關(guān)鍵酶飽和突變提高釀酒酵母蒎烯產(chǎn)量

任全路，陸信曜，宗紅，諸葛斌*

1(江南大學(xué)，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無(wú)錫，214122)

蒎烯是一種來(lái)自松柏類(lèi)植物的天然單萜化合物，在調(diào)味劑、香料和農(nóng)藥中具有重要作用[1]。蒎烯二聚體因?yàn)槠涓唧w積能值的特性，可作為再生燃料替代航空燃料JP-10[2]。目前工業(yè)獲得蒎烯的方法是從松柏類(lèi)植物中提取，這種方法不僅浪費(fèi)原料，還會(huì)產(chǎn)生大量的污染[1]。

蒎烯的生物合成是由焦磷酸香葉酯(geranyl pyrophosphate, GPP)經(jīng)過(guò)蒎烯合酶催化而來(lái)[3]，在釀酒酵母中GPP通過(guò)甲羥戊酸(mevalonate, MVA)通路合成[4]，其中前體乙酰輔酶A的供應(yīng)[5]、甲羥戊酸[6]、異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP)和二甲基烯丙焦磷酸酯(dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP)的轉(zhuǎn)化[7]是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。由于GPP在釀酒酵母中會(huì)被轉(zhuǎn)化為法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate, FPP)，不利于蒎烯的合成，所以焦磷酸香葉酯合成酶突變體ERG20F96W-N127W被引入釀酒酵母提高GPP的含量[8]。陳天華等[9]通過(guò)上述方法在釀酒酵母中引入蒎烯合酶Pt30后發(fā)酵測(cè)得了蒎烯的產(chǎn)量，但是產(chǎn)量水平仍然很低。

蒎烯合酶作為蒎烯合成通路關(guān)鍵酶對(duì)蒎烯的最終產(chǎn)量產(chǎn)生直接的影響[10]。蒎烯合酶的研究目前主要集中在大腸桿菌中異源表達(dá)，來(lái)自火炬松、大冷杉等松柏類(lèi)植物的蒎烯合酶在大腸桿菌中的表達(dá)已見(jiàn)報(bào)道[10-11]。但是野生型蒎烯合酶在異源表達(dá)中不能收到良好的效果，有研究發(fā)現(xiàn)蒎烯合酶Pt1的Q457位點(diǎn)的突變可以影響到其對(duì)Mn2+的偏好性，從而提高酶活性和蒎烯產(chǎn)量。雖然釀酒酵母是合成萜類(lèi)物質(zhì)的優(yōu)良宿主[12-17]，但蒎烯合酶Pt30在釀酒酵母中的表達(dá)也沒(méi)有很好的效果[9]?；诖?，本研究對(duì)蒎烯合酶Pt30的保守性Q456位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變以獲得更好的突變體，為高效生產(chǎn)蒎烯提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)使用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。PrimeSTAR?HS DNA高保真聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酸(BamH I、EcoR I、NotI、NheI、KpnI等)，大連寶生物有限公司；ABclonal MultiF Seamless Assembly，武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；氨芐青霉素(ampicillin, Amp)、酵母無(wú)氨基氮源(yeast nitrogen base W/O amino acids, YNB)、氨基酸(亮氨酸、色氨酸、組氨酸、尿嘧啶)，上海生工生物工程股份有限公司；蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-aldrich公司；Tryptone、Yeast Extract，Oxiod公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段回收和凝膠回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；TSQ8000氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；GC-2014島津氣相色譜儀，日本島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司；HP-5MS氣相色譜柱，安捷倫科技有限公司；UV-2000可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司。

表1 本研究使用的菌株和質(zhì)粒

1.2 引物

本研究使用的引物見(jiàn)表2。

表2 本研究使用的引物

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，氯化鈉10。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸膏10，蛋白胨20，葡萄糖20。

發(fā)酵培養(yǎng)基：YNB 6.7 g/L，葡萄糖20 g/L，尿嘧啶200 mg/L。

培養(yǎng)方法：挑取單菌落，接種于10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行活化，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h；以2%的接種量再轉(zhuǎn)接到10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h作為種子液；將得到的種子液轉(zhuǎn)接到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，控制起始生物量OD600為0.1。待菌株生長(zhǎng)12 h后，添加10%的十二烷進(jìn)行兩相發(fā)酵[12]；發(fā)酵周期為120 h。期間每24 h取樣1 mL測(cè)定菌株的生長(zhǎng)情況，待發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定上層十二烷中的蒎烯產(chǎn)量。

