β-酪蛋白的功能特性及其在嬰兒配方乳粉中的應用研究進展

陳文亮，蘇米亞，賈宏信，齊曉彥

（光明乳業(yè)股份有限公司，乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海 200436）

β-酪蛋白廣泛存在于哺乳動物（牛、山羊、牦牛、馬、兔等）和人的乳汁（母乳）中，在牛乳中占總蛋白質(zhì)的24%～28%（約占總酪蛋白的45%），在母乳中占總蛋白質(zhì)的15%～30%（占總酪蛋白的50%～85%），100 mL成熟母乳中大約含有0.4 mgβ-酪蛋白[1-2]，因此β-酪蛋白是母乳的主要蛋白質(zhì)成分。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，母乳中含有多種來源于β-酪蛋白的天然乳源生物活性肽，對新生兒具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和飽腹等多種不同生理功能。由于母乳與牛乳中的β-酪蛋白構成存在差異，并且β-酪蛋白具有多種亞型，各亞型具有不同的生理功能，因此牛乳β-酪蛋白并不能簡單替代母乳β-酪蛋白。母乳是嬰兒配方乳粉的黃金標準，在模擬母乳β-酪蛋白構成的基礎上，進一步在活性肽水平上模擬母乳組成，使嬰幼兒配方乳粉中的生物活性肽水平接近母乳，能夠進一步滿足嬰兒對蛋白質(zhì)類營養(yǎng)的需求。本文論述β-酪蛋白的結(jié)構特點、性質(zhì)、各功能特性及其在嬰幼兒配方乳粉中的應用研究進展，為嬰兒配方乳粉產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1β-酪蛋白的結(jié)構及性質(zhì)

1.1 β-酪蛋白的氨基酸組成

β-酪蛋白分子由一定數(shù)量的氨基酸殘基組成。在分子水平上，牛乳β-酪蛋白與人乳β-酪蛋白存在明顯差異。牛乳β-酪蛋白是完全磷酸化的分子，含有209 個氨基酸殘基，磷酸化前的一級結(jié)構分子質(zhì)量為23.6 kDa，而5 個Ser殘基（Ser15、Ser17、Ser18、Ser19和Ser35，前4 個Ser殘基形成磷酸化中心）磷酸化后的分子質(zhì)量為24.0 kDa，非磷酸化β-酪蛋白的等電點為5.1，由于磷酸化，其等電點會降至4.7以下[3]。

β-酪蛋白在所有酪蛋白中疏水性最強，這是由于它含有不帶電荷且具有強疏水性的C端以及攜帶負電荷磷酸化絲氨酸簇的N端。β-酪蛋白在乳液中形成膠粒狀物質(zhì)，并能與磷離子、鈣離子形成穩(wěn)定的微膠粒結(jié)構，因此可以提高乳中的鈣、磷含量。β-酪蛋白具有較強的雙親性，其N端殘基1～40帶有β-酪蛋白分子的全部凈電荷，疏水性低，僅含有2 個脯氨酸殘基，中間段，即殘基41～135，所帶電荷少，疏水性中等，而C端殘基136～209含有許多非極性殘基，所帶電荷少，疏水性高[2]。牛乳β-酪蛋白（A2型）的帶電荷氨基酸殘基分布如圖1所示，氨基酸組成如圖2所示。

圖1 牛乳β-酪蛋白（A2型）帶電荷氨基酸殘基分布[2]Fig. 1 Distribution of charged amino acid residues in cow milk β-casein (type A2)[2]

圖2 牛乳β-酪蛋白（A2型）氨基酸組成[2]Fig. 2 Amino acid sequence of cow milk β-casein (type A2)[2]

與牛乳β-酪蛋白分子不同，人乳β-酪蛋白含有226 個氨基酸殘基，分子質(zhì)量為25.38 kDa[4]。人乳β-酪蛋白是具有多種磷酸化形式的分子，每個不同磷酸化形式的β-酪蛋白分子所含的有機磷酸基團最少為0 個，最多為5 個，其中雙磷酸化β-酪蛋白約占人乳β-酪蛋白總量的30%，是主要成分之一，因此，雙磷酸化β-酪蛋白的性質(zhì)和締合方式是人乳β-酪蛋白膠束結(jié)構和功能的重要決定因素[5]。人乳β-酪蛋白的氨基酸組成如圖3所示。

