基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的結(jié)腸炎奇效顆粒治療潰瘍性結(jié)腸炎作用機(jī)制研究

孫鈺婧 霍志鵬 王 玉 李瑞明 秦民堅(jiān) 何 毅▲

1.天士力控股集團(tuán)有限公司 天士力研究院/創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300410；2.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇南京 210009

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎性腸病，以結(jié)腸黏膜連續(xù)性、彌漫性炎癥為主要特點(diǎn)，病程漫長(zhǎng)，以血性腹瀉、腹痛等為主要臨床表現(xiàn)，長(zhǎng)期嚴(yán)重可并發(fā)消化道穿孔和結(jié)腸癌[1]，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和心理狀況，目前認(rèn)為UC 的發(fā)生以遺傳因素為基礎(chǔ)，在心理及環(huán)境因素的持續(xù)誘發(fā)下，腸道黏膜屏障受損，腸內(nèi)菌群失調(diào)，導(dǎo)致免疫功能紊亂[2]，但具體病因尚不十分明確。臨床上，西醫(yī)治療以口服氨基水楊酸類藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等為主，配合全身支持治療，重癥患者考慮手術(shù)治療[3-4]；中醫(yī)治療?？诜?fù)方中藥或有效成分，采用中藥灌腸、針灸等不同形式的療法[3]，多層次綜合作用于患者及患處。結(jié)腸炎奇效顆粒是課題組開發(fā)的中藥六類新藥，由骨碎補(bǔ)、生車前子等6 味中藥組成，具有溫腎暖脾、化瘀導(dǎo)滯之功效，用于慢性非特異性UC 的治療[5]，目前處于Ⅱ期臨床階段。前期研究表明，結(jié)腸炎奇效顆粒能夠明顯減輕冰醋酸、葡聚糖硫酸鈉和三硝基苯磺酸所致的UC 小鼠、大鼠結(jié)腸炎癥和潰瘍病變程度[6]，但結(jié)腸炎奇效顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確。

研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法，通過(guò)構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)從整體角度分析結(jié)腸炎奇效顆粒治療UC 的作用機(jī)制，預(yù)測(cè)該方治療UC 的關(guān)鍵靶基因，并對(duì)其進(jìn)行生物功能和代謝通路分析，旨在初步認(rèn)識(shí)該方治療UC 的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性成分的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（pharmacology analysis platform of traditional Chinese medicine system，TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)及參考文獻(xiàn)中搜集各藥材化學(xué)成分，結(jié)合前期質(zhì)譜鑒定結(jié)果，初步獲取化學(xué)成分，并在TCMSP 和SwissADME 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-like，DL）≥0.18 的化學(xué)成分作為潛在活性成分。

1.2 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將活性成分導(dǎo)入TCMSP 和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢作用靶點(diǎn)，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)名稱校正為官方名稱（Official Symbol），校正后導(dǎo)入STRING 進(jìn)行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，去除無(wú)相互作用靶點(diǎn)，借助Cytoscape（version 3.7.1）構(gòu)建結(jié)腸炎奇效顆粒活性成分-靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.3 UC 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將關(guān)鍵詞“Ulcerative Colitis”輸入DiGSeE 和Gene Cards 收集疾病靶點(diǎn)，使用Draw Venn Diagram 在線工具繪制韋恩圖篩選共有靶點(diǎn)作為疾病靶點(diǎn)。將活性成分靶點(diǎn)信息和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入在線工具中預(yù)測(cè)“藥物-疾病”交集靶標(biāo)，利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)繪制交集靶標(biāo)PPI圖。

1.4“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

依據(jù)活性成分靶點(diǎn)和“藥物-疾病”交集靶標(biāo)，使用Cytoscape 分別構(gòu)建“中藥-藥材-活性成分”網(wǎng)絡(luò)和“活性成分-交集靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，使用merge 功能合并兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)以構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)”PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 核心靶點(diǎn)的篩選

將“藥物-疾病” 交集靶標(biāo)導(dǎo)入STRING 中進(jìn)行PPI 分析，再利用Cytoscape 以大于Degree 中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)篩選核心靶點(diǎn)。

1.6 GO 生物功能和KEGG 代謝通路富集分析

通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 代謝通路富集分析，以FDR＜0.01 作為顯著富集標(biāo)準(zhǔn)，篩選得富集結(jié)果，再通過(guò)R 軟件（R×64 3.6.3）對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選

結(jié)合TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)、參考文獻(xiàn)及前期質(zhì)譜鑒定結(jié)果，共獲得化學(xué)成分102 個(gè)。TCMSP 和SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)中活性成分篩選結(jié)果顯示，同時(shí)滿足OB≥30%和DL≥0.18 或符合Lipinski 規(guī)則的化學(xué)成分共12個(gè)，見表1，包括骨碎補(bǔ)成分3 個(gè)，車前子成分3 個(gè)，山楂成分8 個(gè)以及訶子肉成分6 個(gè)。