1.4 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

蒎烯和酶基因Pt30通過(guò)蘇州金唯智公司合成，以p424-PTEF1為載體，經(jīng)BamH I單酶切后，利用同源重組酶進(jìn)行連接，構(gòu)建成p424-tPt30。Q456位點(diǎn)的點(diǎn)突變通過(guò)反向重疊PCR實(shí)現(xiàn)，以p424-tPt30為模板，PCR獲得點(diǎn)突變的片段，經(jīng)DpnI酶消化后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 測(cè)定方法

本研究生物量以O(shè)D600的值進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定。

蒎烯的含量通過(guò)氣相測(cè)定：蒎烯標(biāo)品建立蒎烯標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)發(fā)酵蒎烯進(jìn)行定量；氣相色譜程序如下：進(jìn)樣口溫度與FID檢測(cè)器溫度均為260 ℃；柱溫升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?0 ℃，保持3 min；然后以5 ℃/min升至100 ℃，保持3 min；最后以40 ℃/min升至250 ℃， 保持5 min；進(jìn)樣量為1 μL；載體為氮?dú)?；分流比?∶20。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒎烯合酶賦予釀酒酵母蒎烯合成能力

釀酒酵母中天然存在MVA通路，是合成萜類(lèi)物質(zhì)的優(yōu)良的宿主；蒎烯合成通路在釀酒酵母中缺少蒎烯合酶催化GPP合成蒎烯。首先我們按照釀酒酵母的密碼子偏好性對(duì)蒎烯合酶Pt30進(jìn)行密碼子優(yōu)化經(jīng)蘇州金唯智公司合成，并通過(guò)信號(hào)肽預(yù)測(cè)將得到的蒎烯合酶Pt30的N端48個(gè)氨基酸截?cái)嗪髽?gòu)建了蒎烯合酶表達(dá)質(zhì)粒；將其直接轉(zhuǎn)化釀酒酵母，構(gòu)建具有完整的蒎烯合成通路的工程酵母，將得到的工程菌進(jìn)行兩相發(fā)酵，氣相測(cè)定的結(jié)果中并沒(méi)有檢測(cè)到蒎烯的產(chǎn)生。已知GPP作為單萜類(lèi)物質(zhì)的直接前體物質(zhì)，在釀酒酵母中會(huì)轉(zhuǎn)化成FPP，造成胞內(nèi)的含量很微弱[8]，可能造成蒎烯的產(chǎn)量太少，達(dá)不到氣相的檢測(cè)限。因此，氣相質(zhì)譜分析被用于發(fā)酵結(jié)果的檢測(cè)，質(zhì)譜分析結(jié)果見(jiàn)圖1，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比確定檢測(cè)到了蒎烯的存在。