圖3 人乳β-酪蛋白的氨基酸組成[6]Fig. 3 Amino acid sequence of human milk β-casein[6]

由于蛋白質(zhì)空間結(jié)構及氨基酸組成差異，酪蛋白存在多種變體，β-酪蛋白是其中重要的一種，而β-酪蛋白本身也具有多種亞型結(jié)構[7]。根據(jù)β-酪蛋白分子結(jié)構中相應位置上氨基酸的變化，可以確定每種β-酪蛋白的亞型；目前已發(fā)現(xiàn)牛乳β-酪蛋白分子具有13 種亞型結(jié)構，包括A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F、G、H1、H2及I型，其中最為常見的亞型結(jié)構是A1型和A2型（二者為一對共顯性等位基因），其次為B型，其他類型則較少見；以A2型作為初始型或原始型，可以比較其他類型與A2型的差異：A1型是A2型氨基酸鏈67位由Pro變?yōu)镠is；A3型是106位由His變?yōu)镚ln；B型是67位由Pro變?yōu)镠is，122位由Ser變?yōu)锳rg；C型是37位由Glu變?yōu)長ys，67位由Pro變?yōu)镠is；D型是18位由Ser變?yōu)長ys；E型是36位由Glu變?yōu)長ys；F型是67位由Pro變?yōu)镠is，152位由Pro變?yōu)長eu；G型是67位由Pro變?yōu)镠is，137或138位由Pro變?yōu)長eu；H1型是25位由Arg變?yōu)镃ys，88位由Leu變?yōu)镮le；H2型是72位由Gln變?yōu)镚lu，93位由Met變?yōu)長eu，114位與169位間的Gln變?yōu)镚lu；I型是93位由Met變?yōu)長eu[8]。牛乳β-酪蛋白亞型結(jié)構通常是A1或A2型，2 種β-酪蛋白的結(jié)構示意圖及酶解位點如圖4所示[9]。A1型和A2型牛乳β-酪蛋白酶解時會產(chǎn)生具有不同生理功能的肽段，它們對人類健康的作用還存在爭議[10]。人乳β-酪蛋白的亞型結(jié)構較少，目前僅發(fā)現(xiàn)存在A1、A2和B型[11]。

圖4 A1、A2型牛乳β-酪蛋白結(jié)構示意圖及酶解位點[9]Fig. 4 Protein chains of cow milk β-casein variants type A1, A2 and their enzymatic cleavage sites[9]

1.2 β-酪蛋白的空間結(jié)構

β-酪蛋白的空間結(jié)構對其生物活性非常重要。β-酪蛋白的空間結(jié)構主要包含4 種類型，即α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。目前已有較多關于牛乳β-酪蛋白空間結(jié)構的研究成果。β-酪蛋白可能是一種“預熔融球狀”蛋白，在乳汁中以膠束形式存在，具有一定的自我締合能力，且在自締合前可以進行折疊[12]。β-酪蛋白具有分子伴侶樣特性，它不僅參與酪蛋白膠束的形成，而且自身也能形成寡聚膠束[13-14]。β-酪蛋白膠束及二級結(jié)構受溫度和溶劑的影響[15-16]，在低溫（＜10～15 ℃）條件下，β-酪蛋白單體占主導地位，但隨著溫度的升高，β-酪蛋白單體通過疏水鍵結(jié)合形成β-酪蛋白膠束[17]。β-酪蛋白不同亞型之間所形成的膠束形式也有差異，例如，A2型β-酪蛋白形成的膠束比A1型小，二者膠束結(jié)構的差異導致A2型β-酪蛋白的分子伴侶活性比A1型高[18]。β-酪蛋白單體和聚合物模型示意圖如圖5所示。從基于氨基酸組成序列的二級結(jié)構預測中可以得到β-酪蛋白的三維分子模型（圖6）[19]，在向外延伸的C末端區(qū)域β-酪蛋白可以自由地與其他β-酪蛋白相互作用。