表1 結(jié)腸炎奇效顆粒的12 個(gè)活性成分

利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)校正、 去重后，共獲得靶點(diǎn)269 個(gè)，將其導(dǎo)入STRING 進(jìn)行PPI 分析，結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件中構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖1（封三），藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，綠色節(jié)點(diǎn)代表活性成分。

圖1 結(jié)腸炎奇效顆粒的活性成分-靶點(diǎn)PPI 圖

2.2 疾病靶點(diǎn)及“藥物-疾病”交集靶標(biāo)預(yù)測(cè)

在DiGSeE 數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別得到“Ulcerative Colitis”相關(guān)靶點(diǎn)1322 和4356 個(gè)，通過(guò)繪制韋恩圖篩選疾病靶點(diǎn)413 個(gè)。“藥物-疾病”交集靶標(biāo)預(yù)測(cè)過(guò)程中，共篩選交集靶標(biāo)64 個(gè)，見圖2。

圖2 藥物-疾病交集靶標(biāo)預(yù)測(cè)

圖3（封三）為STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)繪制的交集靶標(biāo)PPI 圖，該網(wǎng)絡(luò)由64 個(gè)節(jié)點(diǎn)、893 條邊組成，網(wǎng)絡(luò)密度為0.744，平均節(jié)點(diǎn)度為27.9。

圖3 藥物-疾病交集靶標(biāo)PPI 圖

2.3“藥物-疾病-靶點(diǎn)”PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶標(biāo)和活性成分導(dǎo)入Cytoscape 軟件中構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)”PPI 網(wǎng)絡(luò)，由12 個(gè)活性成分，64個(gè)交集靶標(biāo)，82 個(gè)節(jié)點(diǎn)，252 條邊組成的“藥物-疾病-靶點(diǎn)”PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖4（封四）。

2.4 核心靶點(diǎn)篩選

64 個(gè)“藥物-疾病”交集靶標(biāo)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)后，PPI 分析結(jié)果顯示，交集靶點(diǎn)均具有相互作用，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，以Degree 值的中位數(shù)27.5 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選核心靶點(diǎn)共32 個(gè)，見圖5（封四）。Degree 值越大，圖中靶點(diǎn)的直徑越大。

2.5 GO 功能富集分析

通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析，從生物過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）3 個(gè)方面闡述核心靶點(diǎn)的生物學(xué)作用，共獲得32 個(gè)功能富集（FDR＜0.01），包含25 個(gè)顯著富集的生物過(guò)程，主要涉及一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控（positive regulation of protein phosphorylation）等；3 個(gè)顯著富集的分子功能：細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、酶結(jié)合（enzyme binding） 以及相同的蛋白質(zhì)結(jié)合 （identical protein binding）過(guò)程；4 個(gè)顯著富集的細(xì)胞組成，包括胞外區(qū)空間（extracellular space）、細(xì)胞外區(qū)域（extracellular region）、陷窩（caveola）以及質(zhì)膜的外側(cè)（external side of plasma membrane）。GO 富集功能分析結(jié)果見圖6（封四）。

2.6 KEGG 通路富集分析

將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)主要富集于癌癥途徑（pathways in cancer）、HIF-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）等32 條通路中（FDR＜0.01），提示這些通路可能是結(jié)腸炎奇效顆粒治療UC 的重要機(jī)制。利用R軟件繪制KEGG 富集通路氣泡圖，見圖7（封四）。氣泡大小代表基因數(shù)目，顏色越深，F(xiàn)DR 值越小。

3 討論

“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中槲皮素（Degree 值=53）、柚皮苷（Degree 值=14）和沒(méi)食子酸（Degree 值=10）與疾病靶標(biāo)相關(guān)度最高，提示其可能是全方治療UC 的主要活性成分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，車前子和山楂成分槲皮素具有良好的抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌效果[7]；沒(méi)食子酸可以調(diào)節(jié)葡聚糖硫酸鈉所致UC 小鼠的白細(xì)胞介素-21、白細(xì)胞介素-23 等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[8]；柚皮苷作為骨碎補(bǔ)總黃酮的主要成分，能夠減輕炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)，加速細(xì)胞增殖[9]，同時(shí)還能促進(jìn)一些藥物在人體內(nèi)的代謝吸收[10]，提示結(jié)腸炎奇效顆粒對(duì)UC 的治療作用是多種成分共同作用的結(jié)果，體現(xiàn)了中藥配伍優(yōu)勢(shì)。

