亚洲| 熟妇人妻不卡中文字幕| 两性夫妻黄色片| 国产精品国产三级国产专区5o| 在线精品无人区一区二区三| 免费av中文字幕在线| 男人舔女人的私密视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 高清欧美精品videossex| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久影院123| 男女午夜视频在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲色图综合在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产成人欧美| 在线看a的网站| 午夜日韩欧美国产| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲国产精品一区三区| 久久久a久久爽久久v久久| 哪个播放器可以免费观看大片| 九色亚洲精品在线播放| 国产av码专区亚洲av| videossex国产| 男人添女人高潮全过程视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产探花极品一区二区| 亚洲av福利一区| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品人妻久久久影院| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲美女黄色视频免费看| 水蜜桃什么品种好| 老司机影院毛片| 亚洲 欧美一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久青草综合色| 亚洲人成网站在线观看播放| 有码 亚洲区| 精品人妻在线不人妻| 欧美另类一区| 蜜桃在线观看..| 一级毛片电影观看| 天天影视国产精品| 大香蕉久久成人网| 成年人午夜在线观看视频| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲四区av| 男女免费视频国产| 在现免费观看毛片| 深夜精品福利| 亚洲国产精品一区三区| 国产日韩欧美在线精品| 99热国产这里只有精品6| 18禁动态无遮挡网站| 国产av精品麻豆| 国产av国产精品国产| 99国产精品免费福利视频| 精品一区在线观看国产| 国产免费又黄又爽又色| 又大又黄又爽视频免费| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 97精品久久久久久久久久精品| 香蕉国产在线看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 中文字幕色久视频| 免费看不卡的av| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 宅男免费午夜| 欧美精品av麻豆av| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美另类一区| 赤兔流量卡办理| 欧美国产精品一级二级三级| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | av线在线观看网站| 有码 亚洲区| 亚洲久久久国产精品| 亚洲成人手机| 亚洲精品aⅴ在线观看| 三级国产精品片| 一区二区av电影网| 一区福利在线观看| av国产精品久久久久影院| 国产av码专区亚洲av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 婷婷色综合大香蕉| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久久人妻精品一区果冻| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品免费视频内射| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产成人精品一,二区| 久久热在线av| 女人久久www免费人成看片| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 看免费成人av毛片| 精品国产国语对白av| 国产成人精品久久二区二区91 | 乱人伦中国视频| 成人手机av| 久久人人爽人人片av| 视频在线观看一区二区三区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 交换朋友夫妻互换小说| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 下体分泌物呈黄色| 久久久亚洲精品成人影院| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久久精品久久久久真实原创| 美女中出高潮动态图| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日本免费在线观看一区| 久久久精品区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲av国产av综合av卡| 十八禁高潮呻吟视频| 黑人猛操日本美女一级片| 成年人免费黄色播放视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久99精品国语久久久| 91成人精品电影| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 99国产综合亚洲精品| 99热全是精品| 一级毛片 在线播放| 宅男免费午夜| 美国免费a级毛片| av在线观看视频网站免费| av在线app专区| 在线观看国产h片| 亚洲av电影在线进入| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲国产av新网站| 国产又色又爽无遮挡免| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲国产精品国产精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 色网站视频免费| 国产乱来视频区| 十分钟在线观看高清视频www| 免费在线观看完整版高清| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 一区二区三区精品91| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品第一国产精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 激情视频va一区二区三区| 日韩三级伦理在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久精品国产自在天天线| 秋霞伦理黄片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 免费看av在线观看网站| av网站在线播放免费| 亚洲中文av在线| 少妇 在线观看| 桃花免费在线播放| 在线精品无人区一区二区三| 成年人午夜在线观看视频| 最新中文字幕久久久久| 国产精品国产av在线观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 大香蕉久久成人网| 国产免费又黄又爽又色| 国产免费视频播放在线视频| 国产黄色免费在线视频| 波多野结衣av一区二区av| xxxhd国产人妻xxx| 美女大奶头黄色视频| 韩国精品一区二区三区| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久人妻熟女aⅴ| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品av久久久久免费| 久久久精品区二区三区| 亚洲综合色网址| 久久久久久久久久久免费av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品一国产av| 精品亚洲成a人片在线观看| 成人影院久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 久久久国产精品麻豆| 一区二区三区激情视频| 久久久久久伊人网av| 成人午夜精彩视频在线观看| av国产精品久久久久影院| 精品一品国产午夜福利视频| 两性夫妻黄色片| 老熟女久久久| 国产精品免费大片| 老司机亚洲免费影院| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品第一国产精品| 人体艺术视频欧美日本| 99热全是精品| 亚洲伊人久久精品综合| 国产又色又爽无遮挡免| 9191精品国产免费久久| 母亲3免费完整高清在线观看 | 美女午夜性视频免费| 在线观看美女被高潮喷水网站| 美女脱内裤让男人舔精品视频|