圖5β-酪蛋白單體和聚合物模型示意圖（平面圖）[18]Fig. 5 Schematic of β-casein monomer and polymer model[18]

圖6β-酪蛋白的分子模型三維示意圖[19]Fig. 6 Three-dimensional schematic of molecular model of β-casein[19]

人乳β-酪蛋白的空間結(jié)構與牛乳β-酪蛋白存在明顯差異[20]。在溶液中，人乳β-酪蛋白與牛乳β-酪蛋白的分子內(nèi)外表面巰基分布、二級結(jié)構相對含量均存在較大差異。

表1 人乳β-酪蛋白與牛乳β-酪蛋白的巰基含量及二級結(jié)構相對含量比較[21]Table 1 Comparison of sulfhydryl content and secondary structure composition between human and bovine milk β-casein[21]

由表1可知，人乳β-酪蛋白與牛乳β-酪蛋白分子結(jié)構的差異主要在于巰基的暴露程度以及α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構占比的差異，這些差異決定了二者結(jié)構及性質(zhì)的不同，人乳β-酪蛋白表現(xiàn)為表面疏水性更強、空間構象更松散，而牛乳β-酪蛋白則表現(xiàn)為表面疏水性較弱、空間構象更緊密。

2β-酪蛋白的功能特性

2.1 溶解及乳化特性

β-酪蛋白的溶解性受溫度及溶液pH值影響較大。隨著pH值的變化，β-酪蛋白的溶解度呈現(xiàn)U形變化，當pH值為2或8～10時，β-酪蛋白溶解度最高（達到80%左右），而當pH值接近等電點（pI 4～5）時，β-酪蛋白溶解度最低（只有10%左右）；牛乳β-酪蛋白與人乳β-酪蛋白的溶解度略有不同，但隨溫度及溶液pH值的總體變化趨勢一致[22]。

β-酪蛋白的乳化特性與其溶解度有關，當β-酪蛋白溶解度較低時（如溶液pH 4～5），其乳化性較差，當β-酪蛋白溶解度較高時（如溶液pH值為2或8～10），其乳化性大幅增強[21]。β-酪蛋白的乳化特性還與其聚合度有關。利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對β-酪蛋白進行催化聚合，可以得到β-酪蛋白的二聚體、三聚體、四聚體和多聚體，對這些交聯(lián)β-酪蛋白聚合物的乳化性能測試表明，雖然聚合后的β-酪蛋白乳化活性降低，但乳液穩(wěn)定性隨著聚合度的增加而提高[23]。

有研究發(fā)現(xiàn)，通過化學修飾（如糖基化）可以改善β-酪蛋白的乳化特性。在對β-酪蛋白進行糖基化時發(fā)現(xiàn)，多達6 個葡萄糖分子與1 個β-酪蛋白分子結(jié)合；糖基化后的β-酪蛋白比完整的β-酪蛋白產(chǎn)生更小的乳狀液滴，且形成乳液的穩(wěn)定性提高；對β-酪蛋白糖基化前后的二級結(jié)構進行分析發(fā)現(xiàn)，糖基化后β-酪蛋白的螺旋度降低，葡萄糖的摻入很可能導致吸附在疏水性聚合物表面/水界面后由α-螺旋形成β-轉(zhuǎn)角[24]。也有研究表明，適當?shù)拿附馓幚砜梢愿纳痞?酪蛋白的乳化特性。經(jīng)胰蛋白酶處理后，β-酪蛋白水解物在pH 4.0～7.5范圍內(nèi)的溶解度大大提高。在pH 1.5～3.5和pH 6.5～10.0范圍內(nèi)，β-酪蛋白水解液的乳化活性均高于β-酪蛋白，但其乳化穩(wěn)定性均低于原β-酪蛋白乳狀液[25]。