a-蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖；b-樣品的質(zhì)譜圖

2.2 蒎烯合酶突變促進(jìn)蒎烯合成

為了提高蒎烯的合成，將蒎烯合酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到構(gòu)建的強(qiáng)化MVA通路的菌株Sc.MPS中，經(jīng)過(guò)兩相發(fā)酵后，在蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間還是沒(méi)有檢測(cè)到蒎烯的出峰，可能是蒎烯合酶的活性在釀酒酵母中太低。為了提高蒎烯合酶在釀酒酵母中的活性，考慮對(duì)蒎烯合酶進(jìn)行突變。有文獻(xiàn)報(bào)道，與Pt30同樣來(lái)自于火炬松的蒎烯合酶Pt1，在Q457位點(diǎn)的突變可以改變Pt1的離子偏好性[11]，從而提高其在大腸桿菌中的酶活性。野生型的Pt30酶需要Mn2+較高的胞內(nèi)環(huán)境保持高酶活性[18]，在釀酒酵母中胞內(nèi)Mn2+濃度在2～10 μmol/L，不足以維持蒎烯合酶的高活性[19]。Pt30在釀酒酵母中表達(dá)時(shí)，在共表達(dá)ERG20WW的情況下，蒎烯的產(chǎn)量只有0.329 mg/L[9]；與ERG20WW融合表達(dá)之后產(chǎn)量也只有6.55 mg/L[9]；這是關(guān)于蒎烯合酶表達(dá)在釀酒酵母中唯一的報(bào)道。所以我們將包括這2個(gè)蒎烯合酶的9種蒎烯合酶進(jìn)行氨基酸對(duì)比，結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)在Q457位點(diǎn)附近具有保守性，所以將Pt30的Q456位點(diǎn)被飽和突變并在蒎烯合成通路強(qiáng)化的菌株中過(guò)表達(dá)，希望改變蒎烯合酶Pt30在釀酒酵母中的表現(xiàn)。經(jīng)過(guò)兩相發(fā)酵后，大多數(shù)的突變體還是不能檢測(cè)到樣品在蒎烯保留時(shí)間的出峰，但是Pt30(Q456I)和Pt30(Q456K)檢測(cè)到了明顯蒎烯出峰，并通過(guò)蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品獲得的蒎烯標(biāo)準(zhǔn)曲線確定了蒎烯的產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖3，蒎烯的產(chǎn)量分別為0.041、0.017 mg/L。這2個(gè)突變體明顯提高了蒎烯合酶在釀酒酵母中生產(chǎn)蒎烯的能力，實(shí)現(xiàn)了氣相檢測(cè)的從無(wú)到有的質(zhì)的變化。如圖4所示，我們還發(fā)現(xiàn)在2株突變體發(fā)酵的過(guò)程中，蒎烯產(chǎn)量較高的Pt30(Q456I)突變體發(fā)酵時(shí)的生長(zhǎng)弱于Pt30(Q456K)突變體，可能是由于合成了更多的蒎烯，造成生長(zhǎng)曲線的顯著延后，這也合理解釋了蒎烯對(duì)酵母菌株的毒性。我們利用COACH-D[20-21]對(duì)Pt30建立蛋白模型，如圖3-a所示，發(fā)現(xiàn)Q456位點(diǎn)位于蛋白外圍的一個(gè)α螺旋上，離活性中心較遠(yuǎn)，但是與Mn2+的結(jié)合位點(diǎn)距離很近，從突變后側(cè)鏈的結(jié)果來(lái)看，原來(lái)的Q456存在一個(gè)碳氧雙鍵，2個(gè)突變體的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單，但是對(duì)于結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單的蛋白的突變沒(méi)有獲得更優(yōu)的結(jié)果，可能歸因于側(cè)鏈的長(zhǎng)度對(duì)Mn2+的結(jié)合位點(diǎn)的影響。推測(cè)可能突變后的蛋白對(duì)離子的結(jié)合強(qiáng)度發(fā)生了變化，一定程度上改變了蒎烯合酶對(duì)Mn2+的依賴(lài)，從而通過(guò)對(duì)這一位點(diǎn)的突變確實(shí)改變了蒎烯合酶在釀酒酵母中的表現(xiàn)，這項(xiàng)成果也為未來(lái)理性設(shè)計(jì)蒎烯合酶提供了一定的借鑒。

圖2 蒎烯合酶的氨基酸序列對(duì)比

圖4 突變體Pt30(Q456I)和Pt30(Q456K)兩相發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線

3 結(jié)論

蒎烯是一個(gè)應(yīng)用前景極大的單萜類(lèi)化合物，對(duì)于其綠色生物合成的研究還亟待挖掘，本研究首先將蒎烯合酶引入釀酒酵母中，通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)到蒎烯的存在，確定釀酒酵母合成蒎烯的能力。通過(guò)進(jìn)一步將蒎烯合酶表達(dá)質(zhì)粒在MVA通路強(qiáng)化的菌株中表達(dá)，還是沒(méi)有通過(guò)氣相檢測(cè)到蒎烯的出峰。為了提高蒎烯合酶在釀酒酵母中的活性，通過(guò)比較包括Pt1和Pt30在內(nèi)的9種蒎烯合酶的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)蒎烯合酶在Q457位點(diǎn)附近具有保守性。為了提高蒎烯合酶的在釀酒酵母中的表現(xiàn)，在構(gòu)建的蒎烯合成通路強(qiáng)化的釀酒酵母菌株中，過(guò)表達(dá)構(gòu)建的蒎烯合酶Pt30的Q456位點(diǎn)飽和突變體，希望獲得在釀酒酵母胞內(nèi)表現(xiàn)更好的蒎烯合酶，經(jīng)過(guò)兩相發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn)Pt30(Q456I)和Pt30(Q456K)的點(diǎn)突變，顯著提高了釀酒酵母合成蒎烯的產(chǎn)量，這證明了Q456位點(diǎn)對(duì)Pt30的重要性。雖然目前獲得的蒎烯產(chǎn)量無(wú)法與共表達(dá)ERG20WW及融合表達(dá)ERG20WW相比，但是解決蒎烯合酶的活性問(wèn)題對(duì)于蒎烯高效合成更加重要。對(duì)蒎烯合酶的建模發(fā)現(xiàn)Q456這一位點(diǎn)在蛋白中的Mn2+的結(jié)合位點(diǎn)附近，對(duì)釀酒酵母蒎烯合成的影響很大，本研究獲得的蒎烯合酶的突變體也可以為釀酒酵母高效合成蒎烯提供了借鑒。