核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-6（Degree值=59）和腫瘤壞死因子（Degree 值=54）是核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的樞紐，由二者表達(dá)的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6 和腫瘤壞死因子-α 在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫、腫瘤免疫等多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用[11-12]，提示結(jié)腸炎奇效顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)二者介導(dǎo)的多種炎癥和免疫途徑發(fā)揮治療作用。

GO 功能富集分析結(jié)果顯示，結(jié)腸炎奇效顆粒參與炎癥反應(yīng)、血管生成、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、寄主共生體生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控、趨化因子生物合成過(guò)程的正調(diào)控、NO 生物合成過(guò)程的正調(diào)控等生物過(guò)程，可能通過(guò)上調(diào)NO 水平，激活鳥苷酸環(huán)化酶（guanylate cyclase，GC）使環(huán)鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate，c-GMP）增加，抑制表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號(hào)通路[13]，正調(diào)控平滑肌細(xì)胞的增殖和新血管的生成以修復(fù)結(jié)腸受損部位；促進(jìn)趨化因子合成，招募并活化T、B 細(xì)胞以清除病原體[14]；同時(shí)調(diào)節(jié)腸道菌群，來(lái)達(dá)到減輕腸道炎癥和潰瘍程度的目的，且其調(diào)控過(guò)程多發(fā)生在extracellular space中。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，結(jié)腸炎奇效顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子通路、NOD 樣受體通路、Toll 樣受體通路、FoxO 通路、PI3K-Akt 通路、HIF-1通路、NF-κB 通路、T 細(xì)胞受體通路等信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮藥效。其中腫瘤壞死因子信號(hào)通路通過(guò)腫瘤壞死因子-α 和腫瘤壞死因子-β 兩細(xì)胞因子作用于腫瘤壞死因子R1 和腫瘤壞死因子R2 受體來(lái)激活NF-κB 和MAPK 通路[15]；NOD 樣受體（NOD-like receptors，Nods）作為先天免疫系統(tǒng)受體，識(shí)別胞內(nèi)的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），驅(qū)動(dòng)NF-κB 和MAPK 通路的激活[16]；Toll 樣受體（Tolllike receptors，TLRs）作為另一種重要的先天免疫反應(yīng)受體，同樣識(shí)別PAMPs 以激活NF-κB 和MAPK 通路，但與Nods 不同的是，TLRs 通過(guò)髓樣分化蛋白抗原（myeloid differential protein-88，MyD88）依賴性和MyD88 非依賴性兩條信號(hào)通路將其激活[17-18]；PI3KAkt 通路也可激活NF-κB 通路和MAPK 通路等炎癥通路[19]。可見，NF-κB 和MAPK 兩條通路是各通路的潛在中心。NF-κB 在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，能促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6 等炎癥因子的表達(dá)[20]；活化p38 MAPK 信號(hào)通路可以上調(diào)細(xì)胞因子Gro-α、白細(xì)胞介素-8 的表達(dá)，促進(jìn)克羅恩病（Crohn′s disease，CD）腸道炎癥的形成[21]；藥理實(shí)驗(yàn)也顯示，結(jié)腸炎奇效顆粒三個(gè)劑量組均能顯著降低葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的UC 大鼠血漿中的腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、NF-κB p65 和細(xì)胞黏附分子-1 的含量（P＜0.01）[6，22]。因此推測(cè)，結(jié)腸炎奇效顆?？赡芡ㄟ^(guò)直接或間接地阻斷NF-κB 和MAPK 兩條通路，調(diào)控下游白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的合成，起到抗炎、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、平衡腸道內(nèi)環(huán)境，修復(fù)粘膜損傷等作用。另外，KEGG 富集結(jié)果中存在多條與腸道炎癥和癌癥相關(guān)的通路，如炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）、 阿米巴病、FoxO 通路、HIF-1 通路、 癌癥途徑等。據(jù)報(bào)道，UC 是結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CAC）的一個(gè)重要病因，由UC 引起的CAC 占所有結(jié)直腸癌的1%～2%[23]，UC 癌變總體發(fā)生率為3.7%，且其炎-癌轉(zhuǎn)化率隨著UC 病程的延長(zhǎng)逐年增加，UC 發(fā)病30年后，CAC 的發(fā)生率高達(dá)18.4%[24]。已有研究表明，激活FoxO 通路可降低FoxO3a 抑癌基因的表達(dá)[25]，激活HIF-1 通路可導(dǎo)致致癌因子的擴(kuò)散[26]，從而加速癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，提示結(jié)腸炎奇效顆粒可能有預(yù)防UC 癌變的活性，其作用機(jī)制可能與阻斷FoxO、HIF-1 等通路，提高FoxO3a 抑癌基因的表達(dá)，減緩致癌因子的擴(kuò)散有關(guān)，該活性和機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。