2.2 營養(yǎng)功能

β-酪蛋白富含人體必需氨基酸，是重要的氨基酸來源之一。除其本身作為營養(yǎng)物質(zhì)外，β-酪蛋白在乳汁中以膠束狀態(tài)將營養(yǎng)物質(zhì)，特別是不溶性礦物質(zhì)，如磷酸鈣，以一種容易攝入的懸浮液形式輸送給嬰兒，這種懸浮液滿足了嬰兒消化系統(tǒng)的特殊要求[26]。作為一種磷酸化蛋白質(zhì)，β-酪蛋白能參與礦物質(zhì)轉(zhuǎn)運，其磷酸化區(qū)域可與鈣離子結(jié)合，磷酸化程度越高，結(jié)合鈣離子的能力越強[27]。β-酪蛋白可促進鈣離子、磷離子以及其他二價陽離子，如鐵離子、鋅離子的吸收，對改善鈣、鐵、鋅等元素缺乏癥狀有積極效果[28-29]。β-酪蛋白在體內(nèi)水解產(chǎn)生低分子質(zhì)量的酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）后，金屬離子結(jié)合能力會進一步增強，CPPs已經(jīng)被證明可作為載體促進腸膜對鈣、磷、硒、鐵、鋅等離子的吸收，同時對提高機體免疫功能等也具有重要作用[30]。

2.3 分子伴侶活性

有研究發(fā)現(xiàn)，β-酪蛋白具有類似分子伴侶的功能活性。β-酪蛋白能夠通過與變性底物蛋白形成穩(wěn)定的復合物抑制胰島素、溶菌酶、醇脫氫酶和過氧化氫酶等底物蛋白的熱聚集和化學聚集，同時還發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白不僅能阻止底物蛋白的聚集，而且能溶解已經(jīng)形成的蛋白聚集體，β-酪蛋白顯示出比α-酪蛋白更高的分子伴侶樣活性，這可能是由于二者脯氨酸殘基的數(shù)量和疏水基的暴露程度不同[31]。

β-酪蛋白的天然結(jié)構對準確發(fā)揮其生物學功能很重要。還原態(tài)非酶糖基化能改變β-酪蛋白的結(jié)構和功能，當對β-酪蛋白進行葡萄糖修飾時，β-酪蛋白的伴侶活性會發(fā)生改變；由于乳汁本身具有較強的還原環(huán)境、含有大量還原糖，因此在體內(nèi)β-酪蛋白糖基化還原過程中很可能發(fā)生類似的結(jié)構和功能改變[32]。

2.4 生物活性肽

β-酪蛋白具有優(yōu)良的消化特性，在消化過程中，磷酸化β-酪蛋白被降解成多種具有生物活性的肽段，并能夠引起行為、消化代謝、激素、免疫、神經(jīng)和營養(yǎng)等多方面的應答[3]。近年來的許多研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過消化產(chǎn)生的β-酪蛋白肽段具有抗氧化性、抗菌抑菌性及免疫調(diào)節(jié)活性等多種功能。因此β-酪蛋白可被視為具有生物活性的不同肽的前體，這些肽在工藝過程中可以通過消化或酶解從蛋白質(zhì)中釋放出來[33]。王麟艷[34]以牛乳β-酪蛋白為原料，對其進行體外模擬消化，對獲得的消化產(chǎn)物進行功能評價，結(jié)果表明，與未經(jīng)過消化的β-酪蛋白相比，β-酪蛋白的胃蛋白酶、胰蛋白酶及復合酶消化產(chǎn)物均具有顯著的羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力和還原能力，且復合酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）消化產(chǎn)物的抗氧化能力比單酶消化產(chǎn)物的抗氧化能力強。β-casofein是一種乳源生物活性肽，又稱為β-酪蛋白肽（94～123），Bessette等[35]通過大鼠喂養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，β-casofein對消炎痛類藥物所致腸炎具有保護作用，其機制可能與保護杯狀細胞和促進創(chuàng)面愈合有關。A1型和B型β-酪蛋白能產(chǎn)生β-酪啡肽7，β-酪啡肽7是一種重要的乳源生物活性阿片肽，可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性阿片受體激動劑肽的生理反應，進而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞的生長[36]。

母乳中含有多種天然乳源生物活性肽，其中一類來源于β-酪蛋白的短鏈蛋白水解肽β-casomorphins，對新生嬰兒具有阿片樣作用、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和飽腹功能[37]。通過抑菌實驗發(fā)現(xiàn)，母乳來源的活性肽β-casein 15和β-casein 38對包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌在內(nèi)的多種常見致病菌均有明顯抑菌作用，由于新生嬰兒容易受到這些常見致病菌感染，因此β-casein 15和β-casein 38具有抗致病菌感染治療的臨床應用價值，可應用于預防嬰幼兒細菌感染[38-39]。母乳來源的活性肽β-casein 125能夠促進淋巴細胞增殖，可能對嬰幼兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育具有重要作用[40]。另外，還有一些來源于β-酪蛋白的活性肽被證明具有抗高血壓作用[41]。

3β-酪蛋白在嬰兒配方乳粉中的應用

目前，在蛋白質(zhì)方面，我國的嬰幼兒配方乳粉食品安全國家標準（GB 10765—2010《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》、GB 10767—2010《食品安全國家標準 較大嬰兒和幼兒配方食品》）僅規(guī)定了總蛋白質(zhì)含量以及乳清蛋白與酪蛋白的比例，而對蛋白質(zhì)中的其他成分沒有進一步規(guī)定。β-酪蛋白作為母乳蛋白質(zhì)中酪蛋白的最重要組分，在模擬嬰兒配方乳粉的蛋白質(zhì)組成方面發(fā)揮重要作用。由于牛乳β-酪蛋白與人乳β-酪蛋白的組成與結(jié)構具有較高相似性，因此向嬰兒配方乳粉中強化牛乳β-酪蛋白可以優(yōu)化嬰兒配方乳粉的蛋白質(zhì)組成和氨基酸比例，提升嬰兒配方乳粉的營養(yǎng)品質(zhì)。

β-酪蛋白或β-酪蛋白水解物可以應用于嬰兒配方乳粉中，并具有良好的營養(yǎng)效果[42]。van Dael等[43]在嬰兒配方乳粉中以β-酪蛋白替代酪蛋白，使嬰兒配方乳粉的蛋白質(zhì)及氨基酸組成模擬母乳的蛋白質(zhì)及氨基酸組成，大鼠喂養(yǎng)嬰兒配方乳粉實驗結(jié)果表明，用β-酪蛋白替代酪蛋白不會影響生長期大鼠攝入蛋白質(zhì)或礦物質(zhì)生物利用度，其營養(yǎng)效果類似于以α-乳清蛋白替代乳清蛋白，并且優(yōu)于蛋白質(zhì)來源為普通酪蛋白的配方。

現(xiàn)階段，β-酪蛋白在嬰兒配方乳粉中的應用主要為通過添加β-酪蛋白調(diào)整配方中蛋白質(zhì)組分的比例，以達到蛋白質(zhì)組分母乳化的目的。由于母乳中不僅含有β-酪蛋白，還存在多種天然乳源生物活性肽，因此先對β-酪蛋白進行定向酶解，以產(chǎn)生所需的生物活性肽，再對嬰兒配方乳粉進行生物活性肽的母乳化也許是未來嬰兒配方乳粉產(chǎn)品的研發(fā)方向。

4 結(jié) 語

β-酪蛋白作為母乳中的主要酪蛋白成分，具有多種重要的生理功能。通過比較人乳β-酪蛋白與牛乳β-酪蛋白的結(jié)構及特性差異，在以牛乳β-酪蛋白替代母乳β-酪蛋白的基礎上，進一步在活性肽水平上模擬母乳組成，使嬰幼兒配方乳粉中的生物活性肽水平接近母乳，能夠進一步滿足嬰兒對蛋白質(zhì)類營養(yǎng)的